专利名称：未酰基化的生长素释放肽作为治疗代谢紊乱中的治疗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及未酰基化的生长素释放肽(ghrelin)片段和其类似物以及它们 的治疗用途。
背景
生长素释放肽是从胃中分离的肽，但也表达于许多其他组织，包括内分 泌胰腺。发现生长素释放肽为生长激素促分泌素受体la型(GHS-R)的天然配 体(参考文献i， 2)。丝氨酸3处的生长素释放肽酰基化是结合GHS-Rla必 需的，GHS-Rla介导GH释放活性，以及酰基化的生长素释放肽的食欲促进 作用。除了刺激GH分泌和调节其他垂体功能外，酰基化的生长素释放肽(AG) 发挥广泛的生物学作用，诸如食物摄入和能量平衡的中枢调节以及胰岛素分 泌和葡萄糖代谢的控制。已在多种内分泌和非内分泌、中枢的和外周的动物 和人类组织包括胰腺中检测到GHS-Rla表达。特别地，生长素释放肽和胰 岛素之间的联系似乎具有重大意义。已显示AG拥有高血糖致糖尿病效应； 生长素释放肽敲除小鼠展示增强的葡萄糖诱导的胰岛素释放，同时已显示胰 岛产生的生长素释放肽的阻断增强胰岛素分泌和防止大鼠中高脂肪饮食诱 导的葡萄糖不耐受。
已显示在内分泌胰腺中，生长素释放肽定位于a-细胞和(3-细胞以及新鉴 别的产生生长素释放肽的胰岛s-细胞，暗示了在调节(3-细胞命运和功能中的 作用(参考文献9， 22, 19)。 P-细胞的存活对于维持正常的葡萄糖代谢具有重 要作用，而p-细胞凋亡是1型和2型糖尿病二者中的关^t事件(参考文献16, 21)。
未酰基化的生长素释放肽(UAG)是生长素释放肽的主要循环形式，并且长期以来被认为是生物学上无活性的，因为它在生理浓度下不结合
GHS-Rla，从而缺乏GH-释放活性。现在知道UAG是生物活性肽，尤其是 在代谢水平，已特别显示其发挥抗-致糖尿病效应，如2005年4月14日公 布的美国专利申请序列第10/499,376号(公布号US 2005-0080007)中所述。 事实上UAG能够a)在人类中对抗AG的高血糖效应(参考文献6); b)通过 阻断基础的、胰高血糖素诱导的和酰基化的生长素释放肽刺激的葡萄糖从肝 细胞的输出而在肝水平直接调节葡萄糖代谢(参考文献3); c)在UAG转基因 动物中降低脂肪沉积、食物消耗和葡萄糖水平(参考文献7); d)在(3-细胞和 人类胰岛中刺激增殖和防止细胞死亡和凋亡(参考文献4)。
最近证明UAG在P-细胞和人类胰岛中能够刺激增殖和防止(IFN)-Y/肿瘤 坏死(TNF)-a协同作用诱导的细胞死亡和凋亡(参考文献4)。值得注意的是， 认为细胞因子协同作用是1型糖尿病中(3-细胞破坏以及2型糖尿病中P-细胞 损失的主要原因。此外，该工作还显示UAG刺激不表达GHS-Rla的(3-细胞 的葡萄糖诱导的胰岛素分泌。
总之，这些结果强调了 UAG在与代谢紊乱相关的医学病症(medical conditions)中的治疗潜能，所述医学病症诸如特征为胰岛素缺乏或为胰岛素 抵抗(insulin resistance)的病症，包括但不限于糖尿病，并且UAG对P-细月包 的效应是UAG在这些潜在应用中的作用机制之一。
最近，UAG的治疗潜能得到了临床证明，因为健康志愿者中的UAG连 续输注造成血糖降低、胰岛素敏感度改进、血液游离脂肪酸降低和降低的皮 质醇水平。
UAG是28个氨基酸的肽，并且优选地通过静脉内或皮下注射施用于患 者以产生其效应，这不是将药物施用于患者的方便途径。另外，此大小的肽
通常在施用后快速降解，并且静脉内、皮下或肌内弹丸注射施用(bolus administration)后它们的体内效力通常是差的。
此外，生产28个氨基酸的肽是费时而昂贵的过程，无论它是通过固相 肽合成还是通过重组技术生产。最后，用诸如UAG的长肽长期治疗患者可 带来对患者的免疫原性形式的安全风险。针对天然肽产生中和抗体对患者是 潜在的重大健康风险。
因此，高度期望鉴别将拥有与UAG相当的生物活性，但能够更容易和 成本更低地生产的大小更小的肽。甚至更为期望的是这些大小更小的肽与UAG相比将具有增加的生物效价。
这些大小更小的肽的另一优点是它们在长期和重复施用时将给患者带 来更小的免疫原性风险，因此展示更好的安全谱。无论施用路径如何，它们
可具有比UAG更好的生物利用度，并可适于更方便的施用路径，诸如但不 限于，透皮、肺部、鼻内或口服递送，或可构成设计具有更好的口服生物利 用度的肽类似物或模拟肽分子的起始材料。大小更小的肽还可与药物递送系 统诸如但不限于基于聚合物的储库制剂(depot foramlation)相容。
概述
在本发明的一个方面，提供包含SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列的任 何氨基酸片段或其类似物的分离的多肽，其中所述多肽具有选自由以下组成 的组的至少一种活性a)降低血糖水平；b)增加胰岛素分泌和/或胰岛素敏感 度；c)结合胰岛素分泌细胞；和d)促进胰岛素分泌细胞的存活。
在本发明的一个方面，提供长度为5至27个氨基酸残基的分离的多肽， 所述多肽包含氨基酸序列GIu-His-Gln-Arg-Val。
在本发明的另 一个方面，提供用于治疗患者中与葡萄糖代谢受损相关的 疾患的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的本文所述的多肽。
在本发明的另 一个方面，提供用于增强胰岛素分泌细胞的存活和/或增殖 的方法，所述方法包括在治疗有效量的本文所述的多肽的存在下i咅养所述细 胞。
在本发明的另 一个方面，提供治疗有效量的本文所述的多肽在制备用于 治疗患者中与葡萄糖代谢受损相关的疾患的药物中的用途。
在本发明的进一步的方面，提供治疗有效量的本文所述的多肽用于治疗 患者中与葡萄糖代谢受损相关的疾患的用途。
在本发明的进一 步的方面，提供用于治疗与葡萄糖代谢受损相关的代谢 紊乱的药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的本文所述的多肽。
在本发明的又进一步的方面，提供选自由以下组成的组的分离的多肽 SEQIDNO:12、 SEQIDNO:13、 SEQIDNO:14、 SEQIDNO:15、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 18、 SEQIDNO:21、 SEQ ID NO: 22、 SEQ ID NO: 23、 SEQ ID NO: 24、 SEQ ID NO: 25、 SEQ ID NO: 26、 SEQ IDNO: 27和SEQ ID NO: 28。
附图简述
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示片段的存在下，INS-IE P-细胞在无血清培养基中的存活。
图2说明了在TNF-a/IFN-y/IL-1卩存在下和在未酰基化的生长素释放肽 或未酰基化的生长素释放肽的所示片段存在下INS-IE (3-细胞的存活。
图3A和3B说明了 HIT-T15 J3-细胞在含或不含细胞因子和未酰基化的生 长素释放肽UAG(1-28)或其片段UAG(1-14)(图3A)或UAG (1-18)(图3B)的 无血清培养基中的存活。
