抗胃泌素释放肽核酸疫苗及制备方法

专利名称：抗胃泌素释放肽核酸疫苗及制备方法
技术领城在医学领域中本发明公开了一种治疗和预防前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、肺癌等肿瘤的核酸疫苗。
背景技术：
蛙皮素(bombesin，BN)是一种含14个氨基酸残基的生物活性多肽，它最初于1971年由Anastasi和Erspamer从欧洲铃蟾皮肤中提取出来。之后在哺乳动物中发现了与之对应具有相似功能的肽，包括胃泌素释放肽(GRP，gastrin-releasing peptide)、神经介素B(NMB，neuromedin B)、神经介素C(NMC，neuromedin C)。这些肽在C端部分都是非常保守的，而其C端部分正是其发挥生物活性的重要部位。胃泌素释放肽及其样肽的氨基酸序列如下Bombesin(14aa)Glp-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2h-GRP(27aa)R-Tyr-Pro-Arg-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2h-NMB(32aa)R-His-Ser-Arg-Gly-Asn-Leu-Trp-Ala-Thr-Gly-His-Phe-Met-NH2h-NMC(10aa)Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2R＝Val-Pro-Leu-Pro-Ala-Gly-Gly-Gly-Thr-Val-Leu-Thr-Lys-MetR’＝Ala-Pro-Leu-Ser-Trp-Asp-Leu-Pro-Glu-Pro-Arg-Ser-Arg-Ala-Ser-Lys-Ile-Arg-Val胃泌素释放肽及其样肽具有广泛的生物学功能。他们作用于心血管中枢而影响心率和血压，参与体温调节，参与平滑肌的收缩，促进胃泌素、胆囊收缩素、胰高血糖素等的释放，抑制动物的摄食行为，改善学习和记忆等。
胃泌素释放肽及其样肽作为自分泌或旁分泌生长因子能促进肿瘤细胞的增殖。胃泌素释放肽及其样肽通过与肿瘤中的相应受体结合，引发一系列信号传导途径及基因调控，从而促进肿瘤细胞的增殖。胃泌素释放肽受体家族为G蛋白偶联受体，在哺乳动物中目前已发现3种不同的受体，包括GRP受体(配体主要为GRP)、NMB受体(配体主要为NMB)和BRS3受体(配体尚不清楚)。大量的研究证实在各种肿瘤(结肠癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌等)中均有胃泌素释放肽受体家族的异常表达，且其中以GRP受体为主。有研究发现在20例人小细胞肺癌样本中发现有19例表达胃泌素释放肽受体家族；在13例人非小细胞肺癌样本中有12例表达胃泌素释放肽受体家族。胃泌素释放肽及其样肽对肿瘤发生的作用不仅仅是刺激肿瘤细胞增殖，还能影响到肿瘤的分化、血管生成、细胞粘附和细胞转移。由于胃泌素释放肽及其样肽与肿瘤的生长与分化有很大的关系，故有望成为抗肿瘤药的一个有希望的靶点。现已证实胃泌素释放肽及其样肽的受体拮抗剂以及单克隆抗体可较为有效地抑制前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、肺癌等肿瘤的肿瘤的生长。
目前已经开发和筛选出了很多胃泌素释放肽受体家族拮抗剂，如PD168368是非肽类NMB受体拮抗剂，与NMB受体有很强的亲和力。C6神经胶质瘤细胞表达NMB受体，PD168368能显著抑制C6细胞在体内和体外的增殖。RC-3095是一种较为常见的胃泌素释放肽受体家族拮抗剂，与GRP受体有较高亲和力，在体内可以抑制血管生成，并能下调HER-2受体。在各种裸鼠移植肿瘤模型中，该物质均表现出不同程度的抗肿瘤作用。
针对胃泌素释放肽及其样肽本身的抗体治疗则成为肿瘤治疗的另外一条途径。2A11是一种鼠蛙皮素单克隆抗体，与GRP有很强的亲和力。小细胞肺癌(SCLC)细胞会表达和分泌胃泌素释放肽，2A11在体外可以抑制SCLC细胞的增殖，在体内可以抑制鼠SCLC细胞移植瘤的生长。2A11可以有效地拮抗胃泌素释放肽的作用，从而抑制头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)细胞在体外和体内的增殖。
针对胃泌素释放肽及其样肽表位开发核酸疫苗也可能会成为一条肿瘤治疗的新途径，这样不但可以完全阻断胃泌素释放肽及其样肽刺激肿瘤细胞增殖的作用，还避免了反复多次给药的麻烦。胃泌素释放肽的C端7至8个氨基酸已被证实为其抗原表位，这为核酸疫苗的开发提供了基础。核酸疫苗是指将含有编码抗原蛋白目的基因的质较载体直接注入体内，通过宿主细胞的转录翻译系统表达目的抗原，并诱导机体产生免疫应答的一种新型疫苗。由于其在体内选择性表达目的产物，并将其以自然加工形式递呈给免疫识别系统，故兼具重组亚单位疫苗的安全性和减毒活疫苗诱导机体产生体液免疫和细胞免疫的双重性。与传统的疫苗相比具有免疫原性好，效果持久等特点。本发明是基于上述考虑而进行，获得了一种以SEQ ID NO.1序列为靶抗原表位的抗胃泌素释放肽核酸疫苗。

