Glp-1受体激动剂和胃泌素的肽缀合物及其用途的制作方法

专利名称：Glp-1受体激动剂和胃泌素的肽缀合物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明尤其涉及某些肽缀合物和所述缀合物在治疗多种疾病或异常(包括糖尿病(I型和/或2型)和糖尿病相关疾病或异常)中的用途。本申请要求美国专利No. 61/395，119和No. 61/470, 170的优先权，它们的说明书均通过整体引用并入本文。
背景技术：
糖尿病(尤其是I型和2型糖尿病)以及肥胖症(被认为是引起尤其是2型糖尿病的主要原因)是日益加重的全球性健康问题。可由未治疗的糖尿病引起的疾病和病症包·括心血管和外周动脉疾病、微血管和大血管并发症、中风以及可能的某些类型的癌症。糖尿病的特征在于血液葡萄糖水平的生理调节有缺陷，可导致糖尿病的病症是胰β -细胞量和功能的减少或损失，伴随内源性膜岛素广生的减少或损失，和/或膜岛素抵抗(对胰岛素的敏感性降低)，即内源性胰岛素产生对血液葡萄糖水平进行足够调节的能力的降低或损失。胃肠粘膜应答于肠中营养物质的存在和吸收而分泌降低血液葡萄糖水平的多种激素。这些包括胰高血糖素样肽-1 (glucagon-like peptide-1, GLP-1)、葡萄糖依赖性促膜岛素妝(glucose-dependent insulinotropicpeptide, GIP)和分泌素。由加工胰高血糖素原(180个氨基酸的肽)的组织产生GLP-1 [参见，例如，0rsk()V, Diabetologia35 :701-711 (1992)][参见，例如，Drucker, Diabetes47 159-169(1998)]。胰高血糖素原的全部序列包含胰高血糖素的29个氨基酸序列，GLP-1的36或37个氨基酸序列以及胰高血糖素样肽-2(GLP-2 ;促肠肽(intestinotrophicpeptide))的34个氨基酸序列。人GLP-1 (7_37)的氨基酸序列为HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGRG(SEQ I D NO :114)。经鉴定GLP-1具有许多功能。它是在正常人中增强葡萄糖刺激的胰岛素分泌的激素(因此属于称为肠促胰岛素激素的一类激素)。另外，GLP-1降低胰高血糖素浓度，延迟胃排空，刺激胰岛素(原)的生物合成并且增强胰岛素敏感性[参见，例如，Nauck, Horm. Metab. Res. 47 :1253-1258 (1997) ]。GLP-1 还在葡萄糖耐量降低(impairedglucosetolerance)的对象中增强胰β_细胞感应和应答(通过胰岛素分泌)于葡萄糖的能力[参见，例如，Byrne, Eur. J. Clin.1nvest. 28 :72-78 (1998)]。人中 GLP-1 的促胰岛素作用增加葡萄糖消失速率并且减少内源性葡萄糖产生，这部分上由于胰岛素水平的增力口，部分上由于胰岛素敏感性的增强[参见，例如，D' Alessio, Eur. J. Clin.1nvest. 28 72-78(1994)]。然而，体内天然GLP-1的短半衰期在将该激素开发成药物尝试中成为主要的药理学挑战。在人和大鼠中，GLP-1被二肽基肽酶IV(DPP-1V)迅速地降解成作为内源性GLP-1受体拮抗剂的GLP-1 (9-36)酰胺。已经提出了数个解决该问题的策略，一些是使用DPP-1V的抑制剂，而另一些则使用GLP-1 (7-36)酰胺的DPP-1V抗性类似物。所谓的毒蜥外泌肽(Exendin)是另一类降低血液葡萄糖水平的肽，它们与 GLP-1 (7-36)有一些序列相似性(53 % )[参见，例如，Goke 等，J. Biol. Chem. 268 19650-19655(1993)]。毒蜥外泌肽发现于毒蜥科(Helodermatidae)物种(珠蜥)的唾液中。毒蜥外泌肽_3存在于珠毒蜥(Heloderma horridum)(墨西哥珠蜥)的唾液中，而毒蜥外泌肽-4存在于希拉毒蜥(Heloderma suspectum)(希拉蜥蜴)的唾液中。在2位和3位上与毒蜥外泌肽-3不同的毒蜥外泌肽-4的氨基酸序列为HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2(SEQ ID NO :115)。已报道毒蜥外泌肽-4对分离的大鼠胰岛瘤细胞是强GLP-1受体激动剂[Goke等，loc. cit. ]。W099/07404公开了在糖尿病db/db小鼠中系统性施用毒蜥外泌肽_4使血液葡萄糖水平降低40 %，还报道在糖尿病ob/ob小鼠中每日一次腹膜内注射毒蜥外泌肽-4有长期降低血液葡萄糖的作用[Grieg等，Diabetologia42 :45-50 (1999) ] US5, 424，286和W098/05351公开了毒蜥外泌肽_3、毒蜥外泌肽-4和毒蜥外泌肽激动剂可用于治疗糖尿病，用于减少胃运动和延迟胃排空，以及用于预防高血糖症，W098/30231还公开了它们可用于减少食物摄取。