图4A和4B说明了 HIT-T15 (3-细胞在含或不含细胞因子和未酰基化的生 长素释放肽UAG (l-28)或其片段UAG (1-5)(图4A)或UAG (17-28)(图4B) 的无血清培养基中的存活。
图5A和5B说明了细胞因子处理的HIT-T15 p-细胞在未酰基化的生长素 释》文肽片4殳UAG (6-13)、 UAG (8-13)、 UAG (8-12)、 UAG (1-14)、 UAG (1-18)、 UAG (1-28)(图5A)和UAG (8-11)、 UAG (9-12)和UAG (9-11)(图5B)存在下 的存活。
UAG (8-13)(图6B)和UAG (8-12)(图6C)对细胞因子处理的HIT-T15 (3-细胞
的4元凋亡岁丈应。
图7A和7B说明了未酰基化的生长素释放肽(l-28)和其片段UAG (1-14)、 UAG (1-18)(图7A)和UAG (l-5)和UAG (17-28)(图7B)对人类胰岛
的存活步文应。
图8A至8D说明了 UAG(1-14)(图8A)、UAG (1-18)(图8B)、UAG (1-28) (图8C)和毒蜥外泌肽(Exendin)-4 (图8D)对人类胰岛中的胰岛素分泌的影响。
图9A至9D说明了在链脲佐菌素(Streptozotocin， STZ)处理的动物中，未 酰基化的生长素释放肽片段UAG (6-13)对动物存活(图9A)、对血糖水平(图 9B)和血浆(图9C)和胰腺(图9D)胰岛素水平的体内效应。
图IOA和10B说明了未酰基化的生长素释放肽和未酰基化的生长素释 放肽片段UAG(6-13)与胰腺HIT-T15(图IOA)和INS-1E (
图10B) p-细胞受体 的结合。图IIA和11B说明了在不存在血清(图IIA)和存在细胞因子(图IIB)两 种情况下，具有位置6至13的丙氨酸(Ala)取代的UAG (6-13)对HIT-T15 (3-细月包的存活^文应。图UA和UB说明了在不存在血清(图UA)和存在细胞因子(图UB)两 种情况下，具有保守取代和N-末端修饰的UAG (6-13)对HIT-T15 (3-细胞的存活^文应。图13A和13B说明了在不存在血清(图13A)和存在细胞因子(图13B)两 种情况下，环化的UAG (6-13)对HIT-T15 (3-细胞的存活效应。图14A和14B说明了在与肥胖相关的糖尿病的动物模型ob/ob小鼠中 UAG(6-13)在治疗2和4周后对血糖水平的体内效应。图14A说明了餐后血 糖(fed plasma glucose)水平，而图14B说明了空腹血糖(fasting plasma glucose)。图15说明了在与肥胖相关的糖尿病的动物模型ob/ob小鼠中，用UAG 和UAG(6-13)治疗2和4周后的空腹胰岛素水平。图16说明了在与肥胖相关的糖尿病的动物模型ob/ob小鼠中，UAG和 UAG (6-13)对生殖腺脂肪(gonadal fat)的影响(为重量百分比)。详述除非另外指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域 的技术人员通常理解的含义相同的含义。UAG片段和其类似物为本发明目的，在下文定义了下列术语。在本申请中，术语"生长素释放肽(ghrelin)"和"酰基化的生长素释放肽" 或"AG，，可交换使用，并具有相同的含义。术语"未酰基化的生长素释放肽"或"UAG"意指含有SEQ ID NO: 1 (l-NH2Gly-Ser-Ser-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gln-Arg-Val-Gln-Gln-Arg-Lys-Gl u-Ser-Lys-Lys-Pro-Pro-Ala-Lys-Leu-Gln-Pro-Arg-28; SEQ ID NO: l)所指定的 氨基酸序列的肽。UAG还可被称为UAG (1-28)。酸的取代、添加或缺失的肽，其由于编码生长素释放肽或其等位基因的核苷酸序列的不连续变化或由于转录RNA的可变剪接造成。应理解，所述变化 不大致影响未酰基化的生长素释放肽变体的性质、药理学和生物学特性。这 些肽可以是以盐的形式。特别地，该分子的酸性功能可被其盐衍生物诸如但 不限于三氟乙酸盐所代替。如本文所用，SEQ ID NO: 9指由UAG (SEQ ID NO: l)的残基6至18组 成的氨基酸序列，即6-Ser-Pro-Glu-His-Gln-Arg-Val-Gln-Gln-Arg画Lys-Glu-Ser-18。"肽"、"多肽"或"蛋白质"意指氨基酸的任何链，与长度或翻译后修饰(如 糖基化或磷酸化)、或化学修饰、或含有非天然或不常见的氨基酸诸如D-Tyr、 鸟氨酸、氨基己二酸的那些无关。这些术语在本申请中可交换使用。术语"片段"或"其片段"指肽诸如未酰基化的生长素释放肽的氨基酸片 段。未酰基化的生长素释放肽的片段短于28个氨基酸残基。因此未酰基化 的生长素释放肽的片段可以是27、 26、 25、 24、 23、 22、 21、 20、 19、 18、 17、 16、 15、 14、 13、 12、 11、 10、 9、 8、 7、 6、 5或4个氨基酸残基的长 度。在本发明的一些方面，多肽以"纯化的"、"分离的"或"大致纯化的，，形式 使用。当多肽与天然伴随它们的组分分开时，它们即是"纯化的"、"分离的" 或"大致纯化的"。典型地，当化合物按重量计是样品中的总物质的至少60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%或99%时， 它就是大致纯化的。术语"未酰基化的生长素释放肽的类似物"、"未酰基化的生长素释放肽 的片段的类似物，，或"其类似物"指未酰基化的生长素释放肽或其片段的结构 和功能类似物两方面，所述类似物除了其它以外，能够在拮抗生长素释放肽 的外周作用或功能方面代替未酰基化的生长素释放肽，或能够代替未酰基化 的生长素释放肽的其他生物学作用，诸如但不限于在(3-细胞系中刺激增殖和 /或抑制凋亡，在人类中降低血糖水平、改进胰岛素敏感度和/或胰岛素分泌、 降低皮质醇水平、改进脂谱，并因此具有治疗代谢紊乱的潜在用途，所述代 谢紊乱诸如与例如胰岛素抵抗、胰岛素缺乏、血脂异常或皮质醇过量相关的 代谢紊乱。单纯的 ii-28 (SEQ ID NO: l)的一个同工型(isoform) des Gin-14生长素释放肽(拥有丝 氨酸3的正辛酸修饰的27个氨基酸的肽)存在于胃中。其在功能上与生长素 释放肽的相同之处在于，它以相似的结合亲和力结合于GHSR-la，引起克隆 细胞中的Ca"流，并以与生长素释放肽-28相似的效价诱导GH分泌。预期 UAG也具有与UAG功能相同的des Gin-14 UAG。优选的UAG类似物和优选的UAG片段类似物是与天然UAG序列或与 天然UAG片段序列的差异在于保守的氨基酸取代的那些；即，将残基取代 为具有相似特性的另一残基的那些。典型的取代包括Ala、 Val、 Leu和lie 之间；Ser和Thr之间；酸性残基Asp和Glu之间；Asn和Gin;石威性残基 Lys和Arg之间；以及芳香族残基Phe和Tyr之间的那些。特别优选的是其 中若干个，例如但不限于5-10、 1-5或1-2个氨基酸以任何组合被取代、缺 失或添加的类似物。