发明内容
本发明的目的是提供一种抗胃泌素释放肽核酸疫苗。
本发明的另一目的是提供一种生产该核酸疫苗的方法。
本发明还有一个目的是公开该核酸疫苗的用途。
在本发明的第一个方面提供了一种以SEQ ID NO.1序列为靶抗原表位的抗胃泌素释放肽核酸疫苗。作为本发明的一个具体方式，本发明的抗胃泌素释放肽核酸疫苗pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-TP-GRP6-M2除含有真核表达载体基本元件外，在其编码区5’端至3’端依次含有编码人VEGF信号肽的核苷酸序列、编码分枝杆菌的热休克蛋白65(HSP65)的核苷酸序列、编码破伤风毒素T辅助细胞表位(TT830-844)的核苷酸序列、编码恶性疟原虫环子孢子抗原T辅助细胞表位(PADRE)的核苷酸序列、编码六拷贝的GRP18-27(SEQ ID NO.2)的核苷酸序列和编码两段分枝杆菌来源的热休克蛋白70第407位至第426位氨基酸(mHSP407-426)的核苷酸序列。所述的VEGF信号肽的氨基酸序列是MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAA，TT830-844的氨基酸序列是QYIKANSKFIGITEL，PADRE的氨基酸序列是AKFVAAWTLKAAA，mHSP407-426的氨基酸序列是QPSVQIQVYQGEREIAAHNK。该核酸疫苗pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-TP-GRP6-M2的结构框架图见说明书附图1，测序图见附图2。
GRP为自身抗原，分子量小，免疫原性弱，直接用GRP21-27(SEQ ID NO.1)基因作免疫原在体内表达很难在体内激发免疫反应，产生相应的抗体。为增强抗胃泌素释放肽核酸疫苗的免疫原性，必须采用大分子蛋白作为免疫载体。HSP65是指源于用作卡介苗的分枝杆菌来源的热激蛋白，国际基因库登录号是M17705。HSP65已被证实具有活化巨噬细胞和释放诸多细胞因子的功能，是一种良好的免疫佐剂。带有信号肽的抗原既能主动分泌，又能保持良好的构象，与有相应受体的细胞结合。研究表明在真核细胞中分泌表达的融合热休克蛋白能显著增强融合抗原的特异性免疫反应。因此本发明采用能在真核细胞分泌的HSP65作为免疫载体。为进一步增强抗胃泌素释放肽核酸疫苗的免疫原性，我们将编码GRP18-27(SEQ ID NO.2)的核苷酸序列重复六次。另外，在抗胃泌素释放肽核酸疫苗中还引入编码TT830-844、PADRE和两段mHSP407-426的核苷酸序列。TT830-844和PADRE能和大多数人的HLADR分子、小鼠的MHC II类分子高亲和力结合，能有力激活Th1细胞分泌IL-2、IL-12、IFN、TNF-α等细胞因子。最近的研究已证实mHSP407-426能刺激细胞因子TNF-α和IL-12以及趋化因子RANTES的产生。因此编码TT830-844、PADRE和mHSP407-426的核苷酸序列的引入也能增强抗胃泌素释放肽核酸疫苗的免疫原性。
在本发明的第二方面，提供了生产该抗胃泌素释放肽核酸疫苗的方法，其技术路线详述如下1.TP基因的设计与获得在不改变TT830-844和PADRE多肽氨基酸序列的前提下，设计融合基因TP，其编码的氨基酸序列是GGGSGGGGSGSQYIKANSKFIGITELSPGSAKFVAAWTLKAAAGPGPGS。借助于计算机设计寡核苷酸引物，通过PCR法获得TP基因的核苷酸片断；TP基因5’端添加了XbaI的识别位点，3’端添加了NheI的识别位点。
2.M基因的设计与获得在不改变mHSP407-426多肽氨基酸序列的前提下，借助于计算机设计寡核苷酸引物，通过PCR法获得编码mHSP407-426多肽的核苷酸片断，命名为M基因；M基因5’端添加了NheI的识别位点，3’端添加了XbaI的识别位点、终止密码子和HindIII的识别位点。
3.重复抗原表位(GRP6)基因的设计和获得根据人胃泌素释放肽的C端十肽氨基酸组成设计寡核苷酸引物，通过PCR的方法扩增获得编码六段GRP18-27重复序列的基因片断，命名为GRP6基因；GRP6基因5’端添加了NheI的识别位点，3’端添加了XbaI的识别位点、终止密码子、HindIII的识别位点和NheI的识别位点。
4.真核质粒pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-TP-GRP6-M2及相应基因工程菌的构建GRP6基因经NheI切割插入经NheI、XbaI切割的pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-p277中，组成融合表达的重组质粒pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-GRP6。