肽激素胃泌素(Gastrin)由胃粘膜细胞和十二指肠G细胞分泌，该激素在人体中的主要生理作用是刺激胃酸(即HCl)分泌和帮助胃运动。胃泌素的其他确定作用包括刺激细胞生长，一些证据表明胃泌素可在胰岛新生中起作用，即促进胰岛中分泌胰岛素的β -细胞的生长[例如，参见，Korc, Μ.，]. Clin.1nvest. ,92 :1113-1114 (1993) ；Rooman 等Diabetes51 =686-690 (2002)]，从而有助于调节血液葡萄糖。胃泌素与另一种胃肠肽激素(胆囊收缩素(CCK))具有共同的受体。受体CCK-AR和CCK-B R对胃泌素和CCK变体具有不同的亲和性。CCK-A R (或CCK Rl)主要作为硫酸化CCK的受体，而CCK-B R(或CCK R2)与CCK和胃泌素二者结合程度相同。由于在血浆中胃泌素比CCK水平更高，所以CCK-B R被认为是“胃泌素受体” [Foucaud等Reg. Peptides145 :17-23(2008)]ο在结合配体后CCK-B R可起始数个细胞内通路，这被认为是CCK多种生理学作用的原因。CCK-B R的主要下游通路是MAPK(促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen activatedprotein kinase))或 ERK(细胞外调节激酶(extra-cellular regulated kinase))通路，该通路也被数个生长激素活化。这是胃泌素的细胞增殖作用的重要特性。由于CCK-B R在胰中表达，因此胃泌素能在该组织中促进细胞增殖和胰岛新生。在人中，胃泌素主要以三种形式出现，即胃泌素34、胃泌素17和胃泌素14(对应所述序列中氨基酸的总数)。还鉴定了胃泌素6。通过切割C末端酰胺化的胃泌素34产生较短的形式；因而胃泌素17由胃泌素34C末端最后17个残基(对应胃泌素原(55-71))组成，胃泌素14由胃泌素34C末端最后14个残基(对应胃泌素原(58-71))组成，胃泌素6仅由胃泌素34C末端最后6个残基(对应胃泌素原￠6-71))组成。胃泌素的酰胺化形式高亲和性地结合至CCK-B R并且发挥细胞增殖功能。在人胃泌素17中，N末端氨基酸残基是焦谷氨酸(PyroGlu)残基。酰胺化的C末端6个氨基酸是重要的胃泌素受体结合残基。W02005/072045特别公开对于已证明“GLP-1激动剂”或“胃泌素化合物”对其有治疗效果的病症和/或疾病，认为“GLP-1激动剂”和“胃泌素化合物”的组合在它们的预防和/或治疗中有益效果。W02007/095737特别公开对于已证明“毒蜥外泌肽激动剂”或“胃泌素化合物”对其有治疗效果的病症和/或疾病，认为“毒蜥外泌肽激动剂”和“胃泌素化合物”的类似组合在它们的预防和/或治疗中有益效果。在W02005/072045中给出的数据[来源于使用非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠的研究，该小鼠广泛地用作人I型糖尿病的动物模型]似乎表明，与单独使用所研究的“GLP-1激动剂”(或“胃泌素化合物”)时的效果相比，其中描述的某些“GLP-1激动剂”/ “胃泌素化合物”组合对于使急性糖尿病NOD小鼠的血液葡萄糖水平正常化可具有有益效果。W02007/095737中给出的数据[同样来源于使用非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠的研究]似乎表明，与单独使用所研究的“毒蜥外泌肽激动剂”(或“胃泌素化合物”)时的效果相比，其中描述的某些“毒蜥外泌肽激动剂” / “胃泌素化合物”组合对于使急性糖尿病NOD小鼠中的血液葡萄糖和胰岛素水平正常化可具有有益效果，与单独使用“GLP-1受体激动剂”时的效果相比，其中描述的某些“GLP-1受体激动剂”/胃泌素组合对于诱导胰岛细胞再生可具有有益效果。W02005/072045和W02007/095737还公开了形成这样的缀合物的可能性，其包含“GLP-1激动剂”或“毒蜥外泌肽激动剂”(分别地)与“胃泌素化合物”任选地通过中间接 头或间隔物彼此共价偶联或连接(即缀合)。作为合适的间隔物提及的是单糖或二糖、氨基酸、硫酸酯、琥珀酸酯、乙酸酯或者包含一种或更多种这种部分的寡聚聚合间隔物或接头。还描述了可制备所研究类型的缀合物的预期方法。然而，在相应国际申请提交时，在所述文献中没有提供制备数据或其他数据以证实所研究类型的任何缀合物实际上已被制备并表征，或对其生物学/生理学特性或活性进行了测试。