在结肠癌治疗中的前胃泌素抑制剂的制作方法

专利名称：：在结肠癌治疗中的前胃泌素抑制剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于治疗和预防结直肠癌、腺瘤性息肉病和转移的方法和组合物。
背景技术：
：在66%的病例中，人类结肠的肿瘤发生涉及肿瘤抑制剂基因腺瘤性结肠息肉病(APC)的或在P-连接素基因中的体细胞突变(由下列参考文献计算的平均值(Conlin等人，2005;DeFilippo等人，2002;Huang等人，1996;Johnson等人，2005;Kim等人，2003;Luchtenborg等人，2005;Mikami等人，2006;Morin等人，1997;Powell等人，1992;Rowan等人，2000;Segditsas和Tomli励n,2006;Shitoh等人，2004;Smith等人，2002;Sparks等人，1998;S腦weera等人，2006;Takayama等人，2001))。这些突变被认为是在散发性结直肠癌患者中发生的结直肠癌发生的早期事件。，c基因中的生殖细胞突变也响应于家族性结肠息肉病，一种与肠癌的高风险相关的遗传综合症。这些突变导致粘着连接蛋白P-连接素的细胞质库的缺陷性调控，引起Tcf-4-介导的转录通路的组成性激活。该组成性激活引起诸如c-myc或细胞周期蛋白Dl的Tcf4目标基因的高水平转录。该通路的另一可能目标是编码前胃泌素激素原的GAST基因。已显示该基因的转录在体外(3-连接素/Tcf4复合体的激活后被增加(Koh等人，2000)。前胃泌素在结肠癌发生中的作用首先在约15年前被提出，当前胃泌素在结直肠肿瘤提取物中被发现时(Finley等人，1993;Kochman等人，1992;Nemeth等人，1993)，和当前胃泌素的血浆水平被显示为在约75%的患有结直肠肿瘤的患者中升高时，而在对照中未^^测到(Ciccotosto等人，1995;Konturek等人，2002;Siddheshwar等人，2001;VanSolinge等人，1993)。基于这些观察，前胃泌素能与结肠癌发生有关的理论已经在体外和体内被研究。研究首先显示，甘氨酸延长型胃泌素(前胃泌素成熟产物之一)对增殖起阳性效果(Hollande等人，1997;Koh等人，1999;Litvak等人，1999;Singh等人，1994;Stepan等人，1999)。同时显示，在肝脏中的前胃泌素的过量表达诱导肠上皮细胞中的有丝分裂发生，而其形成较小的肽在肝脏中不能发生(wang等人，1996)。所述相同的转基因小鼠被用以证明前胃泌素的过量表达诱导氧化偶氮曱烷诱导的癌发生的敏感性(Singh等人，2000)。然而，当敲除胃泌素基因也诱导相同的癌发生敏感性被显示时，所述观测被挑战(Cobb等人，2002)。然而，前胃泌素的增殖效果被进一步在体外用大鼠肠细胞系IEC6证明(Brown等人，2003)，并在体内用受控于fabp启动子的显示前胃泌素的肠过量表达的转基因小鼠模型中证明(Cobb等人，2004)。然而，所述小鼠模型的主要缺点是，前胃泌素在肠上皮细胞的分化细胞中，而不在增殖细胞中被过量表达。在2003和2005年，Ottewell等人提供数据，其关于在DNA损伤后，前胃泌素刺激鼠结肠上皮细胞有丝分裂，以及关于前胃泌素的羧基末端26-氨基酸残基在体内足以对鼠结肠上皮细胞中的有丝分裂产生刺激(Ottewell等人，2005;Ottewell等人，2003)。基于主要源自过量表达试验的这些数据，前胃泌素被接受为肠上皮细胞的"生长因子"。相反，仅有三个研究在体外和一个在体内设法耗尽细胞。在体外，2个前胃泌素产生细胞系被胃泌素基因反义转染，显示在棵鼠中集落形成以及肿瘤植入被缺失(Singh等人，1996)。然而重要的是，没有论证这些阻断效果归属于哪一个胃泌素基因产物。更近的研究证明，前胃泌素缺失使稳固粘着和紧密连接在肠上皮细胞中恢复，使前胃泌素与移植激活相联系(Hollande等人，2003)。最后，最终的体外研究专注于甘氨酸延长型胃泌素17(前胃泌素的成熟产物)的作用，因为在研究中所用的细胞分泌大量所述肽，但是非常少的前胃泌素(Hollande等人，1997)。在体内，上述KO小鼠对胂瘤发生更敏感。重要的是，仅有的报道(3-连接素/Tcf4复合体和肽的胃泌素族间的关系的两个研究证明，在体外，仅有Tcf4转录通路的激活(Koh等人，2000)，特别与Ras相关(Chakladar等人，2005),引起胃泌素基因启动子的激活和增加基因的转录。相反，在此处提供的数据之前，不知道关于结肠中分泌的来自胃泌素基因的肽在(3-连接素/Tcf4通路的异常激活中的真实特性，没有报道提及通过前胃泌素功能的阻断而逆转所述通路的激活的可能性，以及在人结直肠癌患者中，在其肿瘤中显示所述通路激活的那些现有数据提供充足的科学证据表明，前胃泌素的缺失能逆转通过组成性卩-连接素/Tcf4激活诱导的结直肠肿瘤发生。这样的凝:据被提供在下面的本发明的说明中。胃泌素和前胃泌素胃泌素是典型的肠肽激素，其最初被识别为胃酸分泌的刺激物。其主要由胃窦的G细胞并在不同程度上在上部小肠中产生，在结肠和胰腺中的量非常低。近年来，对肽的胃泌素族在结直肠癌发生中的作用的兴趣已经增加。特别的，大量证据证明，以前被认为是非活性的胃泌素的前体形式(前胃泌素和甘氨酸延长型胃泌素)在结直肠癌的发展中起作用(见上述说明)。胃泌素以各种分子形式出现。人羧基末端酰胺化胃泌素，G17和G34，由101-氨基酸前体分子，前胃泌素原，通过转录后修饰产生。前胃泌素原被共翻译转移进内质网中，在此信号肽净皮迅速裂解以产生前胃泌素。前胃泌素随后被激素原转化酶和羧肽酶E裂解产生具有羧基末端甘氨酸残基的肽，即G34-Gly，和另外的裂解产生肽G17-Gly。G34-Gly能通过肽酰a-酰胺化单氧酶被转化成羧基末端酰^^化肽G34,并能类似地被裂解以产生G17。G17或Gamide是胃泌素的主要窦形式，具有通常包含少于人体中总分泌肽的10%的非酰胺化前体(前胃泌素、甘氨酸延长型胃泌素)。然而，在处理被损伤的特定临床情况下，较大部分的非酰胺化胃泌素被分泌。例如，如上所述，前胃泌素的组织和血浆浓度在一些结直肠癌患者中上升(Ciccotosto等人，1995;Konturek等人，2002;Siddheshwar等人，2001;VanSolinge等人，1993)。在W09919353中，提出了与胃肠粘膜细胞增殖的自分泌刺激的过度活跃相关的状况的治疗方法。所述方法包括向需要此类治疗的哺乳动物给予有效量的前胃泌素与细胞内胃泌素/CCK-C受体或其他前胃泌素受体的的结合的拮抗剂的步骤。US61659卯公开了用于治疗结肠癌的方法。结肠癌对胃泌素的表达通过反义胃泌素表达的应用而被抑制。在WO2004/089976A中，公开了用于治疗与非酰胺化胃泌素的水平上升相关的状况的方法和组合物。一方面，所述方法包括向需要此类治疗的哺乳动物给予有效量的化合物的步骤，所述化合物能抑制高铁离子与任一或多个甘氨酸延长型胃泌素17、前胃泌素或前胃泌素衍生肽的结合，但不能抑制酰胺化胃泌素的活性，并因而抑制非酰胺化胃泌素的活性。提供数据以支持以下要求，即抑制高铁离子与甘氨酸延长型胃泌素17结合的能力确实降低其生物活性，但是没有提供涉及对前胃泌素的生物活性有影响的数据。WO2006/032980A关注保护前胃泌素结合分子，其选纟奪性结合前胃泌素，其中所述分子不与胃泌素17(G17)、胃泌素34(G34)、甘氨酸延长型胃泌素17(G17-Gly)、或甘氨酸延长型胃泌素34(G34-Gly)结合，特别是对前胃泌素和产生其的杂交瘤细胞有选择性的单克隆抗体。一种方法被公开，其用上述抗体在生物流体中定量前胃泌素水平，但是所述要求不被涉及这些抗体在任何生物流体中选择性检测前胃泌素的能力任何数被公开，没有数据支持下述要求，即这些抗体证明改变前胃泌素的生物活性的任何选择性能力。该文献仅提供用于建立所述抗体特异性的方法。迄今，治疗和/或预防结直肠癌、转移和腺瘤性息肉病的有效和特异性方式是缺乏的。因此，本发明的目的是提供改善的方法，用于治疗和/或预防结直肠癌、转移和腺瘤性息肉病。发明概述在实现所述目的中，提供治疗和/或预防缘于P-连接素/Tcf-4-介导的转录通路是组成性激活的前胃泌素分泌细胞的结直肠癌、腺瘤性息肉病和转移的方法，包括向需要其的个体给予有效量的前胃泌素诱导阻遏卩-连接素与Tcf-4结合的抑制剂(ICAT)的抑制剂的步骤。本发明还提供用于治疗和/或预防显示前胃泌素分泌细胞和(3-连接素/Tcf-4-介导的转录通路为组成性激活的细胞的结直肠癌、腺瘤性息肉病或转移的方法，包括向需要其的个体给予有效量的前胃泌素诱导阻遏(3-连接素与Tcf-4结合的抑制剂(ICAT)的抑制剂的步骤。正是本发明第一次说明，前胃泌素，而不是任何其他GAST基因的产物的缺失，能通过直接对[3-连接素/Tcf4活性的组成性激活起作用而逆转肿瘤发生。所述逆转包括ICAT表达的调控，在高前胃泌素的环境中低，在前胃泌素缺失的环境中高。当ICAT高时，(3-连4^素/Tcf4活性的组成性激活由于ICAT从Tcf4上截获P-连接素而极度降低。因此，第一次，证明了前胃泌素的缺失对缘于P-连接素/Tcf-4-介导的转录通路是组成性激活的前胃泌素分泌细胞的结直肠癌、腺瘤性息肉病和转移的治疗非常有效，以及对显示前胃泌素分泌细胞和(3-连接素/1\^-4-介导的转录通路为组成性激活的细胞的结直肠癌、腺瘤性息肉病或转移的治疗非常有效。具有低ICAT表达、组成型P-连接素/Tcf4介导的激活、和高前胃泌素表达的那些人结直肠肺瘤、腺瘤性息肉病或转移的人群因此能被选择用于抗前胃泌素治疗。本发明还涉及一种方法，用于确定患有结直肠癌、腺瘤性息肉病或转移的患者是否对前胃泌素诱导阻遏(3-连接素与Tcf-4结合的抑制剂(ICAT)的抑制剂的治疗有响应，包括确定结直肠癌、腺瘤性息肉病或转移是否缘于(3-连接素/Tcf-4-介导的转录通路为组成性激活的前胃泌素分泌细胞。本发明还提供一种方法，其将可能对治疗方案有响应的患者的特定人群的选择，与结直肠癌、腺瘤性息肉病或转移的治疗和/或预防相结合。还提供了前胃泌素诱导阻遏(3-连接素与Tcf-4结合的抑制剂(ICAT)的抑制剂在用于治疗和/或预防缘于(3-连接素/Tcf-4-介导的转录通路是组成性激活的前胃泌素分泌细胞的结直肠癌、腺瘤性息肉病和转移的药物生产中的用途。还提供了前胃泌素诱导阻遏(3-连接素与Tcf-4结合的抑制剂(ICAT)的抑制剂在用于治疗和/或预防显示前胃泌素分泌细胞和(3-连接素/Tcf-4-介导的转录通路为组成性激活的细胞的结直肠癌、腺瘤性息肉病和转移的药物生产中的用途。在本发明的另一个实施方案中，提供一种方法来筛选用于治疗和/或预防缘于(3-连接素/Tcf-4-介导转录通路是组成性激活的前胃泌素分泌细胞的结直肠癌、腺瘤性息肉病和转移的化合物。发明详述本发明提供用于治疗和/或预防显示前胃泌素分泌细胞和P-连接素/Tcf-4-介导的转录通路为组成性激活的细胞的结直肠癌、腺瘤性息肉病和转移的方法，包括向需要其的个体给予有效量的前胃泌素诱导阻遏(3-连接素与Tcf-4结合的抑制剂(ICAT)的抑制剂的步骤。还提供了前胃泌素诱导阻遏(3-连接素与Tcf-4结合的抑制剂(ICAT)的抑制剂在用于治疗和/或预防显示前胃泌素分泌细胞和(3-连接素/1\^-4-介导的转录通路为组成性激活的细胞的结直肠癌、腺瘤性息肉病和转移的药物生产中的用途。典型地，前胃泌素分泌细胞和(3-连接素/Tcf-4-介导的转录通路为组成性激活的细胞是结肠细胞。典型地，前胃泌素分泌细胞和P-连接素/Tcf-4-介导的转录通路为组成性激活的细胞可以相同。本发明还提供治疗和/或预防缘于P-连接素/Tcf-4-介导的转录通路是组成性激活的前胃泌素分泌细胞的结直肠癌、腺瘤性息肉病和转移的方法，包括向需要其的个体给予有效量的前胃泌素诱导阻遏P-连接素与Tcf-4结合的抑制剂(ICAT)的抑制剂的步骤。典型地，前胃泌素分泌细胞为结肠细胞。还提供了前胃泌素诱导阻遏(3-连接素与Tcf-4结合的抑制剂(ICAT)的抑制剂在用于治疗和/或预防缘于P-连接素/Tcf-4-介导转录通路是组成性激活的前胃泌素分泌细胞的结直肠癌、腺瘤性息肉病和转移的药物生产中的用途。结肠癌转移是导致患者死亡的重要原因，其很少被手术，或者因为其很难接近，或者因为外科切除对重症患者的存活存在极端的风险。当转移物在与重要动脉很近的地方生长时，特别如此。本发明的治疗或者通过完全去除转移体或者至少通过使转移从动脉缩退而允许外科切除，诱导这些转移衰退，从而是非常有用的。而且，结肠癌细胞中前胃泌素合成的下调恢复了结肠肺瘤细胞的粘着能力，导致其转移趋势的降低(Hollande等人，2003)。典型地，治疗的转移可以不是外科可切除的。转移可以缘于原发性瘤，p-连接素/Tcf-4-介导的转录通路的激活状态对其是未知的。典型地，转移起源的原发性瘤是结肠肿瘤。个体，指动物或人。组成性激活P-连接素/Tcf-4-介导的转录通路，指永久的、和非调控的通路激活，其导致在(3-连接素和Tcf-4间形成转录复合体，由于缺乏细胞质P-连接素的降解而导致Tcf-4靶基因的转录提高。卩-连接素/Tcf-4-介导的转录通路是组成性激活的细胞的实例为腺瘤性结肠息肉病(APC)肺瘤抑制基因突变的细胞，或|3-连4妻素基因以防止(3-连接素正常降解的方式突变的细胞。典型地，在对患有结直肠癌、腺瘤性息肉病或转移的患者施用本发明的治疗方法之前，可以进行诊断测试以确定结直肠癌、腺瘤性息肉病或转移是否缘于(3-连接素/Tcf-4-介导的转录通路是组成性激活的前胃泌素分泌细胞，或者结直肠癌、腺瘤性息肉病或转移是否显示前胃泌素分泌述预处理诊断测试，可以确定患者是否对本发明的治疗方法有响应。进行此类诊断测试在技术人员的能力范围内。典型地，患者血液中的前胃泌素血浆水平可以被确定以仅治疗那些在血浆中具有上升的前胃泌素水平的患者。血浆前胃泌素测量也可以被用以测试肿瘤和/或转移的最终复发。贯穿其寿命，结直肠胂瘤分泌促进新血管的发生的因子(如VEGF)，从而确保肿瘤获得足够量的营养以达到最大生长(Wray等人，2004)。这些新血管的存在也使肺瘤释放各种因子进入血流中，对前胃泌素特别如此。因此，前胃泌素革巴向治疗可以包括血浆前胃泌素水平的测量。可选的或另外的，APC基因或(3-连接素基因的突变可以被检测，或者诸如c-Myc和细胞周期蛋白Dl的Tcf靶基因的转录的异常水平可以通过在取自患者的组织切片上为这些标记物染色或通过应用例如微阵列技术确定。本发明还涉及用于确定患有结直肠癌、腺瘤性息肉病或转移的患者是否对前胃泌素诱导阻遏(3-连接素与Tcf-4结合的抑制剂(ICAT)的抑制剂的治疗有响应的方法，包括确定结直肠癌、腺瘤性息肉病或转移是否缘于IB-连接素/Tcf-4-介导的转录通路为组成性激活的前胃泌素分泌细胞，或者结直肠癌、腺瘤性息肉病或转移是否显示前胃泌素分泌细胞和p-连接素/Tcf-4-介导的转录通路为组成性激活的细胞。