TP基因经NheI、XbaI切割插入经NheI切割的pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-GRP6中，组成融合表达的重组质粒pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-TP-GRP6。
M基因经NheI、HindIII切割插入经XbaI、HindIII切割的pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-TP-GRP6中，组成融合表达的重组质粒pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-TP-GRP6-M。在此基础上重复操作再插入一段M基因，组成融合表达的重组质粒pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-TP-GRP6-M2。重组质粒转化大肠杆菌DH5α，筛选后获得相应的重组基因工程菌。
5.基因工程菌的发酵及抗胃泌素释放肽核酸疫苗真核质粒的大量分离纯化以LB培养基为种子和发酵培养基，于37℃，pH6.8-7.2下进行菌体发酵，结束后离心收集工程菌，用SDS碱裂解法对工程菌中的质粒DNA进行粗提。粗品采用阴离子交换树脂DEAE纤维素DE52纯化，将质拉DNA粗品进样后，以NaCl进行阶段洗脱，先用0.3mol/L NaCl将杂质(少量蛋白质、墓因组DNA、低分子量RNA)洗脱除去，再用0.6mol/L NaCl将质粒DNA洗脱收集，所得的收集液用两倍乙醇沉淀.离心去上清后得沉淀即为纯化的质粒DNA。用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测纯化的质粒纯度。
本发明的第三方面是公开该抗胃泌素释放肽核酸疫苗的用途。将纯化的抗胃泌素释放肽核酸疫苗真核质粒直接免疫动物，通过宿主细胞的转录翻译系统在机体内表达出融合蛋白，激发机体的免疫应答，产生胃泌素释放肽的特异性抗体。在医学上，该疫苗能用于预防和治疗前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、肺癌等肿瘤。


图1抗GRP核酸疫苗真核质粒pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-TP-GRP6-M2的结构框架图。
图2pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-TP-GRP6-M2C端部分基因的测序结果。
图3各免疫组小鼠血清中抗GRP抗体的ELISA测定结果显示只有抗GRP核酸疫苗真核质粒pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-TP-GRP6-M2能诱发小鼠体内产生特异性的抗GRP抗体。1.标准分子量蛋白；2.GFP-(GRP18-27)。
图4小鼠血清的Western测定结果显示pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-TP-GRP6-M2实验组小鼠体内能产生特异性的抗GRP抗体。图例-▲-生理盐水阴性对照组；-■-pCR3.1-CpG8-VS-HSP65载体对照组；-◆-pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-TP-GRP6-M2实验组图5各免疫组小鼠体内肿瘤的大小。A.生理盐水阴性对照组；B.pCR3.1-CpG8-VS-HSP65载体对照组；C.pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-TP-GRP6-M2实验组图6各免疫组小鼠体内肿瘤的平均重量。结果显示经pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-TP-GRP6-M2免疫的小鼠的肿瘤要比经pCR3.1-CpG8-VS-HSP65免疫的小鼠和注射生理盐水的正常小鼠的肿瘤小(P＜0.01)。图例 生理盐水阴性对照组； pCR3.1-CpG8-VS-HSP65载体对照组；■pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-TP-GRP6-M2实验组具体实施方式
材料(1)菌株和质拉宿主菌Escherichia coli DH5α是基因工程常用工具菌种，与基因工程研究有关的实验室一般都有保存。
质粒pCR3.1-Uni购自Invitrogen公司。
质粒pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-p277内含有编码人VEGF信号肽和分枝杆菌的热休克蛋白65(HSP65)的基因片断，由本实验室构建并保存。
质粒pCR3.1-CpG8-VS-HSP65内含有编码人VEGF信号肽和分枝杆菌的热休克蛋白65(HSP65)的基因片断，由本实验室构建并保存。
质粒pET28a-HSP65-GRP6内含有编码六段GRP18-27重复序列的基因片断，由本实验室构建并保存。
GFP-(GRP18-27)融合蛋白也由本实验室提纯。