还可注意，W02005/072045或W02007/095737 二者都没有提供任何体内、体外或其他数据以证实其中分别描述的和使用的“GLP-1激动剂”/ “胃泌素化合物”或“毒蜥外泌肽激动剂”/ “胃泌素化合物”组合在治疗例如2型糖尿病中可有益。发明概述现在已经发现，与将两种单独的所研究肽组合的治疗活性相比，包含两种共价偶联或连接的肽部分的某些缀合物在治疗例如糖尿病(I型和/或2型糖尿病)或多种其他糖尿病相关的疾病或异常中可出乎意料地显示出高治疗活性。在一个大的方面中，本发明提供了 GLP-1受体激动剂和胃泌素(尤其是在15位具有选自LeU、Nle、Phe和Thr的替换的胃泌素)的肽缀合物。更特别地，本发明提供了毒蜥外泌肽-4和胃泌素的肽缀合物以及GLP-1和胃泌素的肽缀合物。因此在第一方面中，本发明提供了具有式I的肽缀合物R1-Z-L-Y-R2 (I)其中R1为H、Cy烷基、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；R2 为 OH 或 NH2 ；Z包含具有以下序列的毒蜥外泌肽-4 (1-39) (Exendin-4 (1-39))序列或其类似物ZaHis-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-1le-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO :115)L是任选的接头部分；以及Y包含具有以下序列的胃泌素17序列或其类似物Ya
Gln-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Y15-Asp-Phe (SEQ IDNO 116)其中Y15 选自 Leu、Nle、Phe 和 Thr0本发明还提供了肽缀合物，其中(i)相对于毒蜥外泌肽-4的序列，Za在多至10个位置上具有替换和/或包含I至12个氨基酸的C末端截短；和/或(ii)相对于胃泌素17的序列，Ya相对于胃泌素17(GaStrinl7)的序列在多至5个位置上具有替换和/或包含I至13个氨基酸的N末端截短。在一个实施方案中，本发明提供了肽缀合物，其中
Za是具有式IIa的肽缀合物His-Z2-Z3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Z9-Z10-Zll-Z12-Z13-Z14-Glu-Z16-Z17-Zl8-Z19-Z20-Z21-Z22-Z23-Z24-Z25-Z26-Z27-Z28-Z29-Z30-Z31-Z32-Z33-Z34-Z35-Z36-Z37-Z38-Z39(IIa)其中Z2 选自 Gly、Ala、Ser、Aib、Thr、Leu 和 lie ；Z3 选自 Glu 和 Asp ；Z9 选自 Asp 和 Glu ；ZlO 选自 Leu、Val、Ile 和 Ala ;Zll 选自 Ser 和 Aib ；Z12 选自 Ser、Gin、Arg、Cys、Lys、Glu 和 Orn ；Z13 选自 Arg、SerΛ Gin、Tyr 和 Glu ；Z14 选自 Gly、Cys、Phe、Tyr、Trp、Lys、Met、Leu、Nle 和 lie ；Z16 选自 Asp、Gly、Aib、Glu、Lys 和 Cys ；Z17 选自 Glu、Cys、Lys、Ser 和 Gln ；Z18 选自 Ala 和 Aib ；Z19 选自 Val、Leu、Ile 和 Ala ;Z20 选自 Arg、Lys、Cys、Orn 和 Glu ；Z21 选自 Leu 和 Glu;Z22 选自 Phe 和 Ala ；Z23 选自 Ile 和 Leu ；Z24 选自 Glu、Cys、Lys、Ala 和 Arg ；Z25 选自 Trp、Cys、Lys 和 Phe ；Z26 选自 Leu 和 Ile ;Z27 选自 lie、VaK Gin、Lys、Cys、Arg 和 Orn ；Z28 选自 Asn、Ser、Asp、Aib、Gin、Lys、Cys、Arg、Tyr、bAla、Glu、Orn 和 Leu，或缺失;Z29 选自 Gly、Aib 和 bAla，或缺失；Z30 选自 Gly、Cys、Lys 和 Arg，或缺失；Z31 选自 Pro、Ser 和 Asp，或缺失；
Z32选自Ser和Lys，或缺失；Z33 为 Ser，或缺失；Z34选自Gly和Lys，或缺失；Z35 为 Ala，或缺失；Z36 为 Pro，或缺失；·
