专利名称：测定β A4肽聚集度的方法
技术领域：
本发明涉及一种确定βA4肽聚集度的方法，特别是使用一种合适的能与这种蛋白质结合的试剂，通过该试剂与这种蛋白质反应后测定未与蛋白质反应的结合试剂量来检测这种蛋白质。
众所周知，老年性痴呆病(Alzheimer氏病)患者的大脑中含有由-淀粉样前体蛋白碎片形成的聚集体或团块，这些蛋白碎片被称作淀粉样β-肽或βA4肽。这种含42个氨基酸的βA4肽的氨基酸序列为天冬氨酸-丙氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-组氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-甘氨酸-酪氨酸-谷氨酸-缬氨酸-组氨酸-组氨酸-谷氨酰胺-赖氨酸-亮氨酸-缬氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-甘氨酸-丝氨酸-天冬酰胺-赖氨酸-甘氨酸-丙氨酸-异亮氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-亮氨酸-蛋氨酸-缬氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-丙氨酸(DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA)。
有关βA4肽与老年性痴呆病的大体讨论参阅文献Dennis J.Selko，《科学美洲》(Scientific American)1991年11月，68-78以及Joseph T.Jarrett等《细胞》(Cell)，73，1055-1058(1993)。
对老年性痴呆病一个潜在的治疗方法是应用一种含有阻止βA4肽聚集或成团块的活性成分的药物。因此，我们就需要进行一个筛选试验来确定这种活性成分或有效的化合物。
对于测定蛋白质本身，本领域内有许多种检测方法，如其中一种是利用Bradford染料，即我们通常所说的考马斯亮蓝G250(CoomassieBrilliant Blue G250)。这一点请参阅文献J.James Sedmak等，《分析生物化学》(Analytical Biochemistry)，79，544-552(1977)。在这篇文献中，作者描述了测定蛋白质的方法，但没有有关βA4肽的无论是聚集态还是游离态的资料。
现在迫切需要建立一种检测βA4肽的方法以对这些聚集状态的蛋白质和游离或非聚集状态的蛋白质加以区分并且反映出各种化合物对该蛋白质聚集状态的效果。这一点上H.LeVine，《蛋白质科学》(Protein Science)2，404-410(1993)描述了聚集的淀粉样蛋白使用硫代黄素T(Thioflavin T)的检测。
图1图解说明βA4肽的非聚集程度与时间的关系图2图解说明βA4肽的非聚集程度的可测定的特性本发明涉及一种确定βA4肽聚集度的方法，更具体地讲，该方法包括将该蛋白质与一种合适的结合试剂反应，该试剂具有只与βA4肽的非聚集状态结合的特性，反应后形成一定数量的被蛋白质结合的试剂。这样就可以测定这种被蛋白质结合的试剂量。
众所周知，老年性痴呆病患者与非老年性痴呆病患者相比，他们大脑中含有被称作βA4肽的含39-42个氨基酸的淀粉样蛋白质。老年性痴呆病患者大脑中的这种蛋白质的聚集或成团，从而可对正常的脑细胞具有破坏作用，而一旦这些杀伤性的团块或聚集体形成，这种形成就几乎是不可逆的。因此，一种潜在的老年性痴呆病的治疗方法就是给予患者一种能阻止βA4肽形成聚集体或团块的化合物或药物。
现发现潜在用于治疗老年性痴呆病的化合物可以通过筛选试验来确定，此筛选试验可显示那些被选样的候选化合物在体外是否对βA4肽的聚集有抑制作用。