例如，UAG的类似物在序列上可与UAG具有1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10个氨基酸取代(优选地保守的取代)、缺失或添加或 其任何组合的差异。本文提供在其全长上与本文所述的氨基酸序列具有至少50%、 55%、 60%、 65%、 70。/。、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%或99% 序列同源性，和共有UAG的代谢效应或生物活性中的至少一种的的本发明 的肽的类似物。本领域技术人员将容易鉴别未酰基化的生长素释放肽的类似 物序列或未酰基化的生长素释放肽的片段的类似物序列。在进一步的方面，UAG或其片段的类似物是例如通过丙氨酸扫描、通 过D-氨基酸或合成氨基酸取代或通过肽的环化获得的类似物。UAG或其片 段的类似物可包含非天然编码的氨基酸，其中所述非天然编码的氨基酸指不 是常见氨基酸之一或吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸的氨基酸，或指通过天然编 码的氨基酸(包括但不限于20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸) 的修饰(如翻译后修饰)发生但它们自身不被翻译复合体掺入正在生长的多肽 链的氨基酸。此类非天然发生的氨基酸的实例包括但不限于N-乙酰葡萄糖 胺基-L-丝氨酸、N-乙酰葡萄糖胺基-L-苏氨酸和O-磷酸酪氨酸。如本文所用，术语"修饰的"指对给定多肽进行的任何变化，诸如对多肽 的长度，多肽的氨基酸序列、化学结构、共翻译修饰或翻译后修饰的变化。术语"翻译后修饰，，指在天然或非天然氨基酸被掺入多肽链后发生于此 氨基酸的任何修饰。该术语包括，仅作为举例，共翻译体内修饰、共翻译体夕卜(in vitro)修饰(诸如在无细胞翻i奪系统中)、翻译后体内修饰和翻i奪后体外》务 饰。翻译后修饰的实例是但不限于，本发明肽的糖基化、乙酰化、酰基化、 酰胺化、羧化、磷酸化以及盐、酰胺或酯加成，特别是C-末端酯和N-酰基 衍生物。翻译后修饰的类型是公知的。根据本发明的某些肽还可以是环化形式，以使N-或C-末端直接或通过 插入接头(linker)部分头尾相连，此部分自身通常根据需要包含一个或多个氨 基酸残基，以便主链的连接方式避免相对于非环化形式改变所述肽的三维结于环化肽的方法是本领域公知的。环化可通过两个侧链官能团之间的二硫键形成、 一侧链官能团和主链a-氨基或羧基官能团(fonction)之间的酰胺或酯键形成、两个侧链官能团之间的 酰胺或酯键形成、或主链a-氨基和羧基官能团(fbnction)之间的酰胺键形成来 实现。这些环化反应传统地以高稀释度在溶液中进行。环化通常在肽连接于 树脂的情况下实现。在固体支持物上合成环状肽的最常见的方法之一是通过 将氨基酸的侧链连接至树脂。使用适当的保护策略，C-和N-末端可在链装 配后在树脂上选择性地脱保护和环化。此策略使用广泛，并与叔丁氧羰基 (Boc)或9-芴曱氧羰基(Fmoc)方案相容。然而，它限制于含有适当的侧链官 能性以连接至固体支持物的肽。许多方法可用于实现环状肽的有效合成。用 于合成环状肽的一个程序是基于同时从树脂上断裂的环化。通过固相合成将 适当的肽序列装配于树脂上或将线性序列悬挂于树脂上之后，脱保护的氨基 基团可与其锚定的活性键合(linkage)反应，以产生保护的环状肽。 一般而言， 需要最后的脱保护步骤以产生靶环状肽。用于合成环状肽的程序是本领域公 知的。例如，可执行一种环化形式内酰胺化(lactamazation)，以使用Fmoc合成 形成内酰胺桥，可引入在侧链具有不同保护基团的氨基酸，诸如但不限于， 在(3 S旨(或对于谷氨酸，y酯)以烯丙基酯保护的天冬氨酸(或谷氨酸)和在N-s 以烯丙基氧氨基曱酸酯保护的赖氨酸。在合成结束时，如果肽的N-末端以 Fmoc、 Boc或不同于Alloc (烯丙基氧氨基甲酸酉旨)的其他保护基团保护，天 冬氨酸和赖氨酸的烯丙基和alloc保护基团可用例如钇(O)脱保护，然后使用 PyAOP (7-氮杂苯并三唑-l-基氧基三(吡咯烷)磷镎-六氟磷酸酉旨)环化以产生 内酰胺桥。除非另外指明，本文所称的氨基酸指L-形式。将使用本领域公认的缩写来描述氨基酸，包括左旋氨基酸(L-氨基酸或L或L-形式)和右旋氨基酸(D-氨基酸或D或D-形式)、丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn 或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酸(Glu或E)、谷氨 酰胺(Gln或Q)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或1)、 亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、曱硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe 或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp 或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和缬氨酸(Val或V)。天然肽序列内的L-氨基酸残基 可改为蛋白质中常见的20种L-氨基酸的任何一种、或、对应的D-氨基酸的 任何一种、稀有氨基酸(诸如但不限于、4-羟基脯氨酸或羟基赖氨酸)或非蛋 白质氨基酸(诸如P-丙氨酸或高丝氨酸)。保留UAG生物活性的UAG或其片段或任何其他修饰的UAG或其片段 的任何其他类似物均包括于本发明中。用于提供UAG或其片段的功能和结构类似物的一般方法和合成策略是 本领域通常使用和公知的，并描述于出版物诸如"Peptide synthesis protocols，，(肽合成方案)，M. W. Pennigton & B. M. Dunn编，Methods in Molecular Biology(分子生物学方法).第35巻Humana Press, NJ.， 1994。术语"同源性"指在保持相等的生物活性的同时，两个肽之间的序列相似 性。同源性可通过比较被比对序列中的每个位置来确定。氨基酸序列之间的 同源性程度是在所述序列共有的位置上相同或匹配氨基酸的数量的函数，所 以"同源序列，，指共有同源性和相等功能或生物活性的序列。同源性百分比的 评估是本领域技术人员已知的。确定肽的同一性和相似性的方法已编码于可公开获得的计算机程序中。 确定两个序列之间的同 一性和相似性的优选计算机程序方法包括但不限于 GCG程序包、BLASTP、 BLASTN和FASTA。 BLAST X程序可从NCBI和 其他来源公开获得。公知的Smith Waterman算法也可用于确定同一性。多肽序列比较的优选参数包括算法Needleman和Wunsch， J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970); 比專交矩阵Hentikoff和Hentikoff， Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992)的BLOSSUM62; 缺口罚分12;缺口长度罚分4。<吏用这些参#:的程序是可/人Genetics Computer Group, Madison, Wis 公开获得的"gap，，程序。前述参数是用于氨基酸序列比较的默认参数(连同末 端缺口没有罚分)。