典型地，确定结直肠癌、腺瘤性息肉病或转移是否缘于(3-连接素/Tcf-4-介导的转录通路为组成性激活的前胃泌素分泌细胞，或者结直肠癌、腺瘤性息肉病或转移是否显示前胃泌素分泌细胞和(3-连接素/1^-4-介导的转录通路为组成性激活的细胞的步骤，包括测量所述患者的前胃泌素的血浆水平的步骤。另外的或可选的，确定结直肠癌、腺瘤性息肉病或转移是否缘于[3-连接素/Tcf-4-介导的转录通路为组成性激活的前胃泌素分泌细胞，或者结直肠癌、腺瘤性息肉病或转移是否显示前胃泌素分泌细胞和(3-连接素/Tcf-4-介导的转录通路为组成性激活的细胞的步骤，包括检测APC基因或P-连接素基因的突变或者Tcf靶基因转录的异常水平的步骤。典型地，前胃泌素测定可以是时间分辨荧光测定(TR-IFMA)，如proGRP所述(Nordkmd等人，2007)。该类型测定允许定量的范围为16ng/1-20,000ng/1，在患有结直肠肿瘤的患者中测量的前胃泌素血浆水平的范围内的值。两个单克隆抗体可以被应用，一个针对前胃泌素的N端，另一个针对C端。N端抗体可以是生物素酰化的并用作固相抗体。C端抗体可以用Eu"标记并用作示踪抗体。前胃泌素的表达的药剂、抗前胃泌素抗体、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的抑制剂和整合素连接激酶(ILK)的抑制剂.。在本发明的实施方案中，前胃泌素诱导阻遏ICAT的抑制剂是下调结肠细胞中的前胃泌素的表达的药剂。典型地，下调结肠细胞中的前胃泌素的表达的药剂包含干扰前胃泌素表达的核酸。是小片段的mRNA的互补链。用于设计有效的反义分子的方法是公知的(例如见US6165990)，其在技术人员设计能下调结肠细胞中的前胃泌素的表达的反义分子的能力范围内。下调前胃泌素的表达的药剂的其他实例为RNA干扰(RNAi)分子，如短干扰RNA(siRNA)和短发卡状RNA(shRNA)。RNAi指引导同源双链RNA以特异性靶向基因产物，在本案的前胃泌素中，导致无义或亚等位基因表型。用于设计有效的RNAi分子的方法是7>知的(见Hannon和Rossi的综述，Nature.2004Sep16;431(7006):371-8),这在技术人员设计能下调结肠细胞中的前胃泌素的表达的RNAi分子的能力范围内。能下调结肠细胞中的前胃泌素的表达的siRNA的实例是包含下列序列之一的核酸分子siRNAshPG:有义5，-GAAGAAGCCUAUGGAUGGATT-3，(SEQIDN。27)反义5'-UCCAUCCAUAGGCUUCUUCTT-3，(SEQIDN。28)siRNAsmPG:有义5，-GAAGAGGCCUACGGAUGGTT-3,(SEQIDN。29)反义5，-CCAUCCGUAGGCCUCUUCTT-3，(SEQIDN。30)能下调结肠细胞中的前胃泌素的表达的shRNA的实例是包含下列序列之一的核酸分子shRNAhPG:有义AGAAGTTTTTT3，(SEQIDN。l)反义CATAGGCTTCTTCGGCC3,(SEQIDN。2)本发明的一个实施方案涉及包含siRNA的药物，包含选自SEQIDN。27、SEQIDN。28、SEQIDN。29和SEQIDN。30的序列之一。典型地，药物可以包含一对siRNA。siRNA对的实例为包含SEQIDN°27的第一核酸和包含SEQIDN°28的第二核酸或者包含SEQIDN。29的第一核酸和包含SEQIDN°30的第二核酸。本发明的一个实施方案涉及包含shRNA的药物，包含选自SEQIDN。l和SEQIDN。2的序列之一。典型地，药物可以包含一对shRNA。shRNA对的实例为包含SEQIDN。1的第一核酸和包含SEQIDN°2的第二核酸。在本发明的其他实施方案中，前胃泌素诱导阻遏ICAT的抑制剂是抗前胃泌素抗体或其生物活性片段或衍生物，其不识别酰胺化和甘氨酸延长型的胃泌素。本领域内的技术人员知道生产所述特异性抗体的标准方前胃泌素或前胃泌素片段对动物进行免疫，和通过选择结合前胃泌素并且不识别酰胺化和甘氨酸延长型的胃泌素的抗体。在一个优选实施方案中，前胃泌素片段是对前胃泌素特异的氨基酸序列。所述序列的长度可以包含8-15个氨基酸。这些序列包含前胃泌素的羧基末端氨基酸残基或氨基末端氨基酸残基，其不以胃泌素形式G17和G34-Gly存在。这些序列可以包含激素原转化酶或羧肽酶E的裂解位点。在本发明的一个实施方案中，抗体或其生物活性片段或其衍生物，结合前胃泌素的羧基末端10-氨基酸残基或前胃泌素的羧基末端15-氨基酸残基。前胃泌素的羧基末端10-氨基酸残基的实例为FGRRSAEDEN(SEQIDN。31)。在一个可选实施方案中，抗体生物活性片段或其衍生物结合前胃泌素的氨基末端40-氨基酸残基。典型地，抗体生物活性片段或其衍生物可以结合SWKPRSQQPDAPLGT(SEQIDN。32)。所述氨基酸序列是对前胃泌素特异的，其不存在于.胃泌素形式G17、G17-gly、G34和G34-Gly中。本领域内的技术人员知道生产多克隆和单克隆抗体和其生物活性片段和衍生物的标准方法。其生物活性片段或衍生物，指能够结合与抗体相同的表位，在本案中为前胃泌素的表位。抗体片段，特别是Fab片段和保留表位结合能力和特异性的其他片段也是公知的，其为嵌合抗体，和"人源化"抗体，其中抗体的结构(不决定抗原特异性)区域被其他种的相似或类似区域代替。因此，在小鼠中产生的抗体能是"人源化"以降低可以发生在给予人体的负面效果。在市场上，若干嵌合抗体现在被接受为治疗形式。因此，本发明包含对前胃泌素特异的抗体的用途，所述抗体包括F(ab')2、F(ab)2、Fab、Fv和Fd抗体片l殳、其中一个或多个区域已经被同源人体或非人体部分代替的嵌合抗体。本领域内的技术人员也能知道，生物活性抗体衍生物如ScFv片段和二价ScFv型分子能用重组方法制备。抗体可以用可4全测的标记物标记，其适于》文射性标记，如方文射性碘，或可以是荧光或化学发光标记。本领域内的技术人员将能够选择适合的放射性、荧光或化学发光标记。本发明的一个实施方案涉及一种药物，包含抗体或其生物活性片段或衍生物，其结合前胃泌素的羧基末端15-氨基酸残基，或氨基末端40氨基酸残基。典型地，抗体或其生物活性片段或衍生物结合FGRRSAEDEN(SEQIDN。31)或SWKPRSQQPDAPLGT(SEQIDN。32)。在健康人体中，前胃泌素包含低于10%的循环胃泌素，并且没有与前胃泌素相关的生理作用。因此，即使不避免，通过用抗体或其生物活性片段或衍生物特异性靶向前胃泌素，治疗的副作用被消除。在本发明的另一个实施方案中，前胃泌素诱导阻遏ICAT的抑制剂是PI3K的抑制剂。PI3K的抑制剂是公知的。LY29權2、渥曼青霉素和栎精是通常使用的PI3K的抑制剂。例如US2006058321和WO2004052373,公开了PI3K的抑制剂族。反义、RNAi分子、PI3K的显性负相(dominant-negative)形式、抗PI3K抗体、其生物活性片段和衍生物也可以被用作PI3K的抑制剂。在本发明的另一个实施方案中，前胃泌素诱导阻遏ICAT的抑制剂是ILK的抑制剂。ILK的抑制剂是公知的。KP-392和QLT-0267是通常使用的ILK的抑制剂。例如，在US6214813中描述了ILK的小分子抑制剂。在US6177273中描述了ILK的反义抑制剂。RNAi分子、ILK的显性负相形式和抗ILK抗体、其生物活性片段和衍生物也可以被用作ILK的抑制剂。典型地，本发明的药物包含前胃泌素诱导阻遏(3-连接素与Tcf-4结合的抑制剂(ICAT)的抑制剂，和药学上可接受的载体。本领域内的技术人员知道适合的载体。用于通过任何期望的途径给药的适合的制剂可以通过标准方法制备，例如通过参考公知的文献，如Remington;TheScienceandPracticeofPharmacy(雷明顿，药物科学和实践)。在本发明另一个实施方案中，提供用于筛选化合物的方法，所述化合物用于治疗和/或预防缘于(3-连接素/Tcf-4-介导的转录通路是组成性激活的前胃泌素分泌细胞的结直肠癌、腺瘤性息肉病或转移，包括如下步骤a)提供[3-连接素/Tcf-4-介导的转录通路是组成性激活的前胃泌素分泌细力包；和b)添加欲被筛选的化合物；和c)选4奪诱导ICAT表达的化合物。在本发明一可选实施方案中，提供用于筛选化合物的方法，所迷化合物用于治疗和/或预防缘于p-连接素/Tcf-4-介导的转录通路是组成性激活的前胃泌素分泌细胞的结直肠癌、腺瘤性息肉病或转移，包括如下步骤a)提供前胃泌素敏感细胞；和b)将前胃泌素添加至含有所述细胞的培养基中；和c)添加欲被筛选的化合物；和d)选择诱导ICAT表达的化合物。典型地，前胃泌素分泌细胞或前胃泌素敏感细力包是结肠细胞。前胃泌素敏感细胞指当前胃泌素存在于培养基中时，(3-连接素/Tcf-4-介导的转录通路是激活的细胞。本领域内的4支术人员知道实施这些方法的标准方法。典型地，ICAT表达可以通过RT-定量PCR确定。以下，本发明将通过下述实施例以及附图被详细"i兌明。图1:在Balbc/棵鼠中前胃泌素缺失降低人CRC细胞系的肿瘤发生并抑制APCA14小鼠的肠内的原发性瘤的发展。(A)柱状图显示在SW480/pgal"和SW480/O4S7^(克隆[l]和[2],表达或不表达shRNA非敏感前胃泌素原cDNA(cPG))细胞中O^rmRNA的定量。结果被表达为在SW480/(3gal(力中发现的百分比水平(*,相比于SW480/a4S7^p<0.05,n=3)。下面的表格为由SW480/(3gal"和SW480/O467^细胞分泌的前胃泌素、甘氨酸延长型胃泌素和酰胺化胃泌素的RIA定量(pmo1/1/2411)。(B)在BALB/c棵鼠中，当皮下注射DLD-l/VO、DLD-1/ASG、SW480/O^T^—」或SW480/(3gaW细胞后，肿瘤体积随时间的发展。2克隆/细胞系(4小鼠/克隆)的平均+/-标准误，(*，相比于DLD-l/VO或SW480/卩gal(。细胞p<0.05，斯氏t检验(Student，st-test))。(C-D)3月大的APCA14小鼠用耙向鼠或荧光素酶基因的siRNA治疗两周(9只小鼠/组)。结果表达为在回肠(C)或结肠(D)中胂瘤/健康粘膜的GaW基因表达间的比率(左图)，用RT-QPCR定量。在回肠(C)和结肠(D)中，当亚曱基蓝染色后，腺瘤的数量和大小被定量，并且表达为每个尺寸组的肿瘤的总数(右图)。siRNA未能降低有大量肠瘤的小鼠中收集的样品A(C)中的GflW基因表达的水平。"B，，和"C，，分别对应于未患有任何结肠或回肠肿瘤的小鼠(D)。图2.前胃泌素刺激人CRC细胞中的p-连接素/Tcf-4活性。(A)用TOP/FOP荧光素酶报告基因分析(Morin等人，1997)在未处理的SW480/(3gal(-)和SW480/O467^细胞(克隆[l]和[2])(黑柱)，或在用5nM重组前胃泌素处理72h的相同细胞(rPG,浅灰柱)或用shRNA非敏感前胃泌素原cDNA转染的相同细胞(cPG，深灰柱)中定量Tcf-4转录活性。值为四个类似试验的平均士标准误(*,相比于SW480/GAS7^细胞p<0.05)。Tcf-4和脱磷酸(3-连接素的水平在所有这些细胞中是类似的，如图S2所示。(B)用或未用5nM前胃泌素处理72h的SW480/pgaP细J包禾口SW480/GAS7^细胞中的(3-连接素(绿)、Tcf-4(红)和DAPI(蓝)的单独或^隻盖共焦图像。对前胃泌素处理的细胞应用较高的放大倍数以提供部分逆转的更好的可见度。(C)SW480/O4S7^克隆[l]和[2]如A处理或不处理。肌动蛋白和由Tcf-4靶基因c-Myc、细胞周期蛋白-Dl、Sox-9和CLDN1编码的蛋白质的表达水平通过免疫印迹法定量，用SW480/(3galW细胞作为对照(也见附图S3中的mRNA表达)。值(用作为内参的肌动蛋白作为标准)为三个独立试验的平均士标准误。斯氏t检验，相比于SW480/O4ST^细胞p<0.05(*)。图3.前胃泌素在体外和体内下调ICAT表达。(A-B)前胃泌素缺失的SW480/O457^细胞(克隆[l]和[2])被或未被密码子优化的、shRNA非敏感的前胃泌素原cDNA(cPG)转染。而后ICATmRNA水平相比于SW480/pgal"细胞用RT-QPCR定量(A)，在用cPG瞬时转染前(浅灰柱)或后(灰柱)，相比于SW480/(3-gal"(黑柱)，在SW480/04X1^中ICAT蛋白质的表达用免疫印迹法分析(B)。(C)在由显示前胃泌素的肠特异性过量表达的小鼠(Tg/Tg)的结肠上皮得到的组织切片中(Cobb等人，2004),以及在)中，通过免疫组织化学和荧光免疫染色分析ICAT表达。条代表40[im。图4.ICAT重新表达响应于前胃泌素缺失的CRC细胞中的p-连接素-Tcf-4活性。(A)上图探测源自SW480/卩gal。和SW480/G^ST^+/-重组前胃泌素(rPG，5nM，72h)的脱磷酸(3-连接素免疫沉淀反应的脱磷酸p-连接素、Tcf-4和ICAT。下图，在2个独立克隆中进行的3个类似试验的定量(相比于SW480/卩gal。和SW480/O4S7^,分别为##p<0.01和*口<0.05，斯氏t检验)。(B)在用或未用5nM前胃泌素处理72h的SW480/PgaP细胞和SW480/O45T^细胞中的p-连接素、ICAT和DAPI的单独或覆盖共焦图像。条代表40(im。(C-D)在SW480/O457^/Luc"和SW480/0^7^/ICATW细胞中用或未用shRNA非敏感ICATcDNA(+cICAT)的再表达进行Tcf-4焚光素酶报告基因分析(TOP/FOP)(C)和c-Myc(上)与细胞周期蛋白Dl(下)mRNA和蛋白质的定量(D)。图5.在鼠和人肿瘤中，ICAT表达与前胃泌素水平和p-连接素-Tcf-4耙基因表达呈反相关性。(A)3月大APCA14小鼠用靶向鼠GAST基因或荧光素酶基因的siRNA处理两周，如图1。对肠腺瘤进行RNA提取，相对于由相同动物0=5)的匹配上皮(Ep)中的表达，ICATmRNA表达^皮定量(Ad)。(B)Tcf-4目标细胞周期蛋白Dl、CD44和C-Myc的表达用源自相同动物的腺瘤(Ad)和肉眼可见的完整上皮(Ep)中的蛋白质免疫印迹法分析，相比于源自相同基因背景的对照小鼠的肠上皮(见附图S5的定量)。(C)源自用丄wc或04Sr特异性siRNA处理的APCA14动物的腺瘤被石蜡包埋并进行c-Myc和ICAT的免疫组织化学检测。由回肠中收集的GAST^和丄wc—腺瘤提供代表性图像。条表示20pm。(D)在23名CRC患者的显微解剖的肿瘤(黑柱)中的GAST和/C4rmRNA表达，表示为相对于其各自匹配的健康上皮(白柱)中发现的量，其被标准化为每个患者为1。值为三个独立实验的平均is.e.m。插图在其回归曲线和其置信区间内，GAST和/C4r表达的对数值彼此作图。斯皮尔曼(Spearman)相关系数(r)以其显著性程度(p)被提供。(E)上图在健康(H)或源自4名CRC患者的肿瘤(T)样品的前胃泌素免疫印迹(IB)。