(2)酶和试剂分子克隆工具酶和试剂、质粒抽提试剂盒为普洛麦格(Promega)公司产品。
(3)培养基LB培养基，配方见参考文献Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989。该书是基因工程技术的经典著作，在许多高校图书馆都有收藏。
(4)CeIlouse-DEAE52为Whatman公司产品。
(5)辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG二抗为武汉博士德公司产品。
(6)3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)、二氨基联苯胺(DAB)、过氧化氢尿素和牛血清蛋白(BSA)为美国Sigma公司产品。
(7)96孔酶标板为美国康宁(Coming)公司产品。
(8)硝酸纤维素膜为美国Millipore公司产品。
方法质粒提取、聚合酶链反应、内切酶酶切、DNA片断的回收、连接和转化大肠杆菌在基因工程研究领域，这些都是常规操作方法，参见Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.MolecularCloningA Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp.16-340。
核酸的定量测定参见Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T Molecular Cloning；ALaboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory press，1989，方法进行。
实施例1 真核质粒pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-TP-GRP6-M2及相应基因工程菌的构建1.TP基因的设计与获得在不改变TT830-844和PADRE多肽氨基酸序列的前提下，设计融合基因TP，其编码的氨基酸序列是GGGSGGGGSGSQYIKANSKFIGITELSPGSAKFVAAWTLKAAAGPGPGS。借助于计算机设计寡核苷酸引物，通过PCR法获得TP基因的核苷酸片断；TP基因5’端添加了XbaI的识别位点，3’端添加了NheI的识别位点。具体操作如下用引物T2和T3按一定比例混合，二者互为引物和模板，经94℃变性1min、58℃复性30sec、72℃延伸30sec共进行30个循环后，再72℃延伸10min，纯化PCR产物；再以该PCR产物为模板，用T1和T4引物进行PCR扩增，经94℃变性1min、58℃复性30sec、72℃延伸45sec共进行30个循环后，再72℃延伸10min，获得了TP基因片断。
四条引物寡核苷酸序列如下T15’GCGTCTAGAGGTGGCGGTGGCTCCGGTGGCGGTGGCTCCGGATCTCAGTACATCAAGG 3’T25’GATCTCAGTACATCAAGGCTAACTCTAAGTTCATCGGCATTACCGAGCTGTCCCCTG 3’T35’CTTCAGGGTCCAAGCGGCCACGAACTTGGCAGAGCCAGGGGACAGCTCGGTAATGCC 3’T45’ACTTGCTAGCGGATCCAGGGCCAGGGCCAGCAGCGGCCTTCAGGGTCCAAGCGGCC 3’2.M基因的设计与获得在不改变mHSP407-426多肽氨基酸序列的前提下，借助于计算机设计两条引物M1和M2。引物M1和M2按一定比例混合，二者互为引物和模板进行PCR扩增，经94℃变性1min、58℃复性30sec、72℃延伸30sec共进行30个循环后，再72℃延伸10min，获得了M基因的核苷酸片断。M基因5’端添加了NheI的识别位点，3’端添加了XbaI的识别位点、终止密码子和HindIII的识别位点。
两条引物寡核苷酸序列如下M15’ATAGCTAGCGCCAGATCTCCTGGCAGCCAGCCTTCCGTGCAGATCCAGGTCTACCAGGGCGAGCGC 3’M25’GCGAAGCTTAGCGTCTAGATGAGGATCCCTTGTTGTGAGCGGCAATCTCGCGCTCGCCCTGGTAGAC 3’3.重复抗原表位(GRP6)基因的设计和获得在不改变人胃泌素释放肽的C端十肽氨基酸序列的前提下，以质粒pET28a-HSP65-GRP6为模板设计引物G1和G2。以G1为上游引物，G2为下游引物，pET28a-HSP65-GRP6质粒为模板进行PCR，经94℃变性5min，然后以94℃变性1min、55℃复性45sec、72℃延伸1min共进行30个循环后，再72℃延伸10min，获得了编码六段GRP18-27重复序列的基因片断，命名为GRP6基因。GRP6基因5’端含有NheI的识别位点，3’端含有XbaI的识别位点、终止密码子、HindIII的识别位点和NheI的识别位点。