本发明的多肽可以本领域已知的任何合适方式制备。此类多肽包括分离 的天然发生的多肽、重组产生的多肽、合成产生的多肽或通过这些方法的组 合产生的多肽。制备此类多肽的手段和方法是本领域公知的。
本发明的某些多肽使用UAG多核苷酸。这些包括编码本申请所述的 UAG多肽、片段和类似物的分离的多核苦酸。
如本文所用，术语"多核苷酸"指包含多个脱氧核糖核香酸或核苷亚基的 分子。核香亚基之间的连接可通过磷酸酯、膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸 酯或类似连接或通过本领域已知的非磷酸酯基团提供，诸如肽核酸(PNA)中 利用的类肽型连接。连接基团可以是手性的或非手性的。寡核苷酸或多核苦 酸的长度可从2个核苷亚基至数百或数千核苷亚基不等。寡核苷酸优选地为 5至100个亚基的长度，且更优选地为5至60个亚基的长度，而多核苦酸的 长度可以大很多(如多至100个)。多核苷酸可以是DNA和RNA的任一种。 所述DNA可以是以基因组DNA、基因组DNA文库、衍生自细胞或组织的 cDNA和合成DNA的任何形式。此外，在某些方面，本发明可使用载体， 其包括噬菌体、质粒、粘粒或噬菌粒。-UAG竟争 HIT-T15(图10A)和INS-1E(图10B)结合位点的能力。如图10A和10B所示， 未标记的UAG (l-28)和UAG (6-13)以相似的效力并以浓度依赖性方式与 [125I-Tyr4]-UAG竟争两种细胞系中的此类结合位点。在HIT-T15和INS-1E中，根据竟争结合曲线计算的ICso值(全部表示为nM浓度)分别为2.6 ± 0.5 和2.0士0.2(对于UAG (1-28)),以及3.8 ± 0.3和2.4 ± 0.3(对于UAG (6-13))。
具有丙氨酸取代的UAG片段对HIT-T15 (3-细胞的存活效应
测试了在不同氨基酸位置(6至13)具有丙氨酸(Ala)取代的UAG片段对 HIT-T15仓鼠P-细胞的存活效应。所述细力包在血清剥夺培养基(单独或含 IFNPy/TNF-o/IL-l(3)中培养。所述肽在1 nM至100 nM浓度下测试。在无血 清时的存活率比有血清时降4氐=40%的这种无血清条件下，如所预期的，UAG (6-13)显著增加细胞存活(在1和100nM下分别为=18%和-30%)。 Ala6-UAG (6-13)、 Ala 7-UAG (6-13)、 Ala 8-UAG (6-13)、 Ala 9-UAG (6-13)并且特别是 八la 12-UAG (6-13)和Ala 13-UAG (6-13)在两种浓度下显示相似的效应。相 反，位置10和11处的Ala取代展示非常低的存活效应(图IIA)。在有细胞 因子处理时的细胞存活比血清饥饿条件时降低-18%的这种细胞因子处理 下，除了位置10和11处的取代之外，所有Ala取代在1 nM和100 nM两种 浓度下完全逆转了细胞死亡并使存活率达到甚至高于无血清条件下的水平。 这些效应与原始肽UAG (6-13)引起的效应相似(图IIB)。 UAG(6-13)的位置 6至9和12至13处的Ala取代未影响肽存活效应，而位置10 (Q)和11 (R) 处的氨基酸的侧链看来是必需的。
具有保守取代和N-末端修饰的UAG片段对HIT-T15 [3-细胞的存活效应
在无血清时的存活率比有血清时降低-35%的这种无血清条件下> 如所 预期的，UAG (6-13)显著增加细胞存活(在1 nM和100 nM下分别为=18%和 -30%)。 Asp 8-UAG (6-13)、 Lys ll画UAG (6-13)、 Gly 6-UAG (6-13)以及AcSer 6-UAG (6-13)和AcSer 6-(D) Pro 7-UAG (6-13)在两种浓度下显示相似的效应 (图12A)。在有细胞因子处理时的细胞存活被降低-20%的这种细胞因子处理 下，所有肽显著增加细胞存活。尤其是，最佳效应由Gly 6-UAG(6-13)发挥， 而使用AcSer 6-UAG (6-13)、 AcSer 6- (D) Pro 7-UAG (6-13)(图12B)观察到 最低的效应。
环化的UAG片段对tflT-T15 f3-细胞的存活效应
在无血清时的存活率比有血清时降低=58%的这种无血清条件下，如所预期的，UAG (6-13)显著增加细胞存活(在1 nM和100 nM下分别为^160/。 和-60%)。环6,13 UAG (6-13)、环(8，U),乙酰基-Ser6, Lysll, UAG ( 6-13)酰胺 和乙酰基-Ser6, Lysll, UAG (6-13)丽2显示相似的效应(图13A)。在用细胞 因子处理下发现了相似的结果(图13B)。
材料和技术方案
人类UAG和UAG片段(1-14)、 (1-18)、 (l-5)和(17-28)以及毒蜥外泌肽-4 来自Phoenix Pharmaceuticals (Belmont， CA)。其他片#殳(6-13)、 (8-13)、 (8-12)、 (8-11)、 (9-12)、 (9-ll)来自TibMoffiiol(Genova， Italy)。细胞培养试剂来自 Invitrogen (Milano, Italy)。具有丙氨酸(Ala)的人UAG (6-13)， Ala 6-UAG (6-13)、 Ala 7-UAG (6-13)、 Ala 8-UAG (6-13)、 Ala 9-UAG (6-13)、 Ala 10-UAG (6-13)、 Ala ll陽UAG (6-13)、 Ala 12-UAG (6-13)和Ala 13-UAG (6-13)由Tib Mo旧iol (Genova, Italy)合成。
本文详细说明的大多数肽是依靠同时多重肽合成(simultaneous multiple peptide synthesis)在下列仪器上合成的PSSM-8， SHIMADZU， Japan,使用 Fmoc/But(G. Schnorrenberg等人.Tetrahedron， 45:7759, 1989)，由SHEPPARD (W. C. Chan等人，Fmoc solid phase peptide synthesis - A practical approach (Fmoc固相肽合成实用方法)，IRLPress, Oxford, 1989)策化。偶联使用3-6 当量的Fmoc-氨基酸/HOBt/TBTU和6-12当量的N-曱基吗啉在Tentagel HL RAM树脂上执行。所述肽通过HPLC仪器SHIMADZU LC-8A纯化。将所 述肽脱保护，并通过TFA/水从树脂上切下，依靠MALDI 2 DE仪器通过 MALDI-TOF表征。最后将所述肽以TFA盐的形式冻干。
勿應絲-仓鼠HIT-T15胰岛素-分泌型(3-细胞的获得和培养如所述进 行(参考文献14,4)。 INS-IE大鼠卩-细胞由Claes B. Wollheim教授(University Medical Center, Geneva, Switzerland)慷慨提供并如所述地培养(参考文献14, 4)。细胞培养试剂来自Invitrogen (Milano， Italy)。细胞因子来自Biosource (Invitrogen ， Italy)。