Z37 为 Pro，或缺失；Z38 为 Pro，或缺失；Z39 为 Ser，或缺失；L为具有式IIb的肽序列L1-L2-L3-L4 (IIb)其中LI 选自 Ser> Ala、Lys> Orn> bAla、8Aoc、DBF、Peg3、Cys 和 Gin,或缺失；L2 选自 Ser> Ala、Lys> Orn> bAla、8Aoc、DBF、Peg3、Cys 和 Gin,或缺失；L3 选自 Ser> Ala、Lys> Orn> bAla、8Aoc、DBF、Peg3、Cys 和 Gin,或缺失；L4 选自 Ser> Ala、Lys> Orn> bAla、8Aoc、DBF、Peg3、Cys 和 Gin,或缺失；Ya为具有式IIc的肽序列Yl-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Yg-Y10-Yl1-Yl2-Y13-Y14-Y15-Asp-Yl7(IIc)其中Yl 为 Gln，或缺失；Y2 为 Gly，或缺失；Y3 为 Pro，或缺失；Y4 为 Trp，或缺失；Y5 为 Leu，或缺失；Y6 为 Glu，或缺失；Y7 为 Glu，或缺失；Y8 为 Glu，或缺失；Y9 为 Glu，或缺失；YlO 为 Glu，或缺失；Yll 为 Ala，或缺失；Y12选自Ala和Tyr，或缺失；Y13选自Gly和Ala，或缺失；Y14 选自 Trp、Phe、INal 和 Met ;Y15 选自 Leu、Nle、Phe 和 Thr ；以及Y17选自Phe和3_ (3_吡啶基)-丙氨酸。在另一个实施方案中，本发明提供了肽缀合物，其中Za是具有式IIIa的肽序列His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Z9-Leu-Ser-Z12-Z13-Z14-Glu-Z16-Glu-Ala-Val-Z20-Leu-Phe-1le-Z24—Z25-Leu-Z27-Z28(IIIa)其中
Z9 选自 Asp 和 Glu;Z12 选自 Lys、Arg 和 Orn ;Z13 选自 Gln 和 Tyr ；Z14 选自 Met 和 Leu ；Z16 选自 Glu、Cys 和 Lys ；Z20 选自 Arg、Lys 和 Orn ；Z24 选自 Lys 和 Glu ;Z25 选自 Trp、Lys、Cys 和 Phe ; Z27 选自 Lys、Arg 和 Orn ；Z28选自Asn和Asp，或缺失;L是具有式IIIb的肽序列Ll-L2-L3-L4-(IIIb)其中LI 选自 Orn、Peg3、Cys、Lys 和 Gln,或缺失；L2 选自 Orn、Peg3、Cys、Lys 和 Gln,或缺失；L3 选自 Orn、Peg3、Cys、Lys 和 Gln,或缺失；L4 选自 Orn、Peg3、Cys、Lys 和 Gln,或缺失；Ya是具有式IIIc的肽序列Y12-Y13-Y14-Y15-Asp-Y17 (IIIc)其中Y12选自Tyr和Ala，或缺失；Y13选自Gly和Ala，或缺失；Y14 选自 Trp、INal 和 Phe ;Y15 选自 Leu、Nle、Thr 和 Phe ;以及Y17选自Phe和3_ (3_吡啶基)-丙氨酸。在又一个实施方案中，本发明提供了肽缀合物，其中Za是具有式IVa的肽序列His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Z9-Leu-Ser-Z12-Gln-Met-Glu-Z16-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-1le-Glu-Trp-Leu-Z27-Z28 (IVa)其中Z9 选自 Glu 和 Asp;Z12 选自 Lys 和 Orn ;Z16 选自 Glu 和 Lys ;Z27 选自 Lys 和 Orn ；Z28选自Asn和Asp，或缺失；L是具有式IVb的肽序列L1-L2-L3-L4(IVb)其中LI 选自 Orn> Peg3、Cys、Lys 和 Gln,或缺失；
L2 选自 Orn、Peg3、Cys、Lys 和 Gin,或缺失；L3 选自 Orn> Peg3、Cys、Lys 和 Gin,或缺失；L4 选自 Orn> Peg3、Cys、Lys 和 Gin,或缺失；Ya是具有式IVc的肽序列YI2-YI3-Trp-Leu-Asp-Phe(IVc)其中Y12为Tyr，或缺失；以及Y13 为 Gly，或缺失。·在又一个实施方案中，本发明提供了肽缀合物，其中Za为具有式Va的肽序列HiS-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Z9-Leu-Ser-ZI2-Tyr-Leu-Glu-Z16-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-1le-Glu-Phe-Leu-Z27-Z28(Va)其中Z9 选自 Glu 和 Asp ；Z12 选自 Lys 和 Orn ；Z16 选自 Glu 和 Lys ；Z27 选自 Lys 和 Orn ；Z28选自Asn和Asp，或缺失；L为具有式Vb的肽序列L1-L2-L3-L4 (Vb)其中LI 选自 Orn、Peg3、Cys、Lys 和 Gln,或缺失；L2 选自 Orn、Peg3、Cys、Lys 和 Gln,或缺失;L3 选自 Orn、Peg3、Cys、Lys 和 Gln,或缺失；L4 选自 Orn、Peg3、Cys、Lys 和 Gln,或缺失;Ya为具有式Vc的肽序列YI2-YI3-Trp-Leu-Asp-Phe(Vc)其中Y12为Tyr，或缺失；以及Y13 为 Gly，或缺失。