我们选取了一种适当的结合试剂。这种试剂或者对非聚集的淀粉样肽即βA4肽有选择性反应，或者与聚集的淀粉样肽发生选择性反应但不与被筛选的候选化合物发生反应，而在这种反应形式中，也就是说一旦和这种肽反应便显示出一种可测量的特性，例如在一定的波长的光的吸收。一些较合适的结合试剂包括Bradford染料或称考马斯亮蓝G250，刚果红(CongoRed)及硫代黄素T。其中尤其合适的一种结合试剂是Bradford染料。Bradford染料就是考马斯亮蓝G250。有关Bradford染料或考马斯亮蓝G250的描述参见M.Bradford，《分析生物化学》，72，248(1976)；A.H.Reisner等，《分析生物化学》，64，509(1975)；S.Fazukes de St.Groth等，《生物化学生物物理学学报》(Biochim.Biophys.Acta)71，377(1963)以及J.J.Sedmack等《分析生物化学》，79，544(1977)，而且这种染料在商业上是一种标准试剂，(如，加利福尼亚州Hercules伯乐生命科学集团(Bio-Rad Life Science Group，Hercules，California)提供的蛋白质检测浓缩显色试剂)。这种染料只与非集聚的淀粉样肽βA4反应而不与任何集聚的淀粉样肽反应。
刚才我们提到过有关Bradford染料的资料(Marion M.Bradford，《分析生物化学》，72，248-254(1976))，所谓Bradford染料是0.01％(重量/体积)(W/V)考马斯亮蓝G250，1.7％(W/V)乙醇和8.5％(W/V)磷酸。由伯乐公司提供的货号为500-0006的蛋白质检测商用浓缩显色试剂是在Bradford染料基础上的改进近似0.04％(W/V)的考马斯亮蓝G250溶解于含25％甲醇、50％磷酸及25％水中。这一更改使它更加稳定，并延长了其货架寿命，由于减少了磷酸的含量使得它的生物危害性减小而不影响它与蛋白质结合的性质。它还以如下两种标准之一的试剂盒的形式供应试剂盒1(与牛γ球蛋白)，目录号500-0001；试剂盒2(与牛血清白蛋白)，目录号500-0002。
实际应用中应准备好已知浓度的淀粉样肽，也就是非聚集状态的βA4肽。这种非聚集状态的βA4肽是通过利用象Millipore 9050型(MilliporeModel 9050)肽合成仪这种常规肽合成仪进行肽合成而获得的。例如将10毫克的肽在合适的温度(如20-25℃)下溶解于一些合适的有机溶剂如二甲基亚砜(DMSO)或乙腈中配成贮存液(如2,500μM)。这种贮存液可用磷酸盐缓冲盐水(pH7.4)常规稀释(如10倍)成对照液(如250μM)。先取一份对照液(如16μL)加入144μL磷酸盐缓冲盐水后与25μL结合剂如Bradford染料反应，这样，结合剂与非集聚的淀粉样蛋白反应就形成了第一浓度或数量的结合了蛋白的结合剂。这一与结合剂发生的反应是在结合剂只选择性地与非聚集蛋白结合的条件下完成的。因此，反应的条件取决于所选取的特殊的结合剂以及所要测量的结合特性。例如，如要选用Bradford染料，结合反应一般在中性或稍稍偏碱也就是pH值7.0-7.4的环境中在20-25℃温度下进行5-15分钟。
根据反应的结合剂的特性选取合适的检测方法，将用此方法测得的第一份蛋白质结合的结合剂的浓度或量记为第一个值X1(如用Bradford染料时在波长595nm下的吸光度为0.7)。
另取第二份对照液，由于βA4肽的聚集是在一段时间内形成的，所以第二份在适合的温度下(如37℃左右)孵育一段合适的时间(如24-72小时)使它形成聚集体，然后加入结合剂并只与非聚集状态的淀粉样肽反应，形成了第二个浓度或量的与蛋白结合的或称反应的结合剂。由于聚集的淀粉样肽不与结合剂发生反应，这样，这部分就不能被检测到。再测量被蛋白结合的结合剂的量(如在一定的波长(如595nm)及室温下用分光光度计测用Bradford染料反应后的吸光度)，就得到了第二个值X2，它代表已经与非聚集的淀粉样肽反应的结合剂的量。
随着聚集体的产生，结合或称已反应的结合剂的浓度与已发生的聚集程度成反比，因此，第二个值X2比第一个值X1小就提示βA4肽已发生了一定程度的聚集。