下图具有或高(患者4)或低(患者22)的肿瘤前胃泌素表达的患者的ICAT、c-Myc、claudin-l和CD44的代表性免疫组织化学(IHC)(在WB中阳性对照为重组前胃泌素(rPG);阳性对照的曝光时间为20秒，人体样品的曝光时间为10分钟)。类似的IB和IHC结果由11名受试患者的样品得到。条代表20iim。图6.ICAT的阻遏对人CRC细胞中的前胃泌素的肿瘤促进作用是必要的。(A)上图ICAT的下调逆转软琼脂中前胃泌素缺失的细胞的下降的生长率，如由SW480/卩ga1。、SW480/G^ST^、SW480/GAS7^/ICAT(-)和SW480/GAS卢/LucO细胞间的集落大小的显著差别所示。下图3个类似的试验的定量，表达为每个克隆十个随机选择区域的平均士标准误。(B)SW480/O45T^/Luc(-)和SW480/O4S/力ICAT"细胞被注射进BALB/c棵鼠的后腿中，定期测量肺瘤生长。4个克隆的平均土标准误，每个*为相比于SW480/O4S7^/Luc(。细胞p<0.05,斯氏t检验。图7.PI3k/ILK通路的激活对由前胃泌素的ICAT阻遏是必要的。(A)PBk激活对人CRC细胞中的前胃泌素诱导的ICAT阻遏是必要的。ICATmRNA表达如前述测量(左)，在用或不用5nM前胃泌素(PG)和/或PI3激酶抑制剂LY-294002(LY)处理的SW480/卩gal(—)和SW480/O^7^细胞中通过蛋白质印迹分析Akt/PKB的磷酸化(右)，如所示的。(B)ILK表达和活性在前胃泌素缺失的人CRC细胞中被降低。上图，ILK表达(蛋白质印迹)和酶活性(体外髓磷脂碱性蛋白(MBP)的磷酸化)在源自用或未用重组前胃泌素处理(5nM，72h)的SW480/(3galW和SW480/GAS7^细胞裂解产物的ILK免疫沉淀反应后进行分析。中图显示ILK活性的定量，在校正上述细胞中的ILK表达的变化后在三个独立的试验中进行。在下图中，ILK目标(31-整合素的磷酸化通过用抗磷酸丝氨酸抗体和抗pi-整合素抗体顺序探测(31-整合素免疫沉淀反应进行分析。当裂解产物用免疫前兔血浆免疫沉淀反应时，ILK、卩l-整合素和MBP磷酸化从不被^r测(未显示)。(C)ILK激活对人CRC细胞中前胃泌素介导的ICAT阻遏是必要的。ICATmRNA的表达(左图)和Ser473上的Akt/PKB的磷酸化(右图)在用或未用显性负相ILK(AN-ILK)转染的、和如所示的用或未用5nM外源前胃泌素处理的SW480/(3galO和SW480/G^S7^细胞中定量。对所有的图，相比于SW480/卩gal(-)(#)、SW480/GAS卢(*)、或前胃泌素处理的SW480/GAST^(。)会田月包，p<0.05。图8.前胃泌素缺失在体外诱导人CRC细胞分化和凋亡并在体内促进APCA14小鼠的肠内肿瘤分化。(A)在SW480/O46T^而不在SW480/(3galW细胞的两个克隆中显示PTEN的核定位的代表性实验。(B)在SW480细胞中，用耙向GASr或(3-半乳糖芬酶的siRNA转染48h后的Muc-2、肠碱性磷酸酶(ALP)、和嗜铬粒蛋白A(CgA)mRNA表达的定量。(C)在SW480CRC细胞中，当用GU5T特异性而非(3-半乳糖苷酶特异性的siRNA瞬时转染后的Muc-2表达和半胱天冬酶(caspase)-3激活。用靶向04Sr(箭)或(3-半乳糖苷酶(箭头)的若丹明标记的siRNA(红色)转染细胞，并用或未用5nM重组前胃泌素处理。Muc-2表达(A488，绿)和激活的半胱天冬酶-3(Cy-5，在此用红色表示)用焚光免疫染色法检测，细胞核用DAPI染色(蓝色)。用DLD-1细胞得到类似的结果。条表示20|1111。(D)3月大APCA14小鼠用靶向鼠04ST基因或荧光素酶基因的siRNA处理两周，如图1中的。肠腺瘤被石蜡包埋并进行产粘液细胞(Muc2和阿辛蓝(Alcianblue))和参与凋亡通路的细胞(激活的半胱天冬酶3,黑箭头)的免疫组织化学检测。由回肠中收集的04S7^和丄wc—腺瘤提供代表性图像。条表示20)im。图9.将前胃泌素缺失与在APC突变的结直肠癌细胞中的p-连接素/Tcf-4转录复合体的降低的激活连接的信号转导通路。(A)CRC细胞产生和分泌内生前胃泌素，其随后作用在肿瘤细胞上以激活PI3激酶和ILK,从而诱导ICAT阻遏和促进由APC突变引发的P-连接素/Tcf-4转录活性的放大。该过程引起靶基因如编码前胃泌素的基因的最大转录，因此产生自我放大激活环。(B)前胃泌素作用的抑制，例如通过GAST基因的siRNA沉默诱导(O)，显著降低PL3激酶和ILK的活性(②)，引起ICAT的强上调(③)。这个小抑制剂与Tcf-4对{3-连接素结合竟争足以强下调肺瘤细胞中Tcf-4靶基因的转录(④)。图10.增加的抗原浓度如所示的被涂在96孔板上(详细的，参照"方法"部分)，而后用选择性抗前胃泌素(1-80)的N-端(上图)或C-端(下图)末端的抗体卵享育。受试的抗原是用于产生抗体(上图SWKPRSQQPDAPLGT,下图FGRRSAEDEN)、酰胺化胃泌素17、甘氨酸延长型胃泌素17、前胃泌素的C端侧肽(SAEDEN)、和钥孔血蓝蛋白(KLH)的初始免疫原，其在免疫过程期间被用作载体蛋白。当用二级抗体和OPD底物孵育后，结果表示为492nm直接读数。图11.SW480结直肠癌细胞用对照抗体或直接抗前胃泌素的C端或N端末端的抗体(1/5000稀释)处理30小时，如方法部分中所述。细胞裂解后，ICAT、c-Myc和细胞周期蛋白Dl的mRNA表达用RT-qPCR定量。结果表示为在用C端(灰柱)或N端(白柱)前胃泌素抗体处理的细胞和用对照抗体处理的细胞中的表达间的比率，其中每个基因表达水平被定为1的值(在此用横轴表示)。图Sl.用对鼠045T基因选择性的siRNA处理两周后，前胃泌素在APqA14小鼠的腺瘤中的过量表达和促炎症反应的缺乏。(A)在健康肠粘膜和3.5月大APCA14小鼠的腺瘤中的酰胺化和甘氨酸延长型胃泌素水平，用放射性免疫分析定量。(B)在健康肠粘膜和用Lmc或045T基因特异性siRNA处理的3.5月大APCA14小鼠中的腺瘤蛋白提取物(50吗)中的代表性前胃泌素免疫印迹，相比于相同基因背景的对照'』、鼠(NoRIA普遍可用于定量鼠前胃泌素)。胶片被曝光30min。柱状图，在每组4个动物的结肠和回肠中收集的腺瘤中的PG的定量，表示为相对于C57/BL6动物的结肠和回肠。(对于每个肠片段，相比于C57/BL6#或APCA14Lwc"*中各自的值，p<0.05)。(C)Colo-26鼠CRC细胞和年青小鼠结肠(YAMC)细胞用直接抗鼠(m04SrsiRNA)或人(hGL45TsiRNA)046T序列的siRNA转染，046JmRNA的表达用RT-QPCR定量。(D)总结了用丄w或GASTsiRNA处理的小鼠中的血浆IL-6(黑)和TNFa(白)的水平的散点图。在所述两组间未观测到显著差异，其中两者的细胞因子的水平都反映炎症的缺乏。图S2.前胃泌素，而非酰胺化或甘氨酸延长型胃泌素，刺激CRC细胞中的P-连接素/Tcf-4转录活性。(A)(上图)Tcf-4转录活性用TOP/FOP荧光素酶报告基因分析(31)在DLD-l/VO、DLD-1/ASG(克隆[1]和[2])、SW480/卩gal(-)和SW480/GAST(-)(克隆[1]和[2])细胞中定量。值为4个类似实验的平均土标准误。脱磷酸(3-连接素(中图)和Tcf-4(下图)的水平在所有这些细胞系中是类似的，如通过免疫印迹所示的(用肌动蛋白作为上样对照)。(B)人酰胺化胃泌素(CCK-B)受体mRNA通过RT-PCR在源自用CCK-B受体构建体转染的COS-7细胞的样品中检测，而未在DLD-1和SW480细胞中或在阴性对照(没有逆转录的COS-7/CCK-B)中检测。图S3.Tcf-4乾基因c-Myc、细胞周期蛋白Dl、Sox-9和CLDN1的mRNA表达私CRC细胞中的前胃泌素调控。SW480/O^卢克隆[l]和[2]用5nM前胃泌素(rPG)处理72h或者用密码子优化的、shRNA非敏感前胃泌素原cDNA(cPG)转染。Tcf-4靶c-Myc、细l包周期蛋白Dl、Sox9和claudin-l(—列Tcf-4靶基因可用于(9))的mRNA表达用RT-QPCR定量，使用SW480/(3galW细胞作为对照。值为三个独立实验的平均士标准误。斯氏t检验，相比于SW480/GAS7^)细胞p<0.05(*)。图S4.CRC细胞中的ICAT表达的实^节。ICATmRNA(A)和蛋白质水平(B)在用或未用对照shRNA(SW480/O^7^/Luc",灰柱)或对ICAT选择性的shRNA(SW480/GAS7^/ICATO细胞，黑柱)转染的前胃泌素缺失的CRC细胞(SW480/O4S7^，白柱)的两个克隆中定量，以及在用密码子优化的、shRNA非4文感的ICATcDNA(+c.ICAT)瞬时转染的SW480/G"AS7^)/ICAT(-)细胞中定量(深灰柱)。(相比于SW480/GAS7^)/Luc(-)")，或相比于SW480/Gy^7^/ICAT(-)(#)p<0.05，斯氏t检验，n=3)图S5.源自APCA14小鼠的肠腺瘤中的Tcf-4把基因的升高的表#靶向前胃泌素的siRNA处理后被降低。3月大的APCA14小鼠用靶向鼠a^r基因或荧光素酶基因的siRNA治疗两周，如图i。对肠腺瘤进行蛋白质提取，Tcf-4靶细胞周期蛋白Dl(上)、c-Myc(中)和CD"(下)的表达在源自相同动物的腺瘤(Ad)和肉眼可见的完整上皮(Ep)中的蛋白质免疫印迹后被定量，相比于源自相同基因背景的对照小鼠的肠上皮(代表性免疫印迹在图5B中显示)。值表示为4只动物/组的腺瘤的平均土sem。对每个肠片段，相比于C57/BL6-或APCA14Z^c"*中各自的值p〈0.05。图S6.用于结肠样品的激光捕获显孩i切割的患者群。(A)激光捕获显微切割前(初始的)和后(显微切割的)，典型的健康和肿瘤结肠组织的代表性显微照片。(B)用于确定GAST和/C4r基因表达水平的患者群的特征，包括依据TNM分类的其肺瘤的病理评分。肿瘤定位表示为PC(近侧结肠)、MC(中间结肠)、DC(末端结肠)、乙状结肠、或直肠。提供了手术时的转移(MS)、后期的转移(M)、和死亡患者(DC)，以下列代码(0:否；1:是)图S7.P13k抑制SW480/pgal"细胞中Tcf-4转录活性的药理学抑制作用。SW480/pgalW细胞用或未用10pMLY294002处理，Tcf-4活性如上所述被定量。值为三个独立实验的平均士标准误。斯氏U企验，相比于未处理的SW480/Pgal。细胞p<0.05(*)。实施例实施例1在下述说明中，所有未给出详细实验方案的分子生物学实验依据标准实验方案进行。概述背景和目的p-连接素/Tcf-4转录复合体的异常激活表示结直肠癌发生的起始事件，在结肠隐窝中将平衡由分化转变为增殖。在此，我们评估被所述复合体的靶基因编码的内生前胃泌素是否接着能调控APC突变的细胞中的(3-连接素/Tcf-4活性，我们分析了局部前胃泌素缺失对体内肠肺瘤生长的影响。方法GAST基因的永久或暂时RNA沉默在人肿瘤细胞和携带杂合Apc突变(APCA14)的小鼠中被诱导，其过量表达前胃泌素而不是酰胺化或甘氨酸延长型胃泌素。结果通过对肿瘤细胞中的组成性(3-连接素/Tcf-4活性的显著抑制，内生前胃泌素产物的缺失强烈降低体内肠肿瘤生长。所述效果被P-连接素和Tcf-4的抑制剂(ICAT)的重新表达介导，其源自前胃泌素缺失的细胞中的整合素连接激酶(ILK)的下调。因此，ICAT下调与前胃泌素过量表达和人结直肠肿瘤中的Tcf-4靶基因激活相关，在有肿瘤倾向的、前胃泌素过量表达的小鼠的结肠上皮中检测ICAT阻遏。在APCA14小鼠中，siRNA介导的前胃泌素缺失不仅降低了肠肿瘤的大小和数量，而且增加了保留腺瘤中的杯状细胞谱系分化和细胞凋亡。结论:因此，内生前胃泌素的缺失通过促进ICAT表达而在体内抑制APC突变的CRC细胞的肿瘤发生，因此抵消了Tcf-4的活性。前胃泌素把向策略提供结直肠癌的分化治疗的令人兴奋的前景。介绍近年来，针对通过诱导肿瘤细胞分化降低肿瘤发展的各种策略已经被开发，在动物模型和人类患者中提供了非常有前途的结果。特别的，全反式视黄酸的应用已经证明在急性早幼粒细胞白血病的治疗中非常有用(Lallemand-breitenbach等人，2005;wang和chen，2000)，被认为是在促使晚期曱状腺癌中的肿瘤分化上有前途的方法(Coelho等人，2005)。在肠道中，在调节两个主要的涉及细胞增殖和分化的控制的通路的药剂已经被寄予巨大期望，即Notch级联和Wnt/卩-连接素/Tcf-4通路(Radtke和Clevers，2005;vanES和Clevers，2005)。然而，由于Notch和Wnt激活之间的调整的相互作用对肠隐窝的稳态是必要的，针对直接靶向结肠肿瘤中的这些信号转导通路的方法可能对全部肠道生理有反作用。理想地，此类策略将大大受益于识别目标的能力，所述目标在肿瘤细胞中被选择性激活，或被强烈刺激，而在周围组织中缺乏或未被激活。在肠肿瘤细胞中被特异性激活的目标中，部分处理的胃泌素基因(GAS7)产物，如甘氨酸延长型胃泌素和前胃泌素，为肺瘤生长的选择性靶向提供令人兴奋的前景。实际上，GAST基因本身是Tcf-4和K-Ras的目标(Chakladar等人，2005;Koh等人，2000),在结直肠癌中常常被激活并起协同作用的两个通路(Janssen等人，2006)，以及这些GAST衍生的肽似乎通过肿瘤细胞上的自分泌/副分泌环刺激增殖(Hollande等人，1997;Hollande等人，2003)。Ggly的增殖效果在最近几年被发现(Seva等人，1994)以及更近的，前胃泌素显示刺激增殖(Ottewdl等人，2005;Singh等人，2000)并调节上皮细胞/细胞粘着和迁移(Hollande等人，2003;Hollande等人，2005)。另外，用具有G^5T基因的靶向删除的动物实验出现不一致结果。实际上，所述删除强烈增强了由化学致癌物，氧化偶氮曱烷，诱导的肿瘤发生(Cobb等人，2002)，反之，其引起APC+^in小鼠的基因背景中的息肉数量的下降(Koh等人，2000)。然而，所述文献提供很少有关治疗消弱这些肽减慢或逆转先前存在的肺瘤的生长的功能的潜力的信息。关键是，前胃泌素以显著量由几乎80%的人结直肠肺瘤和肿瘤细胞系产生和分泌，而其分泌在生理状态下基本上降至检测水平之下(Ciccotosto等人，1995;Konturek等人，2002;Siddheshwar等人，2001;VanSolinge等人，1993)。因此，由于Wnt信号转导通路的组成性激活代表散发性CRC，以及腺瘤性息肉病的遗传状态的特点(Fodde等人，2001),并且由于046T基因自身是Tcf-4的目标，我们研究前胃泌素是否能接着调节驱动v!PC突变的肿瘤发生，以及靶向前胃泌素是否能表示降低结直肠肿瘤的生长的相关策略。