另外，本发明提供了肽缀合物，其中所述式I的肽序列包含一个或更多个分子内桥。另外，本发明提供了肽缀合物，其中所述分子内桥在两个氨基酸残基的侧链之间形成，所述两个氨基酸残基被式I的线性氨基酸序列中的3个氨基酸分隔开。在一个特定的实施方案中，本发明提供了肽缀合物，其中所述分子内桥在残基对X和x+3、x+4、x+5等的侧链之间形成。在另一个特定的实施方案中，本发明提供了肽缀合物，其中所述分子内桥为内酰胺环。在又一个特定的实施方案中，本发明提供了肽缀合物，其中所述分子内桥涉及残基对，其中Z12 为 Lys 并且 Z16 为 Glu ；Z12 为 Glu 并且 Z16 为 Lys ；Z16 为 Glu 并且 Z20 为 Lys ；Z16 为 Lys 并且 Z20 为 Glu ；Z20 为 Glu 并且 Z24 为 Lys ；Z20 为 Lys 并且 Z24 为 Glu。在本发明的另一方面中，提供了具有式VI的肽缀合物R1-X-L-Y-R2 (VI) 其中R1为H、CV4烷基、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；R2 为 OH 或 NH2;X包含具有以下序列的GLP-1 (7-36)序列或其类似物XaHis-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-AIa-Ala-Lys-Glu-Phe-1le-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg(SEQ ID NO 114)L是包含多至4个天然或非天然氨基酸或者其组合的接头，或者缺失；Y包含具有以下序列的胃泌素-17序列或其类似物YaGln-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Yl5-Asp-Phe其中Y15 选自 Leu、Nle、Phe 和 Thr。在一个实施方案中，本发明提供肽缀合物，其中(i)相对于GLP-1的序列，Xa在多至5个位置上具有替换和/或包含I至2个氨基酸的C末端截短；和/或(ii)相对于胃泌素17的序列，Ya相对于胃泌素17的序列在多至5个位置上具有替换和/或包含I至13个氨基酸的N末端截短。在另一个实施方案中，本发明提供了肽缀合物，其中Xa为具有式VIIa的肽序列His-X8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-X26-Glu-Phe-1le-Ala-Trp-Leu-Val-X34-Gly-X36(VIIa)其中X8 选自 Ala、Aib 和 Gly ；X26 选自 Arg 和 Lys ；X34 选自 Arg 和 Lys ；X36 选自 Arg 和 Lys ；L为具有式VIIb的肽序列L1-L2-L3-L4 (VIIb)其中LI 选自 Serλ Ala、Lys、Orn、bAla、8Aoc、DBF、Peg3、Cys、Gln 或缺失；L2 选自 Serλ Ala、Lys、Orn、bAla、8Aoc、DBF、Peg3、Cys、Gln 或缺失；L3 选自 Serλ Ala、Lys、Orn、bAla、8Aoc、DBF、Peg3、Cys、Gln 或缺失；L4 选自 Serλ Ala、Lys、Orn、bAla、8Aoc、DBF、Peg3、Cys、Gln 或缺失；Ya为具有式VIIc的肽序列Yl-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Yll-Y12-Y13-Y14-Y15-Asp-Y17 (VIIc)
其中Yl为Gln或缺失；Y2为Gly或缺失；Y3为Pro或缺失；Y4为Trp或缺失；Y5为Leu或缺失；