入类凝^的为、專-人类胰岛如所述地从多器官供体的胰腺获得(参考文 献4)。纯度>70%的不适合移植的胰岛制品由European Consortium for Islet Transpkntation(ECIT)"Islets for Research Distribution Program", —Transplant Unit, Scientific Institute San Raffaele， Vita-Salute University, Milan提供。胰岛(IO，OOO)在含10%FBS的CMRL(Invitrogen)中培养。
勿應存承縱-细胞存活通过3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5 二苯基四唑 溴化物(MTT)如先前所迷地评估(参考文献4)。细胞以5xl03细胞/孔的密度接 种于96孔板。处理后，细胞与1 mg/ml MTT孵育-1 h。抽吸培养基，并以 lOOiilDMSO溶解曱臜(formazan)产物。活力通过使用96-孔板读取仪以分光 光度测定570 nm吸光度来评估。
應4素为、必-在于含有0.5。/。BSA和1.25 mM葡萄糖的HEPES-緩冲的 克雷布-林格氏碳酸氪盐緩冲液(Krebs-Ringer bicarbonate buffer, KRBH)中在 37。C下孵育1 h之前，将HIT-T15细胞以5xl()S细胞密度铺板于100-mm皿 中并血清饥饿24h。更换培养基，并将细胞在含有1.25、 7.5或15mM葡萄 糖的KRBH/0.5% BSA中再次孵育1 h。酸乙醇提取激素后，分泌的胰岛素 通过方文射免疫测定i式剂盒(Linco Research, Labodia, Yens, Switzerland)定量， 其识别人类胰岛素并与大鼠胰岛素交叉反应。
动教-怀孕的雌性Sprague-Dawley大鼠(n=10，怀孕第14-15天)购自 Harlan Sri (Italy),笼养，允许自由进水，并以标准颗粒大鼠铜料喂食。自然 分娩在6-7天后发生。研究了五个实验组l)对照组，其中新生大鼠接受柠 檬酸盐緩沖液(0.05 mmol/l， pH 4.5)的单次腹腔注射；2)STZ组，其在出生 第1天接受新鲜溶解于柠檬酸盐缓沖液的STZ(100mg/Kg体重)的单次腹腔 注射；3) STZ+UAG组，其在出生后接受STZ的单次腹腔注射然后是UAG(30 nmol/kg皮下，每天两次)的注射共7天(第2至8天)；4) STZ+UAG (6-13)组， 其在出生后接受STZ的单次腹腔注射然后是UAG (6-13) (30 nmol/kg皮下， 每天两次)的注射共7天(第2至8天)；5) STZ+UAG (6-13)组，其在出生后 接受STZ的单次腹腔注射然后是UAG (6-13)(100 nmol/kg皮下，每天两次) 的注射共7天(第2至8天)。将母畜随机分配至所述五个组，同窝的幼畜分 配至同一组。四组中各组的母畜数是11 (对照)、ll(STZ)、 16(STZ+UAG)和 21 (STZ+ UAG (6-13), 30 nmol/kg)和15 (STZ+ UAG (6-13)， 100 nmol/kg)。 使幼畜与其母亲在一起。所有新生大鼠在第2天使用Accu-chek compact plus (Roche)测试糖尿。仅那些在出生后第2天有糖尿的动物被归于STZ组。确 认有糖尿之后，开始用UAG和UAG (6-13)治疗。动物在出生后第70天通 过斩首被杀死。斩首后采集血样，并立即在4。C20,000xg离心2 min，然后 在-2(TC贮存直至测定。图14A、 14B、 15和16中的实'验数据是用获自Charles River Laboratories (Maastricht, The Netherlands)的动物得到的。动物(B6.V-Lep力J, Charles River Laboratories, Belgian colony)于8周龄时接纳到我们的动物室，并在治疗开 始前在分开的笼中适应2周。它们被保持在标准的12:12 h光:暗条件，21°C 下，并允许自由进食和进水。每天进行训练以使它们习惯采血方法。所述肽 溶解于无菌、无热原的0.9。/。盐水(BaxterBV, Utrecht, The Netherlands)。 D-葡萄糖获自Sigma-Aldrich Chemie BV (Zwijndrecht， The Netherlands),并以 400 mg/ml溶解于0.9%盐水。Alzet泵(型号1004)获自Charles River Laboratories (Maastricht, The Netherlands)。泵在无菌条件下注满0.9%盐水、 UAG或UAG (6-13)溶液，并在37。C下于0.9%盐水中预孵育至少48小时以 启动流动。血糖水平直接从尾静脉切口处测量，使用自由式微型血糖仪和试 纸(ART05214Rev. A; Abbot, Amersfoort, The Netherlands)。血浆胰岛素水 平通过超灵敏的小鼠胰岛素ELISA(目录号10-1150-10; Mercodia， Sweden) 测定。
腐潔~#厲和义理-切除术后，取出胰腺并称重。对于胰岛素含量确定， 胰腺(35-50 mg)于5 ml酸-乙醇(0.15 mol/1 HC1于75% [体积/体积]乙醇中)中 匀浆并在l，OOOg离心20min;上清液在-8(TC储存。对于免疫组织化学，将 另外的胰腺于4%低聚曱醛(paraformaldehyde)固定液中固定24h并在石蜡中包埋。
为、浙W -血糖水平使用葡萄糖分析仪确定。胰岛素如先前所述地通 过RIA从胰腺或从血浆测量(参考文献15)。
潜合豸定-制备仓鼠HIT-T15和大鼠INS-1E胰腺卩-细胞的膜并测定 [125I-Tyr4]-UAG结合的存在。如先前所述地评估UAG片段与放射性配体竟 争此类结合位点的能力(参考文献4)。数据表示为三次独立实验的平均值 ±S.E.M.。
魏 ',为、浙-结果表示为平均值士SE。统计分析使用Student t检验或单 向ANOVA执行。P<0.05时建立显著性。
应理解，本说明书报道的数据的提供仅是为了说明本发明，而不应视为 构成其限制因素。
虽然已联系本发明的具体实施方案对其进行了描述，但是应理解其能够 进行进一步修饰，并且本申请意于涵盖本发明的任何变化、用途或修改，所述变化、用途或修改一般依据本发明的原理并包括对本公开内容的变更，所 述变更诸如本发明所属的领域内已知或惯例的做法，诸如可以应用于上文列 举的必要特征，以及诸如依据所附权利要求的范围。
以上说明书中提及的所有公布的文献通过引用并入本文。
参考文献
1. Kojima M, Hosoda H, Date Y， Nakazato M, Matsuo H, Kangawa K; (1999) Ghrein is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach(生长素释放肽是来自胃的释放生 长激素的酰基化肽).Nature 402:656-660.