我们显示了RNA干扰介导的前胃泌素缺失能抑制由体内APC基因的突变诱导的肿瘤生长。而后我们证明所述抑制反映前胃泌素调节肿瘤细胞中的(3-连接素/Tcf-4转录活性的水平的能力，尽管其组成性激活被^PC突变引发。(3-连接素和Tcf-4结合的抑制剂(ICAT)的重新表达对抑制(3-连接素/Tcf-4转录通路和降低前胃泌素缺失的肿瘤细胞中的肿瘤发生起作用，.而ICAT的阻遏在前胃泌素过量表达小鼠结肠粘膜、和在人体和小鼠肠肿瘤中被发现。最后，用GAST特异性siRNA治疗，不仅将体外的人体CRC细胞，而且将携带j/c基因的杂合突变的d、鼠的前胃泌素分泌肠腺瘤向杯状细胞谱系的终末分化诱导。结果#f泌,凝关逆脊由谬/^M尸C臾宽谬寻^^f4长为评估针对先前存在的肿瘤中的选择性靶向内生前胃泌素的策略是否能拮抗体内Tcf-4促进的肿瘤生长，我们使用源自结直肠细胞系SW480的Balbc/棵鼠异种移植物(Morin等人，1997)，以及原发性肠肿瘤发生的小鼠模型，APCA14(Colnot等人，2004)。类似于在大多数人体结直肠肿瘤中发现的(Korinek等人，1997)，所述两个实验模型具有APC突变和因此显示(3-连接素/Tcf-4通路的组成性激活。对照SW480/pgaP和DLD-l/VO细胞显示出表达高前胃泌素水平但是只有很少酰胺化和甘氨酸延长型的胃泌素(表1)。在Balbc/棵鼠中经过7周的皮下注射，所述细胞产生巨大肿瘤(图1B)。相反，当前胃泌素分泌被直接抗基因的短发卡RNA(shRNA)的稳定表达下调时，在同样时间间隔内形成肿瘤的能力被大大降低(SW480/ySO4S7^细胞。图1A-B)。注射前述的(Hollande等人，2003)特征为表达反义GU5T基因cDNA的DLD-1结直肠癌细胞后，得到类似的结果(图1B)。表l:<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>接着，我们证明了用APCA14小鼠在与病理学更相关的环境中，前胃泌素抑制降低了先前存在的肠肿瘤的生长。这些动物具有类似于在人类家族性腺瘤性息肉病和散发性结直肠癌患者中发现的Jpc基因的截短的突变。它们也部分概括了在这些患者中发现的肠道上皮细胞显型，由于它们在回肠中发展原发性肺瘤，而且比APCmin+〃模型有更多结肠肿瘤(Colnot等人，2004)。三月大^PCA14小鼠常常在回肠和结肠中显示多个腺瘤(数据未显示)，前胃泌素水平，而不是酰胺化或甘氨酸延长型胃泌素的那些，被发现在这些腺瘤中升高(图Sl)。因此这些动物提供给我们理想的体内模型以特定地研究前胃泌素调节Tcf-4促进的肿瘤生长的作用。用直接抗鼠基因的siRNA(JPCA14/a^7^)进行两周的每日治疗，之前显示对小鼠细胞有效(图Sl),其诱导肠腺瘤中GL46T基因和前胃泌素表达的降低，相比于在用荧光素酶特异性siRNA(APCA14/丄")治疗后发现的(图1C-D，以及S1)。与降低046T表达相关，肿瘤大小的显著降低在APCA14/OiS7^动物的肠内被发现，相比于对照(卡方(Chi隱squareJ,p<0.0001，每组n=9)。所述降低在回肠中特别显著(图1C)，但是类似的趋势在结肠中是明显的，尽管由于位于所述区域的肺瘤的量较少的原因而未达到显著(费希尔(Fischer's)精确试验，p^.228)(图1D)。另外，在肠肿瘤的总数的20%降低在全部APCA14/O^T^小鼠中被发现，相比于对照动物。特别的，所述降低在APCA14/0457^组的两个动物中是剧烈的，在此回肠或结肠被发现无肿瘤。相反，GAST特异性siRNA治疗不能下调相同组的一只小鼠的GAST基因水平，所述动物显示与对照组中发现的那些类似的肿瘤数量和大小(图1C)。因此，尽管siRNA介导的前胃泌素产生的下调效率在APCA14/04S7^动物间有变化，在显示降低的前胃泌素水平的小鼠中，肿瘤大'J、和数量恒定下降。总之，这些结果显示，前胃泌素分泌对APC突变的人CRC细胞的肿瘤发生是必要的，以及在体内抑制前胃泌素产生的治疗强烈降低概括早期腺瘤性息肉病和人体结直肠癌发生的小鼠模型中的肿瘤生长。^T必^谬芦爿PC克赏^#^^叙逸尹#/-遂凝#/化/一脊虞活無水乎由于我们显示了靶向前胃泌素抑制了两个不同突变的肠肿瘤模型中的肺瘤生长，我们假定所述效果是由于前胃泌素调节P-连接素/Tcf-4转录复合体的活性水平的能力，其已知被J尸C突变组成性激活。所述活性，通过荧光素酶报告基因的转录(TOP/FOP)被定量(Korinek等，1997)，在对照细胞(SW480/(3gal")中实际上升，但在前胃泌素缺失的克隆中被显著抑制(图2A),没有(3-连接素或Tcf-4水平的可发现的调节(图S2)。在之前建立的(Hollande等人，2003)表达反义04STcDNA的DLD-1细胞中得到类似的结果(图S2)。用5nM重组前胃泌素治疗，以及用通过在SW480/O^7^克隆中的密码子优化的、shRNA非敏感的前胃泌素原构建体的表达产生的内生前胃泌素治疗，我们发现荧光素酶报告基因的转录恢复很强的水平，证实前胃泌素能刺激所述转录通路(图2A)。另外，荧光免疫染色显示与SW480/GAS7^细胞中的Tcf-4和脱磷酸(3-连接素的细胞核数量的显著降低相关的p-连接素/Tcf-4活性的降低，所述细胞用5nM重组前胃泌素的治疗部分地恢复(3-连接素和Tcf-4的核间隔化(图2B)。类似的，一些Tcf-4耙基因(c-myc、细胞周期蛋白Dl、Sox-9和claudin-l)的表达(Blache等人，2004;vandeWetering等人，2002)在前胃泌素缺失后被强烈下调，并被前胃泌素的重表达或用重组肽治疗显著刺激(图2C和S3)。相反，用酰胺化或甘氨酸延长型胃泌素17、或用酰胺化胃泌素(CCK-B)受体拮抗剂L365、260治疗，不影响所述细胞中的(3-连接素/Tcf-4活性(图S2)，表明胃泌素的简短处理形式不能模拟所述细胞中的前胃泌素对(3-连接素/Tcf-4活性的调节。上述数据清晰地证明，由SW480CRC细胞产生的前胃泌素刺激(3-连接素/Tcf-4复合体的活性。其也显示阻断前胃泌素产生导致所述转录通路的强抑制，尽管」户C突变的细胞中其的组成性激活。/-遂接#和化/-￥^^斧/浙aC47^C遞过^T泌^介爭/-遽凝,/Tc/"承^^錄，种#子矛^。由于所用的CRC细胞中爿尸C基因的突变状态，以及由于Tcf-4和(3-连接素的核间隔化在前胃泌素缺失的细胞中被显著改变(图2A)，我们假定降低的P-连接素/Tcf-4活性是由于(3-连接素与另一个其伙伴的相互作用的增加引起的。所述伙伴之一，ICAT((3-连接素和Tcf-4的抑制剂)，近来被认为是这两种蛋白间结合的直接抑制剂(Tago等人，2000)，并且当在DLD-1和SW480细胞中过量表达时，响应于降^^的增殖和上升的细胞死亡(Sekiya等人，2002)。前胃泌素减少诱导SW480/O4S7^细胞中的ICATmRNA和蛋白质的强烈表达(图3A和B)，而另一个|3-连接素的接合伙伴，上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)的表达未受影响(数据未显示)。ICAT的重新阻遏被shRNA非敏感前胃泌素原cDNA的重表达诱导(图3A和B)，以及当用5nM重组前胃泌素治疗后被诱导(数据未显示)。另外，相比于在其野生型同窝出生者中发现的，ICAT表达在显示人前胃泌素的组织特异性肠过量表达(Tg/Tg)的转基因小鼠(Cobb等人，2004)的结肠上皮中弱的多(图3C)。由于用所述小鼠表达的前胃泌素是突变的并因而对加工酶不敏感(Cobb等人，2004)，该结果证明全长前胃泌素也能下调体内的ICAT表达。因此，内生前胃泌素能阻遏体外和体内的ICAT表达，CRC细胞中的前胃泌素减少足以诱导所述抑制剂的强重新表达。因此，我们研究了ICAT是否真的是涉及CRC细胞中的前胃泌素调节(3-连接素/Tcf-4的分子目标。应用免疫共沉淀，我们发现前胃泌素缺失的SW480/G^S7^细胞中的脱磷酸(3-连接素和ICAT间的结合显著增加(图4A),平行出现这两个蛋白的细胞质共定位(图4B)。相反，Tcf-4与脱磷酸(3-连接素的免疫共沉淀的量相比于SW480/(3-g"/W显著降低(图4A)。接着，当用重组前胃泌素处理SW480/O4S7^细胞后，p-连接素被再次优选与Tcf-4接合，而与ICAT的接合以及两个蛋白质的定位被降低(图4A-B)。为了确定前胃泌素缺失的细胞中的ICAT重表达是对p-连接素/Tcf-4转录活性的抑制的功能响应，我们应用逆转录酶病毒驱动的shRNA表达，实验性地防止SW480/GAS7^细胞中的ICATmRNA和蛋白质的重新表达(图S4)。我们发现，P-连接素/Tcf-4转录复合体的激活在得到的SW480/O457^/ICATW细胞中被恢复(图4C),其也显示增加的Tcf-4靶基因表达(图4D)。接着，所述增加通过SW480/GU57^/ICAT"细胞中的密码子优选形式的ICATcDNA的过量表达被防止(图4C、4D和S4)，证明在该过程中ICAT的特异性。所述结果表明，ICAT表达水平的调节是前胃泌素调节(3cat/Tcf-4活性的主要分子事件。在体内，低ICAT水平(图5A和5C)以及Tcf-4靶基因的高表达(图5B-C，和图S5)在APCA14动物的前胃泌素过量表达肠肿瘤中被发现。相反，ICAT表达在由用0457^特异性siRNA治疗的小鼠中收集的腺瘤中显著增加(图5A-C)，伴随Tcf-4靶基因的强阻遏。令人感兴趣的是，当相比于GAS7^动物时，在APCA14/丄i/^M、鼠的肉眼可见健康上皮中的细胞周期蛋白D1、c-Myc和CD44的表达被发现上升，表明单个4^等位基因的突变足以部分地增加APCA14肠中的靶基因表达，前胃泌素减少对降低所述癌症前期调节中的Tcf-4活性已经有效(图5B和图S5)。另夕卜，由23名患有CRC的患者得到的显微切割人结肠肿瘤以及匹配的健康样品中的mRNA水平在78%的被研究患者(18/23)的肿瘤中不同程度的增加(图5D,上图)，而ICAT表达在相应的肿瘤样品中被下调(图5D,下图)。在全部增加的a45T基因表达和ICAT阻遏间发现显著的统计相关性(斯皮尔曼相关系数r=-0.46,p=0.027)，确证体内的ICAT的前胃泌素诱导阻遏的相关性(图5D,插图)。该相关性通过源自低(例如患者22)或高(例如患者4)前胃泌素表达的患者的样品的免疫组织化学被证实，显示ICAT被阻遏，在表达高前胃泌素水平的肿瘤中对Tcf-4靶基因的免疫反应性增强，而这些表达模式在具有低前胃泌素的肿瘤中被逆转(图5E)。在源自全部11名用免疫组织化学测试的患者的CRC样品中得到类似结果，所述相关性反映了体外观察到的ICAT水平和p-连接素/Tcf-4活性之间的反相关性。总之，这些结果证明，尽管J户C突变的细胞中p-连接素/Tcf-4复合体的组成性激活，所述通路的活性能通过体内或体外的抑制剂ICAT的重表达用前胃泌素减少抑制。就我们所知，这些结果也提供ICAT的激素调节的第一次证明，其为在先描述为肿瘤抑制基因(Daniels和Weis,2002)的卩-连接素连接Tcf-4的小型抑制剂(Tago等人，2000)。/C4r《这W徙复喊应f由oc叙敏f的;T眾泌,减,渗导的摩询^^掀'生由于结肠胂瘤发生中的f3-连接素/Tcf-4转录活性的组成性激活起的基本作用，以及由于我们的结果表明ICAT重表达响应于前胃泌素缺失的肿瘤细胞中的降低的Tcf-4介导的转录，我们还研究了ICAT阻遏作为前胃泌素的肺瘤促进活性的基本成分在体外和体内的作用。在体外，ICAT在SW480/O457^/ICATW细胞中重表达的抑制被发现增强了其在软琼脂生长分析中的非停泊性生长的能力，达到类似于在SW480/f3-Gal"细胞中发现的水平(图6A)。在体内，在BALB/c棵鼠中注射后，SW480/O4S7^/ICAT(-)细胞形成肿瘤的能力比SW480/O4S7^/Luc(-)细胞高很多(图6B),类似于SW480/p-Gal"细胞C见图1B)。总之，这些结果清晰地证明，源自CRC细胞中的内生前胃泌素的ICAT的阻遏对所述激素原的胂瘤促进活性起作用。关键是，其也显示由前胃泌素减少诱导的ICAT重新表达足够强以诱导P-连接素/Tcf-4活性的显著抑制，并从而降低体外和体内的肿瘤生长。整合,遽接激雜时褲腐乾然殍3-浚雜介导^浚话喊应^由f;^眾必,W/C471/^遽希/-遂疾,/7b/"遞蕃谬,。由于前胃泌素近来被显示在体外(Hollande等人，2003)和体内(Ferrand等人，2005)激活肠细胞中的磷脂酰肌醇3-激酶(PBK)通路，我们测定该酶的激活是否对SW480细胞中的前胃泌素诱导的ICAT阻遏和p-连接素/Tcf-4活性的刺激是否是必要的。首先，我们发现用选择性PI3k抑制剂LY294002孵育SW480/pgalW细胞足以诱导ICAT的表达(图7A),并降低卩-连接素/Tcf-4转录活性(图S7)，因此揭示了先前未知的所述两种通路间的联系。相反，分别用10(iMPP2或1|iMPD98059对Src或ERK1/2通路的药理学抑制，不会影响ICAT表达或P-连接素/Tcf-4活性(数据未显示)。另外，LY294002消除了用重组前胃泌素治疗SW480/GAS7^克隆诱导的ICAT下调(图7A)，显示P13k激活对前胃泌素的ICAT阻遏是必要的。因此，Akt/PKB的丝氨酸473-磷酸化，一种PI3k的下游目标，在前胃泌素缺失的SW480/O457^细胞中显著降低，但是在用5nM重组前胃泌素孵育后被恢复(图7A)。Akt/PKB的Ser473已知是整合素连接激酶(ILK)的直接磷酸化目标(Delcommenne等人，1998)。为了确定ILK激活是否是前胃泌素和ICAT的阻遏之间的遗漏的分子连接，我们首先评估了ILK的表达和/或活性是否被SW480细胞中的前胃泌素调节。ILK的表达和活性在SW480/O^ST^细胞中都显著降H该抑制在用5nM重组前胃泌素处理后被部分逆转(图7B)。这些结果由显示整合素pi的丝氨酸磷酸化中剧烈下降的数据确证，其为SW480/a467^克隆中的一个下游目标(Mulrooney等人，2000)(图7B)。另夕卜，我们发现，显性负相ILK(DN-ILK)的瞬时表达，其被确定阻遏Akt/PKB磷酸化，能诱导SW480/(3gal。细胞中的ICAT表达(图7C)，表明该酶涉及调控ICAT基因表达的信号转导通路。这些SW480/(3gal"/DN-ILK细胞中的P13k的药理学抑制不再增加ICAT表达，表明在ICAT基因表达的调节中，两种酶涉及相同的通路，或冗余通路(数据未显示)。而且，ICATmRNA和蛋白质的阻遏以及Akt/PKB的上升的磷酸化，其用重组前胃泌素处理前胃泌素缺失的SW480/GAS7^细胞诱导，通过ILK的显性负相介导的抑制而被预防(图7C)。相反，SW480/O4S卢细胞中的shRNA介导的ICAT阻遏(如图S4所示)不改变ILK表达或活性(数据未显示)，确定ICAT位于前胃泌素介导的信号转导的下游。