Y6为Glu或缺失；Y7为Glu或缺失；Y8为Glu或缺失；Y9为Glu或缺失；YlO 为 Glu 或缺失；Yll 为 Ala 或缺失；Y12 选自 Ala、Tyr 或缺失；Y13 选自 Gly、Ala 或缺失；Y14 选自 Trp、PheUNal 和 Met ；Y15 选自 Leu、Nle、Phe 和 Thr ;以及Y17选自Phe和3_ (3_吡啶基)-丙氨酸。在又一个实施方案中，本发明提供了肽缀合物，其中Xa为具有式VIIIa的肽序列His-X8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-X26-Glu-Phe-1le-Ala-Trp-Leu-Val-X34-Gly-X36(VIIla)其中X8 选自 Ala、Aib 和 Gly ;X26 选自 Arg 和 Lys ；X34 选自 Arg 和 Lys ；X36 选自 Arg 和 Lys ；L为具有式VIIIb的肽序列L1-L2-L3-L4(VIIIb)其中LI 选自 Peg3、Orn> Cys> Lys> Gln 或缺失；L2 选自 Ser、Ala、Orn> Cys> Lys> Gln 或缺失；L3 选自 Lys、Ala、Cys> Orn> Gln 或缺失；L4 选自 Lys> Orn> Ala、Peg3、Cys> Lys> Gln 或缺失；Ya为具有式VIIIc的肽序列Y12-Y13-Y14-Y15-Asp-Phe (VIIIc)其中Y12 选自 Tyr、Ala 或缺失；Y13 选自 Gly、Ala 或缺失；Y14 选自 Trp 和 Phe ；以及
Y15 选自 Leu、Thr 和 Phe。在一个特定的实施方案中，本发明提供了肽缀合物，其中Xa为具有式IXa的肽序列His-X8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-X26-Glu-Phe-1le-Ala-Trp-Leu-Val-X34-Gly-X36(IXa)其中X8 选自 Ala、Aib 和 Gly ;X26 选自 Arg 和 Lys ；
X34 选自 Arg 和 Lys ；X36 选自 Arg 和 Lys ；L为具有式IXb的肽序列L1-L2-L3-L4(IXb)其中LI 选自 Orn> Peg3、Cys> Lys 和 Gln 或缺失；L2 选自 Orn> Peg3、Cys > Lys 和 Gln 或缺失；L3 选自 Orn> Peg3、Cys > Lys 和 Gln 或缺失；L4 选自 Orn> Peg3、Cys > Lys 和 Gln 或缺失；Ya为具有式IXc的肽序列Y12-Y13-Trp-Leu-Asp-Phe (IXc)其中Y12为Tyr或缺失；以及Y13 为 Gly 或缺失。在又一个特定的实施方案中，本发明提供了肽缀合物，其中至少一个Lys或Cys还与未脂取代基缀合。本发明的又一个方面涉及具有下式的肽缀合物或者其可药用盐或溶剂化物毒蜥外泌肽-4(l-39)-Peg3-Peg3-[Glnl，Leul5]胃泌素17，(I)毒蜥外泌肽-4(l_39)-[Glnl，Leul5]胃泌素17，(2)毒蜥外泌肽-4(l-39)-K_[Glnl，Leul5]胃泌素17，(3)毒蜥外泌肽-4(l_39)-AAA-[Glnl，Leul5]胃泌素I7，(4)毒蜥外泌肽-4(l-39)-SKK_[Glnl，Leul5]胃泌素17，(5)毒蜥外泌肽-4(l-39)-Peg3-SKK_[Glnl，Leul5]胃泌素17，(6)毒蜥外泌肽-4(l-39)-8Aoc-SKK_[Glnl，Leul5]胃泌素17，(7)毒蜥外泌肽-4(l-39)-DBF-SKK_[Glnl，Leul5]胃泌素17，(8)毒蜥外泌肽-4(l-39)-8Aoc-8Aoc-[Glnl，Leul5]胃泌素 17，(9)毒蜥外泌肽-4(l_39)-[Leu4]胃泌素6，(10)毒蜥外泌肽-4(1-39)-1(-[1^114](胃泌素6，(I I)毒蜥外泌肽-4(1-39)-AAA-[Leu4]胃泌素 6，(12)毒蜥外泌肽-4(1-39)-SKK-[Leu4]胃泌素 6，(13)毒蜥外泌肽-4(l-39)-Peg3-SKK-[Leu4]胃泌素6，(14)V6
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(9C)‘9 崖[^^!]-30V8-30V8-(8Z-T)歹-婶饭仞猶_[9000]
(SC)‘ 9 崖[^^I]-)HS-dga-(8Z-p 歹-婶饭仞猶_[17000]
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/ ΓΛ N6 r\m IM 「TTimlττ / r> η χ N τ Λν/ Υ m I , Idvfr-fWΓ ■ λ- λ