2. van der Lely AJ, Tschop M, Heiman ML, Ghigo E; (2004) Biological, physiological, pathophysiological, and pharmacological aspects of ghrelin(生长素释放肽的生物学、生理学、 病理学和药理学方面).Endocr Rev 25:426-457.
3. Gauna C， Delhanty PJ, Hofland LJ, Janssen JA, Broglio F, Ross RJ, Ghigo E, van der Lcly AJ; (2005) Ghrelin stimulates, whereas des-octanoyl ghrelin inhibits, glucose output by primaryhepatocytes(生长素释放肽刺激，而去辛酰基的生长素释放肽抑制> 原代肝细胞的 葡萄糖输出).J Clin Endocrinol Metab 90:1055-1060.
4. Granata R, Settanni F, Biancone L, Trovato L， Nano R， Bertuzzi F, Destefanis S, Annunziata M, Martinetti M, Catapano F, Ghe C， Isgaard J, Papotti M， Ghigo E, Muccioli G; (2007) Acylated and unacylated ghrelin promote proliferation and inhibit apoptosis of pancreatic P cells and human islets involvement of CAMP/PKA, ERKl/2 and PI3K/AKT signaling(酰基化的和未酰基化的生长素释放肽促进参与CAMP/PKA、 ERKl/2和 PI3K/AKT信令的胰腺P细胞和人类胰岛的增殖并抑制其凋亡).Endocrinology 148:512-529.
5. Merglen A, Theander S, Rubi B, Chaffard G， Wollheim CB, Maechler P.; (2004) Glucose sensitivity and metabolism-secretion coupling s加died during two-year continuous culture in INS-IE insulinoma cells(INS-lE胰岛素瘤细胞两年的连续培养过程中研究的葡 萄糖敏感度和代谢分泌的偶联).Endocrinology 145:667-678.
6. Broglio F, Gottero C, Prodam F, Gauna C, Muccioli G, Papotti M, Abribat T, Van Der Lely AJ, Ghigo E; (2004) Non- acylated ghrelin counteracts the metabolic but not the neuroendocrine response to acylated ghrelin in humans(未醜基4匕的生长素释i欠狀乂十4元人类 中酰基化的生长素释放肽的代谢应答但不对抗神经内分泌应答).J Clin Endocrinol Metab 89:3062-3065.
7. Asakawa A, Inui A, Fujimiya M等人；(2005) Stomach regulates energy balance via acylated ghrelin and desa5yl glir—elin(胃经由酰基化的生长素释放肽和去酰基生长素释放肽 调节能量平衡).Gut 54:18-24.8. Baldanzi G, Filigheddu N, Cutrupi S， Catapano F， Bonissoni S, Fubini A， Malan D, Baj G, Granata R, Broglio F, Papotti M, Surico N, Bussolino F, Isgaard J, Deghenghi R, Sinigaglia F, Prat M, Muccioli G, Ghigo E, Graziani A; (2002) Ghrelin and des-acyl ghrelin inhibit cel
death in cardiomyocytes and endothelial cells through ERK1/2 and PI 3-kinase/AK丁(生长素 释放肽和去酰基生长素释放肽通过ERK1/2和PI 3-激酶AKT抑制心肌细胞和内皮细胞中 的细胞死亡).J Cell Bio159:1029-1037.
9. Date Y, Nakazato M, Hashiguchi S， Dezaki K, Mondal MS, Hosoda H, Kojima M, Kangawa K, Arima T, Matsuo H， Yada T， Matsukura S; (2002) Ghrelin is present in pancreatic alpha-ceils of humans and rats and stimulates insulin secretion(生长素释放肽存在于人类和 大鼠的胰腺a-细胞并刺激胰岛素分泌).Diabetes 51:124-129.
10. Delhanty PJ, van Koetsveld PM, Gauna C， van de Zande B， Vitale Q Hofland LJ, van dcr Lely AJ; (2007) Ghrelin and its unacylated isoform stimulate the growth of adrenocortical tumor cells via an anti-apoptotic pathway(生长素释放肽和其未酰基化的同工型经由抗凋亡 途径刺激肾上腺皮质肿瘤细胞的生长).Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 :E302-309.
11. Dezaki K, Kakei M, Yada T; (2007) Ghrelin uses Galphai2 and activates voltage-dependent K+ channels to attenuate glucose-induced Ca2+ signaling and insulin release in islet beta-cells: novesignal transduction of ghrelin(生长素释放肽使用Galphai2并 激活电压依赖性K+通道以减弱胰岛p-细胞中葡萄糖诱导的Ca2+信令和胰岛素释放生 长素释放肽的新的信号转导).Diabetes. 56:2319-2327.
12. Filigheddu N, Gnocchi VF, Coscia M， Cappelli M, Porporato PE, Taulli R， Traini S， Baldanzi G, Chianale F, Cutrupi S, Arnoletti E, Gh6 C, Fubini A, Surico N， Sinigaglia F, Ponzetto C, Muccioli G, Crepaldi T， Graziani A; (2007) Ghrelin and des-acyl ghrelin promote differentiation and fosion of C2C12 skeletal muscle cells(生长素释放肽和去酰基生长素释放 肽促进C2C12骨骼肌细胞的分化和融合).Mol Biol Cell. 18:986-994.