这些结果清晰地证明，P13k和ILK的激活对CRC细胞中的ICAT的前胃泌素介导的阻遏起作用。粉必。由于Wnt/p-连接素/Tcf-4通路被认为对保持肠隐窝底部的细胞的干细胞/祖细胞表型是必要的，并且被普遍视为细胞增殖和分化的分子开关(Radtke和Clevers,2005;vandeWetering等人，2002)，我们接着确定在前胃泌素减少的CRC细胞中，该通路的下调是否能驱动这些细胞分化。由于其最近被描述为细胞分化的早期启动子的作用(Chung和Eng,2005)，我们首先分析了PTEN(从染色体10中删除的磷酸酶和张力蛋白同源物)在稳定的SW480/O457^克隆中的定位。与其在SW480/Pga^细胞中的主要细胞质定位明显相反，PETN基本上在SW480/GAS7^克隆的核中被发现(图8A)，被认为与其在细胞分化中的作用相关的定位(Lian和DiCristofano,2005)。由于开发稳定的前胃泌素缺失的克隆的方法被期望为选择最少分化和非凋亡的细胞，用若丹明标记的直接抗GAsr或p-半乳糖苷酶基因的siRNA寡聚核苷酸瞬时转染后，与终末分化的肠细胞谱系相关的基因表达在SW480细胞中被定量。杯状细胞特异性基因Muc-2的表达中的显著诱导在SW480/O4S7^;而不在SW480/p-galW细胞中被发现，没有可检测的编码嗜铬粒蛋白A(在肠内分泌细胞中表达)或肠上皮细胞特异性碱性磷酸酶的基因的改变(图8B)。最后，G^S7^细胞中的半胱天冬酶-3激活的发现，和对激活的半胱天冬酶-3阳性的细胞也为Muc2阳性的发现(图8C)，表明在体外促进其凋亡之前，前胃泌素减少能将CRC细胞分化成分泌谱系。用重组前胃泌素处理48小时逆转这些表型(图8C),而酰胺化和甘氨酸延长型胃泌素没有效果(未显示)。用GASr特异性siRNA低聚核苷酸转染的DLD-1细胞得到类似的结果(未显示)。因此前胃泌素减少能使CRC细胞在体外终末分化和凋亡。另外，我们设法证明体内前胃泌素水平的降低也足以诱导(3-连接素/Tcf-4通路的组成性激活诱导的肠肿瘤的分化。从用荧光素酶或a4sr特异性siRNA处理的APCA14小鼠中收集的样品的免疫组织化学(见图1)，证明相比于对照，APCA14/0457^动物的残余的小肠和结肠腺瘤显示Muc-2和阿辛蓝阳性细胞数量的大量增加(图8D)，符合在相同样品中增加ICAT表达和降低c-Myc表达(见图5A-C)。最后，虽然对激活的半胱天冬酶3染色的细胞在对照动物中非常稀少，其数量被发现在APCA14/a^7^动物的腺瘤中强烈上升(图8D)。这些结果证明，siRNA介导的G^ST基因的下调能使胂瘤细胞在体内终末分化和凋亡。APCA14小鼠发展的肠腺瘤未表达甘氨酸延长型或酰胺化型胃泌素。由于通过用产生抗重组前胃泌素的多克隆抗体免疫印迹从未发现高分子量的处理中间体，以及由于全长重组前胃泌素显示在体外调节CRC细胞分化，我们断定，在GAST特异性siRNA处理之后，肿瘤细胞分化和降低的肿瘤生长主要由于全长前胃泌素浓度的降低。讨论本发明提供证明，阻断前胃泌素的产生会显著抑制人CRC细胞的"组成性"(3-连接素/Tcf-4转录活性，降低其体外非停泊性生长以及在棵鼠中形成肿瘤的能力，并且促进其分化和凋亡。前胃泌素减少导致"P-连接素和Tcf-4的抑制剂"(ICAT)的重表达，其为一种最初在非洲蟾蜍中鉴定的并显示抑制(3-连4妄素与Tcf-4的相互作用的小肽(Gottardi和Gumbiner,2004;Tago等人，2000)。另夕卜，在基因表达已经在先被关闭的细胞中，用重组前胃泌素处理下调的ICAT和增加的P-连接素/Tcf-4活性，确认了慢性前胃泌素分泌与CRC细胞中保持高水平的所述通路的激活有关。在此显示的慢性前胃泌素分泌与ICAT阻遏之间的关联的生理学相关性的强调在体内通过在患有CRC的16名患者的图中的结直肠肿瘤中显示所述两个事件之间的紧密相关性的結果，以及通过证明ICAT表达在易患肿瘤的、前胃泌素过量表达的小鼠的结肠上皮细胞中被下调(Cobb等人，2004)。所述数据与之前观察的一致，即前胃泌素促进结直肠肿瘤的发展，并提供在胃泌素不足的APCmin+、鼠中观察到的腺瘤的数量和大小的强烈下降的分子解释(Koh等人，2000)。而且，相比于类似背景的野生型小鼠，由GAS基因的无效突变的小鼠的胃壁细胞中的靶基因的表达分析，显示20%的分化表达基因也已知是Wnt和Myc的耙基因，强调了所述信号通路之间的关联(Jain等人，2006)。众所周知的，虽然有文献很好地证明了CRC中增加的前胃泌素表达(Ciccotosto等人，1995;Konturek等人，2002;Siddheshwar等人，2001;VanSolinge等人，1993)，在本发明中描述的ICAT阻遏与仅有的有关所述领域的在先报道(Koyama等人，2002)相矛盾。所述矛盾是由于Koyama等人报道的ICAT增加的表达是用半定量RT-PCR在非显微切割组织上测量的。我们的结果，使得直接比较健康粘膜和肿瘤中的上皮来源的细胞的ICAT表达，显示更一致的所述ICAT作为肿瘤抑制剂的作用。实际上，前胃泌素介导的ICAT阻遏显示对肿瘤生长是必要的，因为在前胃泌素减少的CRC细胞中新合成的ICAT被显示与Tcf-4竟争结合(3连接素，导致Tcf-4的转录活性下降并降低肺瘤发生，符合关于所述肽的在先报道数据(Sekiya等人，2002)。恢复能力，虽然不完全，ICAT的阻遏以及通过用外生前胃泌素处理的f3-连接素/Tcf-4通路的激活，赞同由膜受体介导的自分泌/副分泌环的存在。涉及通过前胃泌素的卩连接素/Tcf-4活性的ICAT介导调节的信号转导事件的分析使我们识别CRC细胞中P连接素/Tcf-4和PI3激酶/ILK通路之间的新连接物。实际上，PI3k的药理学抑制和ILK信号转导的显性负相诱导的中断增加ICAT表达并防止所述肽的前胃泌素介导的阻遏。Tan等人的在先结果(Tan等人，2001)证明，ILK的抑制通过snail的阻遏抑制了卩连接素-Tcf/Lef依赖性转录，从而在APC突变的人结肠癌细胞中的膜上增加上皮细胞钙粘蛋白表达和恢复P连接素。本发明的结果表明，甚至在非融合细胞中，其(3连接素的膜恢复是低的，前胃泌素介导的ILK信号转导能通过ICAT表达的调控调节卩连接素/Tcf-4活性。最后，我们的结果也显示，拮抗前胃泌素功能的药剂提供新的治疗选择，以支持现有的结直肠癌的外科方法。在此呈现的结果显示，前胃泌素信号转导的抑制能提供用于结肠癌治疗的可选的特异性治疗。由于前胃泌素看起来仅由肿瘤而不由健康上皮分泌，所述策略抵消常见的APC突变的效果并降低(3连接素/Tcf-4信号转导关闭物的激活至生理学水平，从而促进正常隐窝完整性的保留。方法细胞和细胞培养M结直肠癌细胞系DLD1和SW480在补充了10。/。胎牛血清(Eurobio，LesUlis,法国)、1%的L-谷氨酸和青霉素/链霉素的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中37。C维持。材料下列一抗被使用小鼠抗-脱磷酸卩连接素(clone8E4;AG.Scientific),小鼠抗卩连接素和抗上皮细胞4丐粘蛋白(TransductionLaboratories)、山羊抗Tcf隱4(SantaCruzBiotechnology)、兔抗ICAT(DrC.Gottardi赠送；(Gottardi和Gumbiner，2004))、多克隆抗PTEN(Upstate)、兔抗磷酸丝氨酸(Zymed)、用于蛋白质印迹的(CellSignaling)和用于免疫沉淀反应的(Upstate)兔抗ILK、小鼠抗整合素(31(Chemicon)、兔抗-Akt、抗-Ser473磷酸化Akt、抗激活的半胱天冬酶3(CdlSignaling),抗-Muc2单克隆抗体(Neomarkers)。人组织收集16名患者的结肠肿瘤和组织学正常上皮(if又自显著远离肿瘤处)的样品，在依据法国政府规章和地方委员会方针切除后，由病理学家得到。得到所有患者的知会同意。组织样品在液氮中保存直到进一步使用。组织切片、显微切割和RNA制备组织切片用液氮冷冻的肿瘤样品制备，进行苏木精/曙红染色以评估其质量、组织中的^^向、和上皮含量。(3连接素、Tcf-4、c-myc和ICAT的荧光免疫检测在接近用于显微切割的切片的切片上进行。激光捕获显微切割(LCM)在4-6个切片每样品上用产自Arctums的PixCellIIe显微切割仪(Alphelys，Plaisir，法国)进行。下列激光束设置被应用265mV，45mWh，15jam直径，18ms。显《效切割的组织而后直接收集在RNA裂解緩沖液中，RNA用RNAeasyMicrokit(Qiagen，Courtaboeuf，法国)依据制造商的说明书制备。回收的RNA的质量和数量用RNApicoLabchips(AgilentTechnologies,PaloAlto，力口利-畐尼亚)^平估。稳定转染胃泌素基因反义和对照cDNA向DLD1细胞系中的转染在(Hollande等人，2003)中说明。为了产生前胃泌素shRNA,下列低聚核苷酸被克隆至pSilencer载体(Ambion)中并转染至SW480细胞中有义5，-GAAGAATT-3，CSEQIDN。l)禾口反义5,-AATTAAAAAACTTCTTCGGATACCTACCTTCTCTTGAATCCATCCATAGGCTTCTTCGGCC3'(SEQIDN。2)。用于产生对照shRNA的(3-半乳糖苷酶低聚核苷酸为有义5，GCGTCTGGCCTTTTTTTGGAAA3，(SEQIDN。3);反义5'AGCTTTTCGCGTCTGGCCTTGG3，(SEQIDN。4)。5xl04细胞/孔被接种并用500ng的pSilencer/前胃泌素-shRNA或pSilencer/(3-半乳糖苷酶-shRNA、50ng的pCDNA-3、和5[il/孔的Exgen500(Euromedex)转染24h。用新霉素(500ng/(il)进行选择。逆转录酶病毒介导的转染ICAT或荧光素酶shRNA到SW480/GAS(_)细胞中，用于ICAT(有义5，GATCCGGATGGGATCAAACCTGACATTTTCAAGAGAAATGTCAGGTTTGATCCCATCTTTTTTG3,(SEQIDN。5)AAAATGTCAGGTTTGATCCCATCCG3'(SEQIDN。6))、和荧光素酶(有CCTTAATCTTTTTT3'(SEQIDN。7),和反义5'AATTGATTAAGGCCCAGCTCTCTTGAAAAGCTGGGCCCTTCTTAATGTCG3'(SEQIDN。8))的shRNA低聚核苷酸被克隆至pSIREN-retroQ(Clontech)中。双向包装细胞系(ONX;DrGarryNolan,StanfordUniversity,Stanford,加利福尼亚)如Pear等人所述的被转染(Pear等人，1993)。含有病毒的培养基在转染后48hr被移除并以1500rpm离心5分钟以沉淀细胞碎片。目标细胞(2.105/孔，在6孔板中)在聚凝胺(8吗/ml)存在下用含有病毒的2ml离心培养基感染。感染的细胞用嘌呤霉素(5吗/ml)处理以选择阳性克隆。瞬时转染在转染前一天，SW480细胞在24孔板中接种(5><104细胞/孔)。依据制造商的说明书，细胞用100pmol的若丹明标记的04S特异的或P半乳糖苷酶特异的shRNA，和5ial/孔的Exgen500(Euromedex)转染。转染48hr或72hr后，细胞被裂解(用于免疫印迹和PCR)或在1%的的多聚曱醛中固定用于免疫染色。阿辛蓝染色转染后72hr，盖玻片上的细胞用PBS洗涤并用阿辛蓝(在3%醋酸中，10g/l)孵育30min。用水沖洗细胞后，盖玻片被固定在mowiol中的载玻片上并在4。C下保存直到使用。RT-定量PCR在37。C下，2.5jig总RNA用DNAseRQ1(Promega)预处理30min,用于M-MLV逆转录酶(/"wYragen)的逆转录。定量PCR用LightCyclerFastStartDNAMasterPlusSYBRGreenI^式剂盒(RocheDiagnostics,Meylan,法国)进行，条件如下肌动蛋白在95°C下变性10分钟，经过50个循环的扩增95°C10秒、58°C6秒、72°C11秒。熔解曲线95°C0秒、68。C30秒、95°C0秒和在40。C下冷却2分钟；c-myc、ILK、嗜铬粒蛋白A和GAPDH扩增在95°C下变性10分钟，经过50个循环的扩增70。C10秒、58°C6秒、72°C13秒。熔解曲线为95°C0秒、80。C30秒、95。C0秒和40。C下冷却2分钟。前胃泌素、Muc-2、ALP和ICAT扩增在95°C下变性10分钟，经过50个循环的扩增70。C10秒、95。C6秒、72。C11秒。熔解曲线为95°C0秒、80°C30秒、70。C0秒和40°C下冷却2分钟。用于选择基因的扩增的引物为GAPDH-有义5'GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA3，(SEQIDN。9)反义5'GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT3，(SEQIDN。10);肌动蛋白-有义5'CGGGAATCTGCGTGACAT3，(SEQIDN。ll);反义5'AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC3，(SEQIDN。12);ILK-有义5'ATGACTGCCCGAATTAGCATG3，(SEQIDN。13);反义5'GCTACCCAGGCAGGTGCATA3，(SEQIDN。14);ICAT-有义5'GCTCTGGTGCTTTAGTTAGG3，(SEQIDN。15);反义5'GCACTTGGTTTCTTTCTTTTC3，(SEQIDN。16);c-myc-有义5，CGTCTCCACACATCAGAGCACAA3，(SEQIDN。17);反义5TCTTGGCAGCAGGATAGTCCTT3，(SEQIDN。18);人前胃泌素-有义5'AGAGGATCCAAATGCAGCGACTATGTGTGTATG3，(SEQIDN。19);反义5，GGCGAATTCCTAGGATTGTTAGTTCTCATCCTCAG3'(SEQIDN。20);Muc-2-有义5TGGGTGTCCCTCGTCTCCTACA3,(SEQIDN。21);反义5'TGTTGCCAAACCGGTGGTA3，(SEQIDN。22);碱性磷酸酶-有义5，CTCCAACATGGACATTGACG3，(SEQIDN。23)反义5，CAGTGCGGTTCCACACATAC3，(SEQIDN。24);嗜4各粒蛋白A-有义5'ATCACCGCLACTGCCACCACCA3，(SEQIDN。