或GLP-1 (7-36)-8Aoc-8Aoc_[Leu4]胃泌素 6，(54)其中，每个毒晰外泌妝-4 (1-39)、毒晰外泌妝-4 (1-28)和GLP-1 (7-36)妝部分通过其C末端共价结合(S卩，连接或偶联)至各自缀合物分子的剩余部分，每个[Glnl，Leul5]胃泌素17和[Leu4]胃泌素6肽部分通过其N末端共价结合(即，连接或偶联)至各自缀合物分子的剩余部分。在一个特定的方面中，可通过标准合成方法、通过使用重组表达系统或通过任何其他合适的方法来制造本发明的肽缀合物。因此，所述缀合物可以以多种方式合成，包括例如以下方法(a)通过标准固相法或液相法逐步或通过片段组装来合成肽缀合物，并且分离和纯化肽缀合物终产物； (b)在宿主细胞中表达编码肽缀合物的核酸构建体，并从宿主细胞培养物中回收表达产物；或(C)进行编码肽缀合物的核酸构建体的无细胞体外表达，并回收表达产物；或者通过方法(a)、(b)或(C)的任意组合来获得肽缀合物片段，随后连接所述片段以获得肽缀合物，并回收肽缀合物。本发明的又一些方面为治疗多种病症、疾病或异常[包括糖尿病(I型和2型)以及多种糖尿病相关病症、疾病或异常]的方法，其包括施用本发明的肽缀合物(以游离形式或者以其可药用盐或溶剂化物的形式)以及包含本发明肽缀合物或者其可药用盐或溶剂化物的药物组合物。在一个特定的方面中，本发明的肽缀合物还可用作药剂用于治疗胰岛素抵抗、葡萄糖不耐受、糖尿病前期(pre-diabete)、空腹葡萄糖水平升高、I型和/或2型糖尿病、高血压和/或血脂异常(或者这些代谢风险因素的组合)、动脉粥样硬化(atherosclerosis)、动脉硬化(arteriosclerosis)、冠心病、外周动脉疾病和中风。它们还可用于预防体重增加、促进体重降低、降低体重超重和/或治疗肥胖症(例如通过控制食欲、进食、食物摄取、热量摄取和/或能量消耗)(包括病态肥胖)以及相关疾病、异常和健康状况(包括但不限于肥胖相关炎症、肥胖相关胆囊病和肥胖引起的睡眠呼吸暂停)。本发明的肽缀合物对这些病症的作用可以全部或部分地因对体重的作用所致或与独立于该作用。本发明的另一些方面将从以下的公开中显而易见。


图1.以100nmol/kg对小鼠静脉内(1. V.)和皮下(s. c.)施用之后相对于时间的平均血浆浓度(log-线性)。A :化合物33，B :化合物I。数据显示为平均值土SD，η = 3/数据点。图2.以IOOnmol化合物/kg的化合物33、74、76、77、78和80对小鼠s. c.施用之
后相对于时间的平均血浆浓度(log-线性)。η = 2/数据点。图3表示施用⑴本发明化合物I [毒蜥外泌肽-4(l-39)-Peg3-Peg3-[Glnl，Leul5]胃泌素17;见下文]的三种浓度(1、10和50nmol/kg)、(ii)毒蜥外泌肽-4(1-39)和h[Leul5]胃泌素17肽(每种肽为1、10和50nmol/kg)的1:1加和组合物的三种对应浓度和(iii)载剂之后在db/db糖尿病小鼠中总胰胰岛素含量的数据(单位为yg)。图4.小鼠中的Δ-血液葡萄糖。通过使用Kruskal-Wallis检验随后进行Dunn' s多重比较检验来分析数据P < O. 001。分别比较化合物33、毒蜥外泌肽-4、毒蜥外泌肽-4 (1-39)和h[Leul5]胃泌素17的组合以及载剂；n =每组16至19。图5.小鼠中的Δ血衆胰岛素。通过使用Kruskal-Wallis检验随后进行Dunn' s多重比较检验来分析数据P < O. 001。分别比较化合物33、毒蜥外泌肽-4、毒蜥外泌肽-4 (1-39)和h[Leul5]胃泌素17的组合以及载剂；n =每组16至19。图6.小鼠中的胰胰岛素含量。通过使用Kruskal-Wallis检验随后进行Dunn' s多重比较检验来分析数据，Mp <0.01。分别比较化合物33、毒蜥外泌肽-4、毒蜥外泌肽-4(1-39)和h[Leul5]胃泌素17的组合以及载剂；n =每组16至19。
图7.小鼠中的Δ-HbAlc。通过使用Kruskal-Wallis检验随后进行Dunn' s多重比较检验来分析数据，Mp <0.01,***p<0. OOl0分别比较化合物33、毒蜥外泌肽-4、毒蜥外泌肽-4(1-39)和h[Leul5]胃泌素17的组合以及载剂；n =每组16至19。图8.小鼠中的Δ-血衆C肽。通过使用Kruskal-Wallis检验随后进行Dunn' s多重比较检验来分析数据Zp <0.05。分别比较化合物33、毒蜥外泌肽-4、毒蜥外泌肽-4(1-39)和h[Leul5]胃泌素17的组合以及载剂；n =每组16至19。图9.在db/db小鼠中载入葡萄糖后通过曲线下面积(AUC)来测量SC施用毒蜥外泌肽-4、利拉鲁肽(Liraglutide)或化合物33对葡萄糖耐量的作用。施用三种治疗方案(A)预防，(B)治疗或(C)假期(Holiday)。数据表示为具有SEM的平均值(η = 8至13/组)。统计通过二因素ANOVA然后进行Bonferroni ' s事后检验(post-test)比较数据*p < O. 05 ；**p < O. 01 ；***p < O. 001，相对于载剂。图10.在db/db小鼠中SC施用毒蜥外泌肽_4、利拉鲁肽或化合物33对8小时禁食血液葡萄糖的影响。施用三种治疗方案(A)预防，(B)治疗或(C)假期。数据表示为具有SEM的平均值(η = 8至13/组)。