为了能够定性地筛选能够治疗老年性痴呆病的化合物，取同等量的第三份对照液，将它加入候选的化合物后，同样在合适的条件下孵育一段时间(如37℃孵育48小时)，之后加入合适的结合剂，如Bradford染料，并检测此液体或混合物，如用普通的分光光度计进行分光测定，得到一个反应的结合剂的值。如果此候选的化合物没有抗聚集的作用，则得到的这个值X3近似等于X2；相反，如果X3比X2大30-40％，则可认为这个候选的化合物具有抑制淀粉样肽聚集的作用。
为了实施上述的筛选试验，淀粉样肽相对选择的结合剂的浓度典型地应在1500-1800的范围(淀粉样肽/结合剂)；淀粉样肽对候选的化合物的浓度典型地应地在4-40倍(候选的化合物/淀粉样肽)。
聚集的程度可以用下面的方法定量地检测出来。首先将同等份数的对照液按一系列时间段进行孵育，随着时间的增加，聚集的程度也加大，在每段孵育时间结束时加入结合剂，如Bradford染料，并进行测量，如在595nm波长下测用Bradford染料后的吸光度，这样，就可得出每个时间段的聚集了的淀粉样肽与所对应的非聚集的淀粉样肽的浓度或百分比。结合剂可衡量非结合(或结合)的蛋白。用新鲜蛋白所得的数值(非聚集蛋白，X1)减去这一数值就可计算出聚集的淀粉样肽的量并用百分比表示。这样就可以得到象图1所示的那样一条在一系列时间点上(如24小时、48小时、72小时及96小时)及所对应的未聚集的肽的百分比的反比曲线。上述操作步骤均相同，只是在每个孵育时间段加结合剂并测量此混合物以得到X值。这样聚集或非聚集的肽的相互关系就可以通过分光光度计所读出的X值(如图1所说明的用Bradford染料时在595nm波长下的吸光度)建立起来。正象图1所说明的那样，得到了一条由所读取的X值对应非聚集蛋白的百分比的一条标准曲线，而从中可以得到已聚集蛋白的百分比。
一种具体的候选化合物所得到的X值就可以象图2所说明的那样，通过与对照的对比而定量地以抑制蛋白聚集的百分比的方式得出来。
实施例1将β淀粉样肽(又称做βA4)按10mg/ml(或2500μM)的浓度溶于100％的二甲基亚砜(DMSO)中。在测定前将其用pH7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释到1mg/ml(或250μM)并按每孔16μl的量加入到96孔板的每一样品孔中(最终的浓度是25μM)。所有的处理均一式三份。
在这一实例中，候选的化合物按三种浓度(250μM，500μM和1mM)加入试验孔中。每一孔的总体积用PBS加到160μl。对照孔中则不加入化合物只用PBS将体积加至160μl。用保护膜将96孔板封起并在37℃孵育48小时。
孵育结束后，将板取出并向所有带样品的孔中加入25μlBio-Rad蛋白检测染色试剂(Bradford染料)。同时利用新鲜肽(被认为是未聚集的)的吸光度值建立标准曲线。用吸量管将染料混匀并将板在2500转/分(rpm)的速度下快速离心以去除气泡。
加入染料15分钟后用Dynatech MR5000读板仪在595nm波长读取吸光度。由于加入了一种含8个氨基酸的(谷氨酰胺-赖氨酸-亮氨酸-缬氨酸-苏氨酸-苏氨酸-丙氨酸-谷氨酸，QKLVTTAE)叫作A41920t肽的候选化合物，从未处理的聚集肽与处理的聚集肽之间的差计算出β淀粉样肽聚集的下降百分比。在A41920t分别为250μM、500μM及1mM(或1000μM)的不同浓度时，下降的百分比分别是48.1％、52.44％及32.26％。
实施例2重复实例1的步骤，只是向含有16μl的1mg/ml的淀粉样肽的孔中加入10μl 30％的过氧化氢。向那些孔中加入134μl的PBS使其最终体积为160μl。将板封好在37℃孵育48小时。
孵育结束后，象实例1那样将板取出，并向每个含样品的孔中加入25μl的Bio-Rad蛋白检测染色试剂(Bradford染料)。同样利用新鲜肽(被认为是未聚集的)的吸光度值建立标准曲线。用吸量管将染料混匀并将板在2500转/分(rpm)的速度下快速离心以去除气泡。