25);反义5，CACCTTAGTGTCCCCTTTTGTCATAGGGCT3，(SEQIDN。26)。软琼脂集落形成分析lxlO5细胞被重悬浮在补充10%胎牛血清、1%谷氨酸和青霉素/链霉素的DMEM-F12中的0.2%琼脂中，并铺在含有固化的底层的6-cm培养皿中(生长培养基中0.5%琼脂)。铺板8天后，细胞用0.02%的结晶紫染色，集落的大小和数量在显微镜下定量。所有克隆被一式三份接种，每个计数十个区域。体内研究体内实-验依照法国实验动物研究方针(DirectiondesServicesV&6rinaires，Minist6rede1，Agriculture,AgreementN°B34-172-27)进4亍，并执行实验瘤形成中的动物福利UKCCCR方针。2xl0^田胞被皮下注射进6周大无胸腺BALB/c-nu/nu(棵)鼠中。其后定期跟踪肿瘤生长(估计的肿瘤体积K长x宽x厚)/2)。APCA14小鼠在常规条件下飼养，随机分为两组。第一组(11=9)用每曰一次的250|ig/kg的抗鼠O^SrmRNA的siRNA腹腔^会药治疗。对照小鼠(n二9)用类似计量的抗荧光素酶siRNA治疗。(图S7在线上的siRNA序列)。SiRNA设计并入3，突出物，并且不含5，UGUGU3，序列，以在体内最小化促炎症反应响应和降解(Judge等人，2005;Marques等人，2006)。处理IO天后，挑选小鼠，其血液被收集，肠被切除。肠和结肠的腺瘤评分在(Colnot等人，2004)中描述。健康肠粘膜的样品，以及肠和结肠腺瘤，被置于4%PFA和石蜡封装，或在液氮中冷却，用于蛋白质印迹、IHC或RNA提耳又。血浆^皮制备并用FACS分析系统(BectonDickinson)分析IL-6和TNFct。荧光素酶报告基因分析用于测量TCF/LEF-1转录活性的实验方案之前被描述(Morin等人，1997)。简言之，细胞用500ng的TCF/LEF-1报告基因(pTOP-FLASH)，或对照载体(pFOP-FLASH)以及用25ngpCMV-Renilla转染。荧光素酶活性用双荧光素酶寺艮告基因分析系统(Promega)定量，并相对于Renilla活性标准化。荧光免疫染色荧光免疫染色如在先所述的进行(Hollande等人，2003)。而后载片用具有40倍油浸镜头的激光扫描LEICAsp2共焦显微镜观察。石蜡组织切片上的免疫化学石蜡组织切片由转基因为人GAS基因(Tg/Tg)或者野生型同窝出生者的FVB/N小鼠制备(Cobb等人，2004)。脱蜡和水合后，切片用过氧化物酶在室温下预处理20分钟。抗原用在10mMTris-1mMEDTA,pH9中煮沸20分钟的样品回收。载片被冷却至室温，并用PBS+0.05%BSA中的抗体在4。C下孵育过夜。在所有情况下，Envision+kit(DAKO)被用作二级试剂。染色用DAB(Sigma)显影，载片用苏木精或核坚牢红(NuclearFastRed)复染并固定。蛋白质裂解、免疫沉淀反应、SDS-PAGE和Western免疫印迹蛋白质裂解、免疫沉淀反应和免疫印迹如在先所述的进行(Hollande等人，2003)。蛋白质用ECLPlus(AmershamBiosciences)显像，用ImageJ1.32J(NIH，Bethesda,MD)通过密度计量学定量条带。免疫复合体激酶分析反应通过每个试管添加含有0.5(ig的ATP(250mMATP,1(iCi[Y-32p]ATP)的25jil的激酶緩冲盐(50mMHepespH7.0，ImMMnCl2,1mM原钒酸钠，2mMNaF，5(ig髓磷脂碱性蛋白(Sigma))起始，并在30°C下孵育20分钟。反应通过添加10|il的4x样品缓冲盐终止。试管在lOOOOg下离心1分钟，蛋白质溶解在14%SDS-page凝胶中。底物的磷酸化通过放射自显影术显像(Marotta等人，2003)。放射性免疫分析细胞上清液中的GAS基因产物前胃泌素、甘氨酸延长型胃泌素(G-gly)和酰胺化胃泌素(G-NH2)用放射性免疫分析定量，如在先所述的(Hollande等人，1997)。统计分析所有的统计分析用SASversion9.1forWindows(Cary,NC,USA)进行。斯氏t检验被应用以确定用或未用重组前胃泌素处理的对照和前胃泌素减少的细胞间的差异的统计显著性。为了确定人肿瘤中的GAS1和ICAT基因表达间的相关性，在确定皮尔逊(Pearson)相关系数(r)前，用其自然对数值标准化变量。实施例2抗前胃泌素选择性抗体逆转ICAT表达上的前胃泌素阻遏和诱导c-myc表达的下降。介绍本实施例说明了两种独立产生的抗前胃泌素的多克隆抗体的特征，目的为证明其选择性识别全长前胃泌素(l-80)肽而不是可能存在于人血液中的加工过的肽，如酰胺化胃泌素、甘氨酸延长型胃泌素、和六氨基酸C端侧肽(CFTP)。体外用ELISA分析进行该表征。下述第二步是证实前胃泌素对ICAT表达和p连接素/Tcf4活性的作用能通过选择性抗体被阻断。为了证明被称为前胃泌素抗体的中和活性，我们应用人SW480结直肠肿瘤细胞，其具有apc基因突变并由于组成性卩连接素/Tcf4活性而显示内生前胃泌素分泌。这些细胞分泌大量前胃泌素的能力和酰胺化和甘氨酸延长型胃泌素的非常低的水平在表1中说明。这些细胞用两个不同多克隆抗体单独处理，一个针对前胃泌素的N端序列，另一个针对C端序列。N端序列为SWKPRSQQPDAPLGT(SEQIDN°32)C端序列为FGRRSAEDEN(SEQIDN°31)结果-抗体选择性抗体的选择性用在方法部分描述的ELISA试验评估。结果(图IO)显示，两个多克隆抗体都选择性地识别前胃泌素和用作其产物的免疫原的各自的肽。其不与甘氨酸延长型胃泌素、酰胺化胃泌素或C端侧肽(CTFP)(序列SAEDEN)结合，另一个肽衍生自前胃泌素的突变过程并在人体血清中被发现(SmithKA,Gastroenterology2006)。-前胃泌素抗体的中和活性前胃泌素抗体抑制由前胃泌素对ICAT阻遏并诱导p连接素/Tcf4复合体的转录活性的降低的能力在SW480结直肠癌细胞中进行。当细胞在针对前胃泌素(l-80)的N端或C端末端的兔多克隆抗体存在下被孵育30小时，两者都以1/5000稀释，相比于用相同浓度的非特异性兔多克隆抗体处理的细胞，ICATmRNA表达被强烈增加而c-Myc和细胞周期蛋白Dl的那些被显著降低。c-Myc和细胞周期蛋白Dl是卩连接素/Tcf4转录活性的识别目标，其表达的降低被认为是P连接素/Tcf4活性降低的结果(图11)。结论这些结果证明，在体外，ICAT表达的前胃泌素抑制能被其与选择性抗体的结合逆转，导致组成性(3连接素/Tcf4活性的抑制。本发明因此提供下述概念的第一次证明，即前胃泌素抗体能一皮用于阻断通过ICAT和(3连接素/Tcf4活性发生的前胃泌素的肺瘤发生前效果。方法ELISA抗原以所示浓度被稀释在PBS中，100fil被涂在多吸附(multisorb)96孔板于4°C下过夜。次日，孔用200)il的PBS/Tween1%洗涤3次，在22°C下于2小时内添力口100|il的阻断溶液(PBS/Tween1%/BSA0.1%)。当用PBS/1%Tween再洗涤3次后，一抗在阻断溶液中稀释，在22。C下于2小时内添加100iil至孔中。抗体浓度在图中显示。二抗在相同的阻断緩沖液中稀释，洗涤3次后，在22。C下于2小时内添加100(il至孔中。最后，孑L再次用PBS/Tween1%洗涤，在22。C下于20分钟内添加100piOPD溶液底物。反应用50fil的H2S044N停止，在492nm处读取。细胞培养和用前胃泌素选择性抗体处理CRC细胞系SW480被维持在37。C下的补充了10。/。的胎牛血清(Eurobio，LesUlis，法国)、1%的L谷氨酸和青霉素/《连霉素的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中。SW480细胞被铺在含有10%FBS、1%抗生素和1%谷氨酸的DMEM中的6孔板(200000细胞/孔)中，在37°C和5%C02下放置生长一夜，而后血清饥饿24小时。次日早晨，培养基用不含FBS,含有对照或前胃泌素选择性多克隆抗体的1/5000稀释液代替，而后在37°C和5%C02下孵育。含有抗体的培养基12小时后被更新。30小时后，细胞用PBS洗涤，用RNA提耳又试剂盒裂解緩沖液裂解。RNA制备和RT-定量PCRRNA用RNeasyProtectMinikit(QiagenFranceSA,91974Courtaboeuf，法国)由SW480细胞制备。回收的RNA的质量和数量用RNApicoLabchips(AgilentTechnologies,PaloAlto，力口利福尼亚)评估。对于逆转录，源自每个样品的2.5fig的总RNA用DNAseRQ1(Promega)在37°C下预处理30分钟，用M-MLV(InVitrogen)孵育。定量PCR用每个样品2|il的cDNA进行，使用LightCyclerFastStartDNAMasterPlusSYBRGreenI试剂盒(RocheDiagnostics)。GAPDHmRNA的表达被应用以计算RNA负荷量。定量PCR的循环条件-对于c-myc和GAPDH的扩增在95。C下变性10分钟，经过50个循环的扩增95°C10秒、60°C6秒、72°C13秒。熔解曲线为95。C0秒、80°C30秒、95。C0秒和40。C下冷却2分钟。-对于ICAT的扩增在95°C下变性10分钟，经过50个循环的扩增95°C10秒、60。C6秒、72°C11秒。熔解曲线为95°C0秒、80°C30秒、70°C0秒和40°C下冷却2分钟。-对于细胞周期蛋白Dl的扩增在95°C下变性10分钟，经过50个循环的扩增95°C10秒、70°C6秒、72。C11秒。熔解曲线为95°C0秒、80。C30秒、95。C0秒和40。C下冷却2分钟。用于对人序列的定量PCR的引物GAPDH-有义5'GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA3，(SEQIDN033)GAPDH-反义5,GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT3'(SEQIDN。34)ICAT-有义5，GCTCTGGTGCTTTAGTTAGG3，(SEQIDN。35)ICAT-反义5,GCACTTGGTTTCTTTCTTTTC3'(SEQIDN036)c-Myc-有义5'CGTCTCCACACATCAGAGCACAA3，(SEQIDN。37)c-Myc-反义5TCTTGGCAGCAGGATAGTCCTT3，(SEQIDN。38)CyclinDl陽有义5,陽CCGTCCATGGGGAAGATC-3，(SEQIDN。39)CyclinDl-反义5，-ATGGCCAGCGGGAAGAC-3，(SEQIDN。40)实施例1和2的概括总结第一次，提供了充分和必要的数据证明人结直肠肿瘤细胞的前胃泌素缺失逆转肿瘤发生，因为其诱导具有组成性卩连接素/Tcf4活性的细胞的分化和凋亡。这些效果是前胃泌素特异性的。这在体外的两种细胞系(DLD-1和SW480)以及体内被植入棵鼠和模拟人体肿瘤发生的小鼠模型体内的所述相同的细胞系中显示。实际上，在所述小鼠模型(APCA14)中，叩c基因具有引起(3连接素/Tcf4通路激活的突变，小鼠自发地发展腺瘤和腺癌。这些小鼠在体内用靶向前胃泌素mRNA的siRNA治疗。这导致肺瘤发生的逆转，分化和凋亡引起肿瘤衰退。可见，所述治疗显著抑制组成性卩连接素/Tcf4活性。因此，正是第一次，由甲c基因突变引起的胂瘤发生显示被逆转。在分子水平上可见，前胃泌素的缺失具有抗肿瘤作用，因为其诱导ICAT的重表达，其为13连接素/Tcf4转录活性的内生抑制剂。在人体结直肠癌中，我们第一次证明了(3连接素/Tcf4通路的过度活跃、胃泌素基因表达的高水平和ICAT表达的低水平之间的相关性事件。另外，前胃泌素的过量表达本身显示在Tcf4靶基因水平升高的肿瘤样品中。在自发出现的APCA14小鼠的肠腺瘤中，我们还发现高水平的前胃泌素(而没有甘氨酸延长型胃泌素和酰胺化胃泌素)和低ICAT表达。所这些数在用胃泌素基因选择性siRNA处理后被逆转。最后，提供的数据证明阻断前胃泌素的作用也能用不结合甘氨酸延长型胃泌素或胃泌素的特异地针对前胃泌素的抗体获得。siRNA、shRNA或靶向前胃泌素的抗体诱导ICAT的表达以及阻断和逆转与组成性(3连接素/Tcf4活性相关的结肠肿瘤发生的用途的概念的证据和足够的科学数据因此被提供。参考文献遍及所述应用，各种参考文献描述了本发明所属领域的状态。这些参考文献的公开在此通过引用并入本公开。Blache,R，M.vandeWetering，I.Duluc，C.Domon,RBerta,J.N.Freund,H.Clevers,andP.Jay.2004.SOX9isanintestinecrypttranscriptionfactor,isregulatedbytheWntpathway,andrepressestheCDX2andMUC2genes(SOX9是一种肠隐窝转录因子，通过Wnt通路调节，并阻遏CDX2和MUC2基因).JCellBiol.166:37-47.Brown,D.，U.Yallampalli,A.Owlia,andRSingh.2003.pp60c-SrcKinasemediatesgrowtheffectsoftheflill-lengthprecursorprogastrin1-80peptideonratintestinalepithelialcells,invitro(在体夕卜，pp60c-Src;效酵介导全长前体前胃泌素1-80肽对大鼠肠上皮细胞的生长作用).Endocrinology.144:201-11.C.hakladar，A.,A.Dubeykovskiy，LJ.Wojtukiewicz,J.Pratap,S.Lei,andT.C.Wang.2005.SynergisticactivationofthemurinegastrinpromoterbyoncogenicRasandbeta-catenininvolvesSMADrecruitment(通过致癌Ras和(3连接素对鼠胃泌素启动子的协同激活涉及SMAD补充).BiochemBiophysResCommun.336:190-6.Chung,J.H.,andC.Eng.2005.Nuclear-cytoplasmicpartitioningofphosphataseandtensinhomologuedeletedonchromosome10(PTEN)differentiallyregulatesthecellcycleandapoptosis(在染色体10上删除的石粦酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)的核质间隔差别地调节细胞周期和凋亡).CancerRes.65:8096-100.Ciccotosto，G.D.,A.McLeish，K丄Hardy,andA.Shulkes.1995.Expression,processing,andsecretionofgastrininpatientswithcolorectalcarcinoma(胃泌素在患有结直肠癌的患者中的表达、加工和分泌).Gastroenterology.109:1142-53.Cobb,S.