两条引物寡核苷酸序列如下G15’GCGACATGGGTGGCATGGATTTC 3’G25’TATGCTAGCTGGTGCTCGAGTGCGGCC 3’4.真核质粒pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-TP-GRP6-M2及相应基因工程菌的构建将PCR扩增的GRP6基因片断纯化后，用限制性内切酶NheI消化，与经限制性内切酶NheI、XbaI消化的pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-p277质粒连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，所获得的转化子中含重组质粒pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-GRP6。
将PCR扩增的TP基因片断纯化后，用限制性内切酶NheI、XbaI消化，与经限制性内切酶NheI消化的pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-GRP6质粒连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，所获得的转化子中含重组质粒pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-TP-GRP6。
将PCR扩增的M基因片断用试剂盒纯化后，用限制性内切酶NheI、HindIII消化，与经限制性内切酶XbaI、HindIII消化的pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-TP-GRP6质粒连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，所获得的转化子中含重组质粒pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-TP-GRP6-M。在此基础上重复操作再插入一段M基因，得到重组质粒pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-TP-GRP6-M2，其结构框架见图1。重组质粒转化大肠杆菌DH5α筛选后获得相应的重组基因工程菌DH5α/pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-TP-GRP6-M2，命名为PCRCSTNM2。从该工程菌中抽提的质粒送至上海英骏生物技术有限公司DNA自动测序仪进行测序以进一步验证构建的正确性，其测序图见附图2。
实施例2 基因工程菌的发酵及抗胃泌素释放肽核酸疫苗真核表达质粒的大量分离纯化从平皿中挑取工程菌的单菌落接入新鲜的LB液体培养基中，37℃振摇培养8h至对数期作为种子液，以1/100接种量接入到含250mlLB液体培养基的1000ml摇瓶中，37℃剧烈振摇培养12-16小时。所得发酵液于5000rpm，4℃离心15分钟，然后将细菌沉淀物重悬9ml溶液I[50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)]中，再加入100μlRNase A溶液[10mg/mlRNase A，10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，15mmol/L NaCl]，充分混匀后冰浴10分钟。缓慢加入20ml新配制的溶液II
，轻轻混匀后于室温放置5分钟。加入10ml用冰预冷的溶液III[5mol/L KAc 60ml，HAc 11.5ml，H2O 28.5ml]，充分混匀内容物，至不再出现分明的两个液相为止，然后冰浴10分钟。于4℃，12000rpm离心30min，弃去沉淀物，上清液中加入0.6倍体积的异丙醇，充分混匀至不出现分层后室温放置10分钟。室温以12000rpm离心30分钟，弃上清。沉淀用70％乙醇洗涤，待乙醇挥发尽后用2ml的TE[10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)]缓冲液溶解沉淀，即得质粒DNA粗品。粗品采用阴离子交换树脂DEAE纤维素DE52纯化，将质粒DNA粗品进样后，以NaCl进行阶段洗脱，先用0.3mol/L NaCl将杂质(少量蛋白质、基因组DNA、低分子量RNA)洗脱除去，再用0.6mol/L NaCI将质拉DNA洗脱收集，所得的收集液用两倍乙醇沉淀，离心去上清后得沉淀即为纯化的质粒DNA。用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测纯化的质粒纯度并进行定量。