加入染料15分钟后用Dynatech MR5000读板仪在595nm波长读取吸光度。通过减去背景并分析新鲜的及被过氧化氢处理过的β淀粉样肽的吸光度之差来估测聚集的量。这种差值用超过新鲜或未聚集的肽的百分比来表示。在48小时后聚集的百分比为97.7％。
实施例3将过氧化氢用萄糖胺聚糖及多硫酸戊聚糖替代，其余步骤同实例2。聚集增加的百分比分别是40.8％(0.5μM时)、57.1％(5μM时)及62.9％(50μM时)。
实施例4将A41920t用1-(5′-氧代己基)-3-甲基-7-丙基-2，6-(1H，3H)-嘌呤二酮(又称作丙戊茶碱)取代，其余的步骤同实例1。聚集减少的百分比分别为29.68％(500μM)和37.4％(1mM或1000μM)。序列表(1)一般信息(i)申请人(A)姓名Hoechst Marion Roussel，Inc.(B)街道2110E.Galbraith Rd.，P.O.Box 156300(C)城市Cincinnati(D)州Ohio(E)国家美利坚合众国(F)邮编(ZIP)45215-6300(G)电话513-948-7369(H)传真513-948-7961(I)电传214320(ii)发明名称测定βA4肽聚集度的方法(iii)序列数目1(iv)计算机可读形式(A)媒体类型软盘(B)计算机IBM兼容PC机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件Patentln Release#1.0，Version#1.30(EPO)(vi)在先申请资料(A)申请号US 08/515,606(B)申请日1995年8月16日(2)有关序列1的信息(i)序列特征(A)长度42个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑类型线形(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述序列1Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 1015Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 25 30Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala35 40
权利要求
1.一种测定βA4肽聚集度的方法，包括(a)使用一种合适的能与βA4肽结合的试剂与它发生反应，该试剂具有只与βA4肽的非聚集状态结合的特性，反应后形成一定数量的无蛋白质的结合试剂；以及(b)测量被蛋白质结合的结合试剂的所述量。
2.根据权利要求1的方法，其中所述合适的结合试剂是在游离状态与被蛋白结合状态间显示光谱学特征的可检测差别的试剂。
3.根据权利要求1的方法，其中所述合适的结合试剂包括考马斯亮蓝G250染料。
4.一种确定抑制βA4肽聚集的化合物的方法，包括(a)用一种合适的结合试剂与含有游离的βA4肽的样品反应一段合适的时间，以形成蛋白质结合的结合剂从而得到蛋白质结合的结合剂样品；(b)测量所说蛋白质结合的结合剂样品得到第一个与蛋白结合的结合剂的量相关的参考测量值；(c)所说的蛋白结合的结合剂样品与所选的候选化合物反应一段合适的时间以形成一个试验样品；及(d)测量试验样品得到第二个参考测量值，确定第一个与第二个参照测量值差别的程度。
5.根据权梨求4的方法，其中所述合适的结合试剂是在游离状态与被蛋白结合状态间显示光谱学特征的可检测差别的试剂。
6.根据权利要求5的方法，其中所述结合试剂包括Bradford试剂。
全文摘要
公开了一种检测β A4肽聚集度的方法。该方法包括用能够只与非聚集态β A4肽结合的适当结合试剂与该蛋白反应,形成一定量的蛋白结合的结合试剂。然后测定蛋白结合的结合试剂的量。
文档编号G01N33/50GK1193385SQ96196312
公开日1998年9月16日 申请日期1996年7月23日 优先权日1995年8月16日
发明者S·格亚尔, J·W·保尔, N·G·里德尔, S·R·萨哈斯拉布赫 申请人:赫彻斯特马里恩鲁斯公司