13. Gauna C, Kiewiet RM， Janssen JA, van de Zande B, Delhanty PJ, Ghigo E, Hofland LJ, Themmen AP, van der Lely AJ; (2007) Unacylated ghrelin acts as a potent insulin secretagogue in glucose-stimuated conditions(未酰基化的生长素释放肽在葡萄糖刺激条件 下充当有效的胰岛素促分泌素).Am J Physiol Endocrinol Metab 293:E697-704.
14. Granata R， Settanni F， Trovato L, Destefanis S, Gallo D, Martinetti M, Ghigo E， Muccioli G; (2006) Unacylated as well as acylated ghrelin promotes cell survival and inhibit ap叩tosis in HIT-T15 pancreatic beta-cells(未酰基化的以及酰基化的生长素释放肽在 HIT-T15胰腺)3-细胞中促进细胞存活并抑制凋亡).J Endocrinol Invest 29:RC19-22.
15. Granata R， Settanni F, Gallo D， Trovato L, Biancone L, Cantaluppi V, Nano R, An加nziata M, Campiglia P, Arnoletti E, C, Volante M, Papotti M, Muccioli G, Ghigo E; (2008) Obestatin promotes survival of pancreatic卩-cells and human islets and induces expression of genes involved in the regulation of -cell mass and function(月巴胖"l中制素促进月爽腺P-细胞和人类胰岛的存活并诱导参与调节细胞质量和功能的基因的表达).Diabetes 57:967-79.
16. Mandrup-Poulsen T; (2001) beta-cell apoptosis: stimuli and signaling((3-纟田月包凋亡刺 激信号和信令).Diabetes 50:S58-63.
17. Muccioli G, Pons N, Gh6 C, Catapano F, Granata R, Ghigo E; (2004) Ghrelin and des-acyl ghrelin both inhibit isoproterenol-induced lipolysis in rat adipocytes via a non-type la growth hormone secretagogue receptor(生长素释放肽和去酰基生长素释放肽二者均经由非 la型生长激素促分泌素受体抑制大鼠脂肪细胞中异丙基肾上腺素诱导的脂肪分解).Eur J Pharmacol 498:27-35.
18. Park S, Dong X, Fisher TL, D画S, Omer AK, Weir G, White MF; (2006) Exendin-4 uses Irs2 signaling to mediate pancreatic beta cell growth and function(毒浙夕卜〉必肽-4l"吏用Irs2 信令介导胰腺卩细胞生长和功能).J5/o/C/zem 281:1159-1168.
19. Prado CL, Pugh-Bernard AE, Elghazi L, Sosa-Pineda B， Sussel L; (2004) Ghrelin cells replace insulin-producing beta cells in two mouse models of pancreas development(在两 种胰腺发育小鼠模型中，生长素释放肽细胞取代产生胰岛素的卩细胞).Proc Natl Acad Sci USA 101:2924-2929.
20. Santerre RF, Cook RA, Crisel RM， Sharp JD, Schmidt RJ, Williams DC, Wilson CP; (1981) Insulin synthesis in a clonal cell line of simian virus 40-transformed hamster pancreatic beta cells(猿猴病毒40转化的仓鼠胰腺|3细胞的克隆细胞系中的胰岛素合成).Proc Natl Acad Sci USA 78:4339-4343.
21. Wajchenberg BL; (2007) beta-cell failure in diabetes and preservation by clinical treatment(糖尿病中的p-细胞功能失调和通过临床治疗的维护).Endocr Rev. 28:187-218.
22. Wierup N, Svensson H, Mulder H, Sundler F; (2002) The ghrelin cell : a novel developmentally regulated islet cell in the human pancreas(生长素释方文肽纟田胞人类胰腺中 的新的发育调节的胰岛细胞).Regul Pept 107:63-69.
23. Zhang JV, Ren PG, Avsian-Kretchmer O, Luo CW, Rauch R, Klein C, Hsueh AJ;
(2005) Obestatin, a peptide encoded by the ghrelin gene, opposes ghrelin's effects on food intake(肥胖抑制素， 一种由生长素释放肽基因编码的肽，对抗生长素释放肽对食物摄入 的效应).Science 310:996-999.
24. Irako T, Akamizu T, Hosoda H, Iwakura H, Ariyasu H, Tojo K， Tajima N， Kangawa K;
(2006) Ghrelin prevents development of diabetes at adult age in streptozotocin-treated newborn rats(生长素释放肽在链脲佐菌素处理的新生大鼠中预防成年期糖尿病的发展), Diabetologia 49:1264-1273.
25. Portha B, Levacher C, Picon L, Rosselin G.; (1974) Diabetogenic effect of streptozotocin in the rat during the perinatal periodCfi脲佐菌素在围产期对大鼠的致糖尿病 效应).Diabetes 23:889-895.26. Tourrel C, Bailb6 D, Meile MJ, Kergoat M, Portha B; (2001) Glucagon-like peptide-l and exendin-4 stimulate beta-cell neogenesis in streptozotocin-treated newborn rats resulting in persistently improved glucose homeostasis at adult age(胰高血糖素样狀-l和毒晰夕卜泌肽-4刺 激链脲佐菌素处理的新生大鼠中的p-细胞新生，造成成年期持续改善的葡萄糖稳态). Diabetes 50:1562-1570.
27. Menahan LA; (1983) Age-related changes in lipid and carbohydrate metabolism of the genetically obese mouse(遗传性肥胖小鼠中脂质代谢和糖类代谢的年龄相关变化). Metabolism 32:172-178.
28. Hayashi T, Boyko EJ, McNeely MJ, Leonetti DL， Kahn SE, Fujimoto WY; (2008) Visceral Adiposity, not Abdominal Subcutaneous Fat Area, Is Associated with an Increase in Future Insulin Resistance in Japanese Americans(内脏刀巴胖，而不是腹部皮下脂肪面积，与 曰裔美国人未来胰岛素抵抗的增加有关).Diabetes May; 57(5): 1269-75. Epub 2008 Feb 25.
29. Hamdy O， Porramatikul S， Al-Ozairi E; (2006) Metabolic obesity: the paradox between visceral and subcutaneous fat(代谢性肥胖内脏脂肪和皮下脂肪之间的悖论).Curr Diabetes Rev 2:367-373.