，T.Wood,J.Ceci,A.Varro,M.Velasco,andP.Singh.2004.Intestinalexpressionofmutantandwild-typeprogastrinsignificantlyincreasescoloncarcinogenesisinresponsetoazoxymethaneintransgenicmice(突变和野生型前胃泌素的肠表达显著增加响应于转基因小鼠中的氧化偶氮曱烷的结肠癌发生).Cancer.100:1311-23.Cobb，S.，T.Wood,LTessarollo,M.Velasco,R.Given,A.Varro，N.Tarasova，andP.Singh.2002.Deletionoffunctionalgastringenemarkedlyincreasescoloncarcinogenesisinresponsetoazoxymethaneinmice(功能性胃泌素基因的删除显著增加响应于小鼠中的氧化偶氮曱烷的结肠癌发生).Gastroenterology.123:516-30.Coelho,S.M.,M.Vaisman,andD.P.Carvalho.2005.Tumourre-differentiationeffectofretinoicacid:anoveltherapeuticapproachforadvancedthyroidcancer(视黄酸的肺瘤再分化作用用于晚期曱状腺癌的新治疗方法).CurrPharmDes.11:2525-31.Colnot，S.,M.Niwa-Kawakita,G.Hamard,C.Godard,S.LePlenier，C.Houbron，B.Romagnolo,D.Berrebi，M.Giovannini，andC.Perret.2004.Colorectalcancersinanewmousemodeloffamilialadenomatouspolyposis:influenceofgeneticandenvironmentalmodifiers(在豸斤的家力矣十生月泉瘤寸生息肉病的小鼠模型中的结直肠癌基因和环境修饰剂的影响).LabInvest.84:1619-30.Daniels,D丄.，andW.I.Weis.2002.ICATinhibitsbeta-cateninbindingtoTcf/Lef-familytranscriptionfactorsandthegeneralcoactivatorp300usingindependentstructuralmodules(应用独立的结构才莫式，ICAT抑制(3连接素结合Tcf/Lef族转录因子和普通共激活因子p300).MolCell.10:573-84.Delcommenne,M.,C.Tan,V.Gray,L.Rue，J.Woodgett,andS.Dedhar.1998.Phosphoinositide-3-OHkinase-dependentregulationofglycogensynthasekinase3andproteinkinaseB/AKTbytheintegrin-linkedkinase(通过整合素连接激酶，糖原合成酶激酶3和蛋白质激酶B/AKT的磷酸肌醇-3-OH激酶依赖性调节).ProcNatlAcadSciUSA.95:11211-6.Ferrand，A.,C.Bertrand，G.Portolan,G.Cui,J.Carlson,L.Pradayrol,D.Fourmy,M.Dufresne,T.C.Wang,andC.Seva.2005.Signalingpathwaysassociatedwithcolonicmucosahyperproliferationinmiceoverexpressinggastrinprecursors(与小鼠过量表达胃泌素前体中的结肠粘膜过量增殖相关的信号转导通路).CancerRes.65:2770-7.Finley，G.G.，R.A.Koski,M.F.Melhem,J.M.Pipas,andA丄Meisler.1993.Expressionofthegastringeneinthenormalhumancolonandcolorectaladenocarcinoma(正常人结肠和结直肠腺癌中的胃泌素基因的表达).CancerRes.53:2919-26.Fodde,R.,R.Smits，andH.Clevers.2001.APC，signaltransductionandgeneticinstabilityincolorectalcancer(结直肠癌中的APC、信号传导和基因不稳定性).NatRevCancer.1:55-67.Gottardi，C丄，andB.M.G腿bi紙2004.RoleforICATinbeta-catenin-dependentnuclearsignalingandcadherinfunctions(ICAT在P连接素依赖性核信号转导以及钙粘着蛋白功能中的作用).AmJPhysiolCellPhysiol.286:C747-56.Hollande,R,A.Imdahl,T.Mantamadiotis,G.D.Ciccotosto,A.Shulkes,andG.S.Baldwin.1997.Glycine-extendedgastrinactsasanautocrinegrowthfactorinanontransformedcoloncellline(甘氨酸延长型胃泌素作为非转基因结肠细胞系中的自分泌生长因子的作用).Gastroenterology.113:1576-88.Hollande,F.,D丄Lee，A.Choquet,S.Roche,andG.S.Baldwin.2003.Adherensjunctionsandtightjunctionsareregulatedviadifferentpathwaysbyprogastrininepithelialcells(粘着连接和紧密连接通过上皮细胞中的前胃泌素的不同通路被调节).JCellSci.116:1187-97.Hollande,F.,A.Shulkes，andG.S.Baldwin.2005.Signalingthejunctionsingutepithelium(在肠上皮细胞中的信号转导连接).SciSTKE.2005:pel3.Jain,R.N.，C.S.Bmnkan，C,S.Chew,andL.C.Samuelson.2006.Geneexpressionprofilingofgastrintargetgenesinparietalcells(壁纟田月包中的胃泌素革巴基因的基因表达分析).PhysiolGenomics.24:124-32.Janssen，K.R，P.Alberici,H.Fsihi,C.Gaspar,C.Breukel,P.Franken,C.Rosty,M.Abal，F.ElMarjou,R.Smits,D.Louvard，R.Fodde,andS.Robine.2006.APCandOncogenicKRASAreSynergisticinEnhancingWntSignalinginIntestinalTumorFormationandProgression(APC禾口致癌KRAS在肠肿瘤形成和发展中的增强Wnt信号转导中是协同的).Gastroenterology.131:1096-109.Judge,A.D.,V.Sood，J.R.Shaw,D.Fang，K.McClintock,and1.MacLachlan.2005.Sequence-dependentstimulationofthemammalianinnateimmuneresponsebysyntheticsiRNA(通过合成siRNA的哺乳动物先天免疫响应的序列依赖性刺激).NatBiotechnol.23:457-62.Kochman,M丄.，J.DelValle,C丄Dickinson,andC.R.Boland.1992.Post-translationalprocessingofgastrininneoplastichumancolonictissues(在新生人体结肠组织中的胃泌素的翻i奪后加工).BiochemBiophysResCommun.189:1165-9.Koh,T丄，C丄Bulitta，J.V.Fleming,G丄Dockray，A,Varro,andT.C.Wang.2000.Gastrinisatargetofthebeta-catenin/TCF-4growth-signalingpathwayinamodelofintestinalpolyposis(在肠息肉病的才莫型中胃泌素是P连接素/Tcf-4生长的信号转导通路的目标).JClinInvest.106:533-9.Koh，T丄，G.J.Dockray，A.Varro，R丄Cahill,C.A.Dangler,J.G.Fox,andT.C.Wang.1999.Overexpressionofglycine-extendedgastrinintransgenicmiceresultsinincreasedcolonicproliferation(甘氛酸延长型胃泌素在转基因小鼠中的过量表达引起结肠增殖的增加).JClinInvest.103:1119-26.Konturek,P.C.,W.Bielanski,S丄Konturek,A.Hartwich,RPierzchalski，M.Gonciarz，K.Marlicz,T.Starzynska,M.Zuchowicz,Z.Darasz，丄P.Gotze，J.F.Rehfeld,andE.G.Hahn.2002.Progastrinandcyclooxygenase-2incolorectalcancer(结直肠癌中的前胃泌素和环氧化酶2).DigDisSci.47:1984-91.Korinek,V.，N.Barker,P丄Morin，D.vanWichen，R.deWeger，K.W.Kinzler,B.Vogelstein，andH.Clevers.1997.Constitutivetranscriptionalactivationbyabeta-catenin-TcfcomplexinAPC-/-coloncarcinoma(APC-/-结肠癌中[3连接素-Tcf复合体的组成性转录激活).Science.275:1784-7.Koyama,T"K.Tago，T.Nakamura，S.Ohwada,Y.Morishita,J.Yokota,andT.Akiyama.2002.Mutationandexpressionofthebeta-catenin-interactingproteinICATinhumancolorectaltumors(人体纟吉直肠肿瘤中的(3连接素相互作用蛋白ICAT的突变和表达).JpnJClinOncol.32:358-62.Lallemand-Breitenbach,V.，J.Zhu,S.Kogan,Z.Chen，andH.deThe.2005.Opinion:howpatientshavebenefitedfrommousemodelsofacutepromyelocyticleukaemia(观点患者如何从急性早幼粒细胞白血病的小鼠模型中受益).NatRevCancer.5:821-7.Lian,Z.，andA.DiCristofano.2005.Classreunion:PTENjoinsthenuclearcrew(愈合类PTEN结合核成员).Oncogene.24:7394-400.Litvak,D.A.,M.R.Hellmich,K.Iwase,B.M.Evers,J.Martinez,M.Amblard，andC.M.Townsend，Jr.1999.JMV1155:anovelinhibitorofglycine-extendedprogastrin-mediatedgrowthofahumancoloncancerinvivo(JMV1155:在体内人结肠癌的甘氨酸延长型前胃泌素介导的生长的新抑制剂).AnticancerRes.19:45-9.Marotta，A.,K.Parhar,D.Owen,S.Dedhar，andB.Salh.2003.Characterisationofintegrin-linkedkinasesignallinginsporadichumancoloncancer(散发性人结肠癌中的整合素连接激酶信号转导的表征).BrJCancer.88:1755-62.Marques,J.T.,T.Devosse，D.Wang,M.Zamanian-Daryoush,P.Serbinowski,R.Hartmann,T.Fujita，M.A.Behlke，andB.R.Williams.2006.Astructuralbasisfordiscriminatingbetweenselfandnonselfdouble-strandedRNAsinmammaliancells(区分哺乳动物细胞中的自身或非自身双链RNA的结构基础).NatBiotechnol.Morin,P丄,A.B.Sparks,V.Korinek,N.Barker,H.Clevers,B.Vogelstein,andK.W.Kinzler.1997.Activationofbeta-catenin-Tcfsignalingincoloncancerbymutationsinbeta-cateninorAPC(源自(3连4妻素或APC突变的结肠癌中的P连接素-Tcf信号转导的激活).Science.275:1787-90.Mulrooney，J.,K.Foley,S.Vineberg,M.Barreuther,andL.Grabel.2000.Phosphorylationofthebetalintegrincytoplasmicdomain:towardanunderstandingoffunctionandmechanism((31整合素纟田月包质区的石寿酸4匕功能和机理的理解).ExpCellRes.258:332-4l.Nemeth,J.,B.Taylor,S.Pauwels，A.Varro，andG.J.Dockray.1993.Identificationofprogastrinderivedpeptidesincolorectalcarcinomaextracts(衍生自结直肠癌提取物中的肽的前胃泌素的鉴定).Gut.34:90-5.NordlundMS,FermerC，NilssonO,WarrenDJ,andE.Paus.2007.ProductionandCharacterizationofMonoclonalAntibodiesforImmunoassayoftheLungCancerMarkerproGRP(用于肺癌标i己物proGRP的免疫分冲斤的单克隆抗体的产生和表征).TumourBiol.28(2):100-10.Ottewell,RD.,A.Varro，G.J.Dockray，C.M.Kirton，A丄Watson,T.C.Wang,R.Dimaline,andD.M.Pritchard.2005.COOH-terminal26-aminoacidresiduesofprogastrinaresufficientforstimulationofmitosisinmurinecolonicepitheliuminvivo(前胃泌素的羧端26-氨基酸残基在体内足以刺激鼠结肠上皮细胞中的有丝分裂).AmJPhysiolGastrointestLiverPhysiol.288:G541-9.Ottewell,RD.