实施例3 抗胃泌素释放肽核酸疫苗免疫动物用无菌的生理盐水将核酸疫苗或载体质粒稀释至终浓度为1μg/μl。取6周龄C57BL/6雄性小鼠，设pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-TP-GRP6-M2实脸组、pCR3.1-CpG8-VS-HSP65载体对照组和生理盐水阴性对照组，每组各8只。每次免疫前在每只小鼠的两侧胫骨前肌各注射50μl的0.25％布比卡因，共100μl，进行预处理，3天后于每只小鼠的两侧胫骨前肌各注射50μl的生理盐水或相应组质粒溶液(1μg/μl)，共100μl，每隔2周加强免疫1次(免疫前3天仍注射布比卡因)，共3次，第1次免疫后1、3、5周眼底静脉丛取血，离心取血清-20℃冷冻保存，留待检测。
实施例4 抗胃泌素释放肽抗体的ELISA检测用纯化的GFP-(GRP18-27)融合蛋白4℃过夜包被96孔ELISA酶标板，每孔100μl含100ng融合蛋白。包被后，用5％牛血清白蛋白(BSA)溶液在37℃满孔封闭一小时。免疫后取血所得抗血清，用5％BSA(于pH7.5的生理盐水中)稀释100倍，然后每孔加入100μl稀释后的抗血清于37℃作用1小时。用生理盐水T(含0.1％Tween-20)洗涤6次后加入100μl以1∶20000稀释的羊抗小鼠IgG二抗(辣根过氧化物酶标记)，每孔100μl，37℃作用1小时。生理盐水T洗涤6次，每孔加入100μl过氧化氢尿素和3、3`-、5、5`-四甲基联苯胺(TMB)溶液于37℃显色20分钟后，加入50μl 2MH2SO4终止反应，并于450nm波长下，测定各孔吸光度值。结果见附图3。从结果可以看出，表明只有pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-TP-GRP6-M2实验组小鼠体内能产生特异性的抗GRP抗体。
实施例5 抗胃泌素释放肽Western检测将纯化的GFP-(GRP18-27)融合蛋白与标准分子量蛋白经15％的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后，于30V电压电泳过夜转印到硝酸纤维素膜上；用pH7.5TBS缓冲液(含0.1％Tween-20)漂洗膜数次后在室温下将膜放入5％BSA封闭液中搅动孵育2小时，再用pH7.5TBS缓冲液(含0.1％Tween-20)漂洗2次，每次5min；实施例3或6中所得的抗血清稀释10倍后与硝酸纤维索膜37℃下搅动孵育1小时，用pH7.5TBS缓冲液(含0.1％Tween-20)将膜漂洗4次，每次5min；加入稀释400倍的羊抗小鼠IgG-HRP(辣根过氧化物酶)二抗，再与硝酸纤维素膜37℃下搅动孵育1小时后，用pH7.5TBS缓冲液(含0.1％Tween-20)将膜漂洗4次，每次5min；最后加入DAB显色试剂显色10分钟。具体操作方法参考SambrookJ，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp.888-898。小鼠血清的Westem检侧结果见附图4，在硝酸纤维素膜与pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-TP-GRP6-M2实验组小鼠的血清作用后，经DAB显色在膜上呈现相应的印迹带，表明质粒pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-TP-GRP6-M2能诱发小鼠体内产生特异性的抗胃泌素释放肽抗体。
实施例6 抗胃泌素释放肽核酸疫苗的药效学研究用无菌的生理盐水将核酸疫苗或载体质粒稀释至终浓度为1μg/μl。取6周龄C57BL/6雄性小鼠，设pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-TP-GRP6-M2实验组、pCR3.1-CpG8-VS-HSP65载体对照组和生理盐水阴性对照组，每组各8只。每次免疫前在每只小鼠的两侧胫骨前肌各注射50μl的0.25％布比卡因，共100μl，进行预处理，3天后于每只小鼠的两侧胫骨前肌各注射50μl的生理盐水或相应组质粒溶液(1μg/μl)，共100μl，每隔2周加强免疫1次(免疫前3天仍注射布比卡因)，共3次。3次免疫结束后两周每只小鼠接种RM-1前列腺癌细胞。14天后，处死每组小鼠，剥离肿瘤，称重，用福尔马林溶液固定，比较各组肿瘤大小情况，见附图5。每组肿瘤平均重量见附图6。可以看出，生理盐水阴性对照组和pCR3.1-CpG8-VS-HSP65载体对照组的前列腺癌肿瘤大小无明显差异，而pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-TP-GRP6-M2实验组肿瘤的生长得到了明显抑制，其肿瘤重量与pCR3.1-CpG8-VS-HSP65载体对照组相比下降了54.5％，与生理盐水阴性对照组相比下降了54.5％。
SEQUENCE LISTING(序列表)<110>中国药科大学<120>抗胃泌素释放肽核酸疫苗及制备方法<130>
<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>7<212>PRT<213>GRP21-27(Homo sapiens}<400>1Trp Ala Val Gly His Leu Met1 5<210>2<211>10<212>PRT<213>GRP18-27(Homo sapiens)<400>2Gly Asn His Trp Ala Val Gly His Leu Met1 5 10<210>3<211>751<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>