权利要求
1.一种分离的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO9所示的氨基酸序列的任何氨基酸片段或其类似物，其中所述多肽具有选自由以下组成的组的至少一种活性a)降低血糖水平；b)增加胰岛素分泌和/或胰岛素敏感度；c)结合胰岛素分泌细胞；和d)促进胰岛素分泌细胞的存活。
2. 根据权利要求1所述的分离的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO: 9所示的氨基酸序列的任何氨基酸片段或其类似物，所述片段包括至少SEQ II) NO: 8所示的氨基酸残基或其类似物。
3. 根据权利要求1所述的分离的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO: 9所示的氨基酸序列的任何氨基酸片段或其类似物，所述片段包括至少SEQ ID NO: 6所示的氨基酸残基或其类似物。
4. 根据权利要求1所述的分离的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO: 9所示的氨基S吏序列的至少6个氨基酸残基的任何氨基酸片段或其类似物， 所述片段包括至少SEQ ID NO: 8所示的氨基酸残基或其类似物。
5. 根据权利要求1所述的分离的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO: 9所示的氨基酸序列的至少8个氨基酸残基的任何氨基酸片段或其类似物， 所述片段包括至少SEQ ID NO: 8所示的氨基酸残基或其类似物。
6. 根据权利要求1所述的分离的多肽，所述多肽由SEQIDNO:9所示 的氨基酸序列的任何连续的5个氨基酸残基组成。
7. 根据权利要求1所述的分离的多肽，其中所述片段具有选自由SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8组成的组的氨基酸序列。
8. —种分离的多肽，所述多肽的长度为5至27个氨基酸残基，所述多 肽包含氨基酸序列Glu-His-Gln-Arg-Val。
9. 根据权利要求8所述的分离的多肽，其中所述氨基酸序列任选地在 选自氨基酸残基Glu、 His和Val组成的组的位置含有最多两个保守的氨基酸 取代。
10. —种用于治疗患者中与葡萄糖代谢受损相关的疾患的方法，所述方 法包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求1至9的任一项所述的多肽。
11. 根据权利要求IO所述的方法，其中所述疾患是糖尿病。
12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述糖尿病是1型糖尿病。
13. 根据权利要求11所述的方法，其中所述糖尿病是2型糖尿病。
14. 根据权利要求10所述的方法，其中所述疾患是与胰岛素缺乏相关 的医学病症。
15. 根据权利要求10所述的方法，其中所述疾患是与胰岛素抵抗相关 的医学病症。
16. 根据权利要求10所述的方法，其中所述疾患是与血脂异常相关的 医学病症。
17. 根据权利要求10所述的方法，其中所述疾患是与肥胖相关的医学 病症。
18. 根据权利要求10所述的方法，其中所述疾患是与代谢综合征有关 的医学病症。
19. 根据权利要求IO所述的方法，其用于治疗胰腺P-细胞。
20. 根据权利要求19所述的方法，其中所述治疗是通过增强所述胰腺(3-细胞的增殖或存活来进行。
21. 根据权利要求20所述的方法，其中增强所述增殖或存活是在将所 述胰腺(3-细胞作为移植物施用于患者之前，通过在体外使所述细胞接触所述 多肽而实现的。
22. —种用于增强胰岛素分泌细胞的存活和/或增殖的方法，所述方法包 括在治疗有效量的权利要求1至9的任一项所述的多肽存在下培养所述细胞。
23. 根据权利要求10至20的任一项所述的方法，其中所述多肽通过选 自由以下组成的组的路径施用静脉内、皮下、透皮、口服、经颊、舌下、经鼻递送和吸入。
24. 根据权利要求10至20的任一项所述的方法，其中所述多肽以约0.01 jiig/kg至约10 mg/kg的剂量施用。
25. 治疗有效量的权利要求1至9的任一项所述的多.肽在制备用于治疗 患者中与葡萄糖代谢受损相关的疾患的药物中的用途。
26. 治疗有效量的权利要求1至9的任一项所述的多肽用于治疗患者中 与葡萄糖代谢受损相关的疾患的用途。
27. 根据权利要求25或26所述的用途，其中所述疾患是糖尿病。
28. 根据权利要求27所述的用途，其中所述糖尿病是1型糖尿病。
29. 根据权利要求27所述的用途，其中所述糖尿病是2型糖尿病。
30. 根据权利要求25或26所述的用途，其中所述疾患是与胰岛素缺乏 相关的医学病症。
31. 根据权利要求25或26所述的用途，其中所述疾患是与胰岛素抵抗 相关的医学病症。
32. 根据权利要求25或26所述的用途，其中所述疾患是与血脂异常相 关的医学病症。
33. 根据权利要求25或26所述的用途，其中所述疾患是与肥胖相关的医学病症。
34. 根据权利要求25或26所述的用途，其中所述疾患是与代谢综合征 有关的医学病症。
35. 根据权利要求25或26所述的用途，所述用途是用于治疗胰腺P-细胞。
36. 根据权利要求35所述的用途，其中所述治疗是通过增强所述胰腺(3-细胞的增殖或存活来进行。
37. 根据权利要求35所述的用途，其中所述增强增殖或存活是在将所 述胰腺p-细胞作为移植物施用于患者之前，通过在体外使所述细胞接触所述 多肽而实现的。
38. 根据权利要求25至35的任一项所述的用途，其中所述多肽通过选 自由以下组成的组的路径施用静脉内、皮下、透皮、口服、经颊、舌下、 经鼻递送和吸入。
39. 根据权利要求25至35的任一项所述的用途，其中所述多肽以约0.01 fig/kg至约10 mg/kg的剂量施用。
40. —种药物组合物，其用于治疗与葡萄糖代谢受损相关的代谢紊乱， 其包含治疗有效量的权利要求1至9的任一项所述的多肽。
41. 一种分离的多肽，其选自由以下组成的组SEQIDNO: 12、 SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 18、 SEQIDNO:21、 SEQ ID NO: 22、 SEQIDNO:23、 SEQ ID NO: 24、 SEQ ID NO: 25、 SEQ ID NO: 26、 SEQ ID NO: 27和SEQ ID NO: 28。
42. 根据权利要求41所述的分离的多肽，其用于制备治疗患者中与葡 萄糖代谢受损相关的疾患的药物。
43.根据权利要求41所述的分离的多肽，其用于治疗患者中与葡萄糖 代谢受损相关的疾患。
全文摘要
一种包含未酰基化的生长素释放肽的任何氨基酸片段或其任何类似物的分离的多肽，其中所述多肽具有选自由以下组成的组的活性a)降低血糖水平；b)增加胰岛素分泌和/或胰岛素敏感度；c)与胰岛素分泌细胞结合；和d)促进胰岛素分泌细胞的存活。以及所述多肽在治疗与葡萄糖代谢受损相关的疾患中的用途。
文档编号C07K14/575GK101678084SQ200880018246
公开日2010年3月24日 申请日期2008年5月30日 优先权日2007年5月31日
发明者伊奇奥·吉戈, 里卡达·格拉纳塔, 阿亚特·J·范德莱利 申请人:阿利兹药物股份有限公司