，A丄Watson,T.C.Wang,A.Varro，G.J.Dockray，andD.M.Pritchard.2003.ProgastrinstimulatesmurinecolonicepithelialmitosisafterDNAdamage(当DNA损害后，前胃泌素刺激鼠结肠上皮细胞的有丝分裂).Gastroenterology.124:1348-57.Pear,W.S.,G.P.Nolan,ML.Scott,andD.Baltimore.1993.Productionofhigh-titerhelper-freeretrovirusesbytransienttransfection(通过瞬日寸转染产生高效《介无辅助逆转录酶病毒).ProcNatlAcadSciUSA.90:8392-6.Radtke，F.,andH.Clevers.2005.Self-renewalandcancerofthegut:twosidesofacoin(肠的自恢复和癌症石更币的两面).Science.307:1904-9.Sekiya,T.，T.Nakamura，Y.Kazuki,M.Oshimura,K.Kohu,K.Tago,S.Ohwada,andT.Akiyama.2002.OverexpressionofIcatinducesG(2)arrestandcelldeathintumorcellmutantsforadenomatouspolyposiscoli,beta-catenin,orAxin(Icat的过量表达请导腺瘤性结肠息肉病、(3连接素、或洋虫胶的胂瘤细胞突变体中的G(2)阻滞和细胞死亡).CancerRes,62:3322-6.Seva，C.,C.J.Dickinson,andT.Yamada.1994.Growth-promotingeffectsofglycine-extendedprogastrin(甘氨酸延长型前胃泌素的生长促进作用).Science.265:410-2.Siddheshwar,R.K.,J.C.Gray,andS.B.Kelly.2001.Plasmalevelsofprogastrinbutnotamidatedgastrinorglycineextendedgastrinareelevatedinpatientswithcolorectalcarcinoma(前胃)必素而不是醜胺1"匕胃；必素或甘氛酉交延长型胃泌素的血浆水平在患有结直肠癌的患者中上升).Gut.48:47-52.Singh,P.，A.Owlia,A.Varro,B.Dai，S.Rajaraman,andT.Wood.1996.Gastringeneexpressionisrequiredfortheproliferationandtumorigenicityofhumancoloncancercells(人体结肠癌细胞的增殖和肿瘤发生需要胃泌素基因表达).CancerRes.56:4111-5.Singh,P"M.Velasco,R.Given,A.Varro，andT.C.Wang.2000.Progastrinexpressionpredisposesmicetocoloncarcinomasandadenomasinresponsetoachemicalcarcinogen(前胃；必素表达4吏小鼠i"顷向于口向应4匕学至丈癌物的结肠癌和A泉瘤).Gastroenterology.119:162-71.Singh，P"Z.Xu,B.Dai,S.Rajaraman,N.Rubin,andB.Dhruva.1994.Incompleteprocessingofprogastrinexpressedbyhumancoloncancercells:roleofnoncarboxyamidatedgastrins(由人体纟吉肠癌纟田月包表达的前胃；必素的不完全加工非羧酸酰胺化胃泌素的作用).AmJPhysiol.266:G459-68.Stepan，V.M.，MSawada,A.Todisco,andC丄Dickinson.1999.Glycine-extendedgastrinexertsgrowth-promotingeffectsonhumancoloncancercells(甘氨酸延长型胃泌素在人体结肠癌细胞中起生长促进作用).MolMed.5:147-59.Tago，K.,T.Nakamura,M.Nishita,J.Hyodo,S.Nagai,Y.Murata，S.Adachi,S.Ohwada，Y.Morishita,H.Shibuya,andT.Akiyama.2000.InhibitionofWntsignalingbyICAT,anovelbeta-catenin-interactingprotein(通过ICAT，一种新的(3连接素相互作用蛋白，的Wnt信号转导抑制).GenesDev.14:1741-9.Tan,C.,P.Costello,J.Sanghera,D.Dominguez,J.Baulida,A.G.deHerreros,andS.Dedhar.2001.Inhibitionofintegrinlinkedkinase(ILK)suppressesbeta-catenin-Lef/Tcf-dependenttranscriptionandexpressionoftheE-cadherinrepressor,snail,inAPC-/-humancoloncarcinomacells(在APC-A人体结肠癌细胞中，整合素连接激酶(ILK)的抑制作用阻止了P连接素-Lef/Tcf依赖性转录以及上皮细胞钙粘蛋白阻遏物snail的表达)，Oncogene.20:133-40.vandeWetering，M.,E.Sancho,C.Verweij,W.deLau，I.Oving，A.Hurlstone，K.vanderHorn,E.Batlle，D.Coudreuse,A.RHaramis,M.Tjon-Pon-Fong，RMoerer，M.vandenBorn,G.Soete，S.Pals，M.Eilers,R.Medema，andH.Clevers.2002.Thebeta-catenin/TCF-4compleximposesacryptprogenitorphenotypeoncolorectalcancercells(P连接素/Tcf匿4复合体在结直肠癌细胞上施加隐窝起源显型).Cell.111:241-50.vanEs,J.H.,andH.Clevers.2005.NotchandWntinhibitorsaspotentialnewdrugsforintestinalneoplasticdisease(Notch和Wnt承卩制齐寸作为肠瘤性疾病的潜在新药物).TrendsMolMed.11:496-502.VanSolinge,W.W"F.C.Nielsen,L.Friis-Hansen,U.G.Falkmer,andJ.F.Rehfeld.1993.Expressionbutincompletematurationofprogastrinincolorectalcarcinomas(在结直肠癌中前胃泌素的表达但不完全成熟).Gastroenterology.104:1099-107.Wang,T.C.,T丄Koh,A.Varro,R丄Cahill，C.A.Dangler,J.G.Fox,andG.J.Dockray.1996.Processingandproliferativeeffectsofhumanprogastrinintransgenicmice(在转基因小鼠中的人体前胃泌素的加工和增殖作用).JClinInvest.98:1918-29.Wang,Z.Y"andZ.Chen.2000.Differentiationandapoptosisinductiontherapyinacutepromyelocyticleukaemia(急性早幼粒纟田胞白血病中的分化和凋亡i秀导治疗).LancetOncol.1:101-6.WrayC.J.，RiloH丄.,andS.A.Ahmad.2004.Coloncancerangiogenesisandantiangiogenictherapy(结肠癌血管生成和抗血管生成治疗).ExpertOpinInvestigDrugs.13(6):631-41.权利要求1.前胃泌素诱导阻遏β-连接素与Tcf-4结合的抑制剂(ICAT)的抑制剂在用于治疗和/或预防显示前胃泌素分泌细胞和β-连接素/Tcf-4-介导的转录通路是组成性激活的细胞的结直肠癌、腺瘤性息肉病和转移的药物制造中的用途。2.前胃泌素诱导阻遏ICAT的抑制剂在用于治疗和/或预防缘于(3-连接素/Tcf-4-介导的转录通路是组成性激活的前胃泌素分泌细胞的结直肠癌、腺瘤性息肉病和转移的药物制造中的用途。3.权利要求1或2所述的用途，其中所述P-连接素/Tcf-4-介导的转录通路是组成性激活的细胞是腺瘤性结肠息肉病(APC)肿瘤抑制剂基因和/或J3-连接素基因是突变的细胞。4.如权利要求1-3的任一权利要求所述的用途，其中前胃泌素诱导阻遏ICAT的抑制剂选自下调结肠细胞中的前胃泌素表达的药剂、抗前胃泌素抗体、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的抑制剂和整合素连接激酶(ILK)的抑制剂。5.权利要求4所述的用途，其中所述前胃泌素诱导阻遏ICAT的抑制剂是下调结肠细胞中的前胃泌素表达的药剂。6.权利要求5所述的用途，其中所述下调结肠细胞中的前胃泌素表达的药剂是包含选自SEQIDN°27、SEQIDN。28、SEQIDN°29和SEQIDN。30的序列之一的siRNA。7.权利要求5所述的用途，其中下调结肠细胞中的前胃泌素表达的药剂是包含选自SEQIDN°l和SEQIDN°2的序列之一的shRNA。8.权利要求4所述的用途，其中所述前胃泌素诱导阻遏ICAT的抑制剂是抗前胃泌素抗体或其生物活性片段或衍生物，其不识别酰胺化或甘氨酸延长型胃泌素17和胃泌素34。9.权利要求8所述的用途，其中所述抗体或其生物活性片段或衍生物与前胃泌素的羧基末端15-氨基酸残基结合。10.权利要求8所述的用途，其中所述抗体或其生物活性片段或衍生物与FGRRSAEDEN(SEQIDN。31)结合。11.权利要求8所述的用途，其中所述抗体或其生物活性片段或衍生物与前胃泌素的氨基末端40-氨基酸残基结合。12.权利要求8所述的用途，其中所述抗体或其生物活性片段或衍生物与SWKPRSQQPDAPLGT(SEQIDN。32)结合。13.权利要求4所述的用途，其中所述前胃泌素诱导阻遏ICAT的抑制剂是PI3K的抑制剂。14.权利要求4所述的用途，其中所述前胃泌素诱导阻遏ICAT的抑制剂是ILK的抑制剂。15.—种药物，包含权利要求8-12的任一权利要求定义的抗体或其生物活性片段或衍生物。16.—种药物，包含权利要求6定义的siRNA或权利要求7定义的shRNA。17.用于筛选化合物的方法，所述化合物用于治疗和/或预防缘于卩-连接素/Tcf-4-介导的转录通路是组成性激活的前胃泌素分泌细胞的结直肠癌、腺瘤性息肉病或转移，包括如下步骤a)提供p-连接素/Tcf-4-介导的转录通路是组成性激活的前胃泌素分泌细"包；和b)添加翁:一皮筛选的化合物；和c)选择诱导ICAT表达的化合物。18.用于筛选化合物的方法，所述化合物用于治疗和/或预防缘于(3-连接素/Tcf-4-介导的转录通路是组成性激活的前胃泌素分泌细胞的结直肠癌、腺瘤性息肉病或转移，包括如下步骤a)提供前胃泌素敏感细胞；和b)将前胃泌素添加至含有所述细胞的培养基中；和c)添加欲被筛选的化合物；和d)选^H秀导ICAT表达的化合物。19.用于确定患有结直肠癌、腺瘤性息肉病或转移的患者是否对前胃泌素诱导阻遏(3-连接素与Tcf-4结合的抑制剂(ICAT)的抑制剂的治疗有响应的方法，包括确定结直肠癌、腺瘤性息肉病或转移是否缘于p-连接素/Tcf-4-介导的转录通路是组成性激活的前胃泌素分泌细胞，或结直肠癌、腺瘤性息肉病或转移是否显示前胃泌素分泌细胞和P-连接素/Tcf-4-介导的转录通路为组成性激活的细胞。20.如权利要求19所述的方法，其中所述确定结直肠癌、腺瘤性息肉病或转移是否缘于(3-连接素/Tcf-4-介导的转录通路是组成性激活的前胃泌素分泌细胞，或结直肠癌、腺瘤性息肉病或转移是否显示前胃泌素分泌细胞和P-连接素/Tcf-4-介导的转录通路为组成性激活的细胞的步骤，包括测量所述患者的前胃泌素的血浆水平的步骤。21.如权利要求19或20所述的方法，其中所述确定结直肠癌、腺瘤性息肉病或转移是否缘于p-连接素/Tcf-4-介导的转录通路是组成性激活的前胃泌素分泌细胞，或结直肠癌、腺瘤性息肉病或转移是否显示前胃泌素分泌细胞和(3-连接素/Tcf-4-介导的转录通路为组成性激活的细胞的步骤，包括测定APC基因或(3-连接素基因的突变或Tcf靶基因转录异常水平的步骤。全文摘要本发明涉及前胃泌素诱导阻遏ICAT的抑制剂，其用于治疗和预防显示前胃泌素分泌细胞和β-连接素/Tcf-4-介导的转录通路为组成性激活的细胞的结直肠癌、腺瘤性息肉病或转移。文档编号A61K45/00GK101460196SQ200780019015公开日2009年6月17日申请日期2007年5月21日优先权日2006年5月22日发明者多米尼克·州博特,弗雷德里克·霍兰德,朱莉·潘尼奎恩,纳塔莉·德劳内,菲利普·杰伊,让-弗朗索瓦·保尔高克斯申请人:国立医学与健康研究所;国家科研中心;蒙彼利埃第一大学