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370 375 380Asp Tyr Asp Arg Glu Lys Leu Gln Glu Arg Leu Ala Lys Leu Ala Gly385 390 395 400Gly Val Ala Val Ile Lys Ala Gly Ala Ala Thr Glu Val Glu Leu Lys405 410 415Glu Arg Lys His Arg Ile Glu Asp Ala Val Arg Asn Ala Lys Ala Ala420 425 430Val Glu Glu Gly Ile Val Ala Gly Gly Gly Val Thr Leu Leu Gln Ala435 440 445Ala Pro Thr Leu Asp Glu Leu Lys Leu Glu Gly Asp Glu Ala Thr Gly450 455 460Ala Asn Ile Val Lys Val Ala Leu Glu Ala Pro Leu Lys Gln Ile Ala465 470 475 480Phe Asn Ser Gly Leu Glu Pro Gly Val Val Ala Glu Lys Val Arg Asn485 490 495Leu Pro Ala Gly His Gly Leu Asn Ala Gln Thr Gly Val Tyr Glu Asp500 505 510Leu Leu Ala Ala Gly Val Ala Asp Pro Val Lys Val Thr Arg Ser Ala515 520 525Leu Gln Asn Ala Ala Ser Ile Ala Gly Leu Phe Leu Thr Thr Glu Ala530 535 540Val Val Ala Asp Lys Pro Glu Lys Glu Lys Ala Ser Val Pro Gly Gly545 550 555 560
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1.一种抗胃泌素释放肽核酸疫苗，其特征在于真核表达载体中含有编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的核酸疫苗，其特征在于真核表达载体中含有编码至少1拷贝的SEQID NO.2所示的氨基酸序列的核苷酸序列，每拷贝SEQ ID NO.2序列之间可以直接相连，也可以有其他氨基酸序列。
3.根据权利要求1和2所述的核酸疫苗，其特征在于真核表达载体中含有编码SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的核酸疫苗，其特征在于具有SEQ ID NO.4结构的基因序列。
5.一种制备权利要求1、2、3或4所述的核酸疫苗的方法，其特征在于，该方法包括a)提供一真核表达载体，该真核表达载体含有权利要求1、2、3或4所述的核苷酸序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列；b)用步骤a)所述的表达载体转化宿主细胞；c)在适合所述核酸疫苗表达的条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；和d)分离纯化获得所述核酸疫苗。
6.权利要求1、2、3或4所述的核酸疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其中包括将核酸疫苗溶于一定的介质中，进行免疫，用于预防和治疗乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌等肿瘤。
8.根据权利要求1、2、3或4所述的核酸疫苗，其特征在于可与其他药物载体组合制成药物组合物。
9.根据权利要求1、2、3或4所述的核酸疫苗，其特征在于可与其他药物活性成分组合制成药物组合物。
全文摘要
本发明公开了一种抗胃泌素释放肽核酸疫苗及制备方法。该核酸疫苗含有编码SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列的核苷酸序列。该核酸疫苗免疫机体后能诱发机体产生特异性的抗胃泌素释放肽抗体。在医学领域中，该核酸疫苗可用于预防和治疗前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、肺癌等肿瘤。
文档编号A61P35/00GK1861194SQ200610039429
公开日2006年11月15日 申请日期2006年4月11日 优先权日2006年4月11日
发明者刘景晶, 欧阳可栋, 吴国君, 过为, 吴洁, 曹荣月 申请人:中国药科大学