小细胞肺癌标志物胃泌素释放肽前体多肽片段的dna核酸适体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及化学生物学技术领域，更具体地说是涉及小细胞肺癌标志物胃泌素释 放肽前体多肽片段的DNA核酸适体的序列筛选。
【背景技术】
[0002] 核酸适体（Aptamers)是从大容量的随机寡核苷酸序列库中针对非核酸靶分 子选择得到的能与该靶分子高亲合度高特异性结合的单链DNA或RNA分子，是通过 体外重复的吸附、恢复、再放大过程，从而实现对与靶分子相结合的寡核苷酸序列的 指数富集而得到的。这种选择核酸适体的方法叫SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment，通过指数富集对配体的系统进化），在1990年 分别由 Tuerk and Gold(文献：C. Tuerk, L. Gold, Systematic evolution of ligands by exponential enrichment:RNA ligands to bacteriophage T4DNA polymerase, S cience，1990, 249:505-510)以及 Ellington and Szostak(文献：A.D. Ellington，J. W. Szostak, In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands, Nature 1990,346:818-822)两个研究小组独立报导。核酸适体除了具有与抗体相似的对靶分 子的高亲合度和高特异性结合外，还具有如下抗体所不具备的优点：i)容易生产，生产 周期短；2)靶分子适应范围宽：核酸适体的靶分子包括各种蛋白质（酶、膜蛋白、病毒蛋 白、细胞因子和生长因子、免疫球蛋白等）、氨基酸、药物、金属离子、其他生物/无机/有 机小分子、以及整个细胞，而抗体只能被用于免疫源性化合物；3)生产成本低；4)易于 修饰；5)化学稳定性以及热稳定性强，储存寿命长。核酸适体自出现以后，就得到了各 个领域的广泛关注，特别是近年来在生物传感器、新药开发等领域的应用取得了一定的 成果。最近，小细胞肺癌标志物胃泌素释放肽前体（pro-gastrin-releasing peptide， Pro-GRP (1 - 98a. a.))的 DNA 核酸适体被报道（M. Mie, T. Kai 1，T. Le, A. E. G. Cass, E. Kobatake，Selection of DNA aptamers with affinity for pr〇-gastrin-releasing peptide (proGRP)，a tumor marker for small cell lung cancer, Applied Biochemistry and Biotechnology，2013, 169:250-255)。Pro-GRP 是一种小细胞肺癌肿瘤标志物D 研 究表明，Pro-GRP的活性位点位于其31-98a. a，因而，Pro-GRP的31-98a. a.多肽片段 (Pr〇-GRP31_98)是一种新的、敏感、特异、可靠的小细胞肺癌肿瘤标志物。目前未见筛选 Pr〇-GRP 31_9j^ DNA核酸适体序列的相关报道。
【发明内容】
[0003] 本发明目的在于提供针对Pro-GRP^gj^ DNA核酸适体序列，为后期生物传感器、 临床诊断试剂研发提供方便。
[0004] 为实现本目的，本发明通过基于亲和磁珠分离法的SELEX筛选方法，从单链 DNA (ssDNA)文库中筛选出Pr〇-GRP31_9i^ DNA核酸适体文库，然后对筛选出的DNA适体文库 经聚合酶链式反应（PCR)扩增后，以大肠杆菌为受体细胞通过基因克隆技术对DNA适体文 库中的DNA核酸适体进行分离，通过测序技术确定各条DNA核酸适体的序列，最后通过电化 学发光（ECL)法，以[Ru (bpy) 2dppz]2+为DNA分子开关和ECL试剂，对各条DNA核酸适体针 对Pr〇-GRP 31_9i^结合特异性和结合力进行分析检测，确定针对Pro-GRP 31_98的高亲和力、特 异性DNA核酸适体序列。
[0005] 原理及具体技术方案如下：
[0006] SELEX筛选过程由构建DNA文库、孵育、分离和PCR扩增四个步骤组成。其中孵育、 分离和PCR扩增步骤交替重复12次。构建的DNA文库序列为：5' -CTTCTGCCCGCCTCCTTCC-(48nt)-GGAGACGAGATAGGCGGACACT-3, 。
[0007] DNA文库序列委托生物技术公司化学合成。然后将Pr〇-GRP31_98通过酰胺键固定在 羧基修饰的磁珠上，与合成的随机DNA文库孵育。经磁力吸附将孵育后的磁珠与溶液分离。 然后以结合寡核苷酸的磁珠为PCR扩增的模板，用荧光修饰的正向引物和生物素修饰的反 向引物进行PCR扩增。该PCR扩增过程在DNA文库中引入荧光标记，并同时在DNA文库的 互补链上引入生物素。PCR扩增后得到的荧光/生物素修饰的双链DNA与链霉亲和素修饰 的磁珠通过形成链霉亲和素-生物素复合物进行结合。然后通过碱变性和磁力吸附分离得 到荧光ssDNA文库。分离得到的荧光ssDNA文库进入下一轮的孵育、分离和PCR扩增程序。 在筛选过程中，与荧光ssDNA文库孵育后的Pr〇-GRP 31_98包被磁珠在分离后进行荧光检测以 实时监测筛选的进程。
[0008] 上述筛选过程进行6轮后每隔1-3轮将上轮得到的荧光ssDNA文库与固定了牛血 清白蛋白的磁珠以及固定了牛胰岛素的磁珠分别孵育，进行反筛，以提高DNA适体文库对 酶切的结合特异性。经磁力吸附将孵育后的磁珠与溶液分离，然后将得到的溶液作为荧光 ssDNA文库进入下一轮的孵育、分离和PCR扩增程序。
[0009] 最后，经12轮筛选后得到的DNA适体文库经PCR扩增后，利用TA克隆，克隆到T 载体中，转化Trans5 a感受态大肠杆菌受体细胞，在含有Amp (Amp终浓度为100 μg/ml)， IPTG和X-gal的LB固体培养基上37°C培养过夜，通过蓝白斑筛选阳性克隆。然后从过夜 培养的平板上挑取白色菌落，用通用引物做菌落PCR验证克隆的阳性。挑选阳性重组子接 种于含有Amp的LB液体培养基中37°C振荡过夜，提取质粒进行酶切，对酶切产物进行琼脂 糖凝胶，进一步鉴定克隆的阳性。对阳性克隆进行测序，得到Pr〇-GRP 31_98的核酸适体序列。
[0010] 经过序列同源性比对和OligoAnalyzer 3. 1在线工具模拟二级结构分析，选择其 中某些代表序列，并对其序列进行部分修改，对？1~〇-61^ 31_98进行亲和力和结合特异性的检 测及鉴定。
[0011] 亲和力的检测及鉴定方法如下：
[0012] 委托生物技术公司化学合成DNA核酸适体。将合成的DNA核酸适体用Binding Buffer(含 100mM NaCl，20mM Tris-HCl，2mM MgCl2,5mM KCl，lmM CaCl2，和 0.02% Tween 20，pH = 7.6)溶解。DNA溶液的标准浓度通过测定溶液在紫外可见光谱260nm波长处的吸 光度，由Lambrt-Beer定律A = | *c*L计算得到。式中A为吸光度、|为摩尔消光系数、c 为溶液浓度、L为液层厚度。
[0013]然后，将10yL lOOyM 的 DNA核酸适体的 TE(10mM Tris-HCl，lmM EDTA，pH = 8. 0)溶液经热变性处理后与lmL 20 yM的[Ru(bpy)2dppz]2+(bpy:联卩比啶；dppz:二卩比啶 并吩嗪）的5mM草酸溶液室温混合，用玻碳电极和电化学发光分析仪实时检测记录该溶液 的电化学发光信号。待信号稳定后（ECU)，在溶液中梯度批量加入Pr〇-GRP31_98溶液，并检 测记录不同Pr〇-GRP 31_98浓度（C)下的稳定电化学发光信号（ECLD。由药学公式AECL = AECLmaxCV(Kd+C)，推导出 1/ AECL = K/( AECLmaxC) +1/ AECLmax。其中 Kd为 DNA 核酸适体 与Pr〇-GRP31_98的解离常数，A ECL = ECL 。由1/ A ECL与1/C的线性关系直线，根据 直线斜率与截距的比值计算得到DNA核酸适体与Pr〇-GRP31_ 98之间的K d值。
[0014] 结合特异性的检测及鉴定方法如下：
[0015] 将10yL lOOyM的DNA核酸适体的TE溶液经热变性处理后与lmL 20yM的 [Ru (bpy) 2dppz]2+的5mM草酸溶液室温混合混合，用玻碳电极和电化学发光分析仪实时检 测记录该溶液的电化学发光信号（ECU)。待信号稳定后，分别在溶液中加入50yL 1.2mg/ ml的不同的蛋白质或多肽，包括Pr〇-GRP31_98、牛胰岛素（Insulin)、牛血清白蛋白（BSA)、和 伴刀豆球蛋白（ConA)。在一次实验的溶液中只加入一种蛋白质或多肽。加入蛋白质或多肽 后检测记录对应的稳定电化学发光信号（ECLJ。将不同蛋白质或多肽的（ECU-ECL^/ECU 值做柱方分析图。
[0016] 本发明创新点在于：
[0017] 1)通过SELEX技术，得到了 1条与Pr〇-GRP31_9^亲和力、特异性结合的DNA核酸 适体：Aptamer-18。其DNA见序列表。
[0018] 2)对DNA核酸适体Aptamer-18的序列进行修改，得到另外2条针对Pr〇-GRP31_ 98 的高亲和力、特异性DNA核酸适体：Aptamer-18 ^和Aptamer-18〃。其DNA见序列表。
[0019] 3)将上述三条DNA核酸适体针对？1~〇-61^31_ 98进行亲和力和结合特异性检测实验， 确定其是Pr〇-GRP31_98的高亲合度、高特异性DNA核酸适体。
[0020] 4)通过对上述三条DNA核酸适体的二级结构进行比对，推断该三条DNA核酸适体 与 Pr〇-GRP31_9i^主要结合位点为序列 Aptamer_18B :5' -ccagatagtc cctgg-3'。
[0021] 本发明所述Pr〇-GRP31_9^ DNA核酸适体DNA序列见序列表中N01，N02, N03。N01为 Pro-GRP^-gJS酸适体 Aptamer-18 的 DNA 序列；N02 为 Pro-GRP 31_98核酸适体 Aptamer-18 ' 的 DNA 序列；N03 为 Pr〇-GRP31_9JS酸适体 Aptamer-18〃 的 DNA 序列。N01，N02, N03 序列长 度为 10nt 到 150nt。
【附图说明】
[0022] 图1为通过蓝白斑筛选DNA适体文库阳性克隆实验后得到的部分白色菌落的PCR 扩增产物的1. 5%琼脂糖凝胶电泳图。图中从左到右的泳道依次为1-24号菌落和Marker。 Marker 的分子大小由上到下依次是 5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp 和100bp。结果表明大部分白色菌落为阳性菌落，目的片段插入到了载体中，并且片段大小 正确，为345bp。阳性菌落