统计通过二因素ANOVA然后进行Bonferroni , s事后检验比较数据*P < O. 05 ；**p < 0.01 ；***p < O. 001，相对于载剂。图11. SC施用毒蜥外泌肽-4、利拉鲁肽或化合物33对(A)血浆C-肽、(B)血浆胰岛素或(C)HbAlc(%)的最终(第93天)值的影响。数据表示为具有SEM的平均值(η =8至13/组)。统计通过单因素ANOVAKruskal-Wal I is检验随后进行Dunn' s MC检验比较数据< O. 001, **p < 0.01,*p < O. 05，相对于载剂。发明详述如上文所述，本发明的一个方面涉及具有以下式的肽缀合物或者其可药用盐或溶剂化物毒蜥外泌肽-4(l-39)-Peg3-Peg3-[Glnl，Leul5]胃泌素17，(I)毒蜥外泌肽-4(l_39)-[Glnl，Leul5]胃泌素17，
(2)毒蜥外泌肽-4(1-39)-K-[Glnl，Leu 15]胃泌素 17，
(3)毒蜥外泌肽-4(l-39)-AAA-[Glnl，Leul5]胃泌素17，(4)
(5)
(10)
(11)
(12)
(13)
(14)
(15)
(16)
(17)
(18)
(19)
(20)
(21)
(22)
(26)
毒蜥外泌肽-4 (1-39)-SKK-[Glnl，Leul5]毒蜥外泌肽-4(l-39)-Peg3-SKK-[Glnl，Leul5]胃泌素 17， 毒蜥外泌肽-4(l-39)-8Aoc-SKK-[Glnl，Leul 5]胃泌素 17， 毒蜥外泌肽-4 (1-39)-DBF-SKK-[Glnl，Leul5]胃泌素 17，毒蜥外泌肽-4(l-39)-8Aoc-8Aoc-[Glnl，Leul5]胃泌素 17，毒晰夕卜 泌月太-4(l_39)-[Leu4] f泌素17,(6)(7)(8)(9)素 6泌蜥外泌肽-4 (1- 3 9 ) - K - [ L e u 4 ]胃泌素6蜥外泌肽-4(l-39)-AAA-[Leu4]胃泌素蜥外泌肽-4(l-39)-SKK-[Leu4]毒蜥外泌肽-4 (1-39)-Peg3-SKK-[Leu4]毒蜥外泌肽-4(l-39)-Peg3_Peg3-[Leu4]毒蜥外泌肽-4(l-39)-8Aoc-SKK-[Leu4]毒蜥夕卜泌肽-4(l-39)-DBF-SKK-[Leu4]毒晰外泌妝 _4(l-39)-8Aoc_8Aoc-[Leu4]蜥外泌肽-4 (1-28) - [Glnl，Leul 5]蜥外泌肽-4(1-28)-K-[Glnl，Leu I 5]毒蜥外泌肽-4 (1-28)-AAA-[Glnl，Leul5]蜥外泌肽-4 (1-28)-SKK-[Glnl，Leul5]毒蜥外泌肽-4(l-28)-Peg3-SKK-[Glnl，Leul5]胃泌素 17，(23) 毒蜥外泌肽-4(l-28)-Peg3-Peg3-[Glnl，Leul5]胃泌素 17， 毒蜥外泌肽-4(l-28)-8Aoc-SKK-[Glnl，Leul5]胃泌素 17， 毒蜥外泌肽-4 (1-28)-DBF-SKK-[Glnl，Leul 5]毒蜥外泌肽-4(l-28)-8Aoc-8Aoc-[Glnl，Leul 5]胃泌素 17， 毒蜥夕卜泌肽-4(l-28)-[Leu4] P泌素泌素泌素泌素泌素泌素泌素17泌素17泌素17泌素17(24)(25)泌素17,(27) 泌素6 ,(28)毒蜥外泌肽-4(l-28)-K-[Leu4]胃泌素6， (2g)毒蜥外泌肽-4(l-28)_AAA-[Leu41胃泌素 6，
(30)毒蜥外泌肽-4(l-28)-SKK_[Leu4]胃泌素6，
(31)毒蜥外泌肽-4(1-28) -Peg3_SKK-[Leu4]胃泌素 6，
(32)毒蜥外泌肽-4(l-28)-Peg3_Peg3-[Leu4]胃泌素6,
(33)毒蜥外泌肽-4( 1-28) -8AOC-SKK-[Leu4]胃泌素 6，
(34)毒蜥外泌肽-4( 1-28) -DBF-SKK-[Leu4]胃泌素 6，
(35)毒蜥外泌肽-4(1-28)-8Aoc-8Aoc-[Leu4]胃泌素 6，
(36)GLP-l(7-36)-[Glnl, Leul 5]胃 泌 素 17，
(37)GLP-l(7-36)-K_[Glnl，Leul5]胃泌素 17，(38)GLP-l(7-36)_AAA-[Glnl，Leul5]胃泌素 17，(39)GLP-1 (7-36) -SKK-[Glnl, Leul5]Gastrinl7,(40)GLP-1 (7-36)-Peg3-SKK_[Glnl，Leul5]胃泌素 17，(41)GLP-1 (7-36)-Peg3-Peg3_[Glnl，Leul5]胃泌素 17，(42)GLP-1 (7-36)-8Aoc-SKK_[Glnl，Leul5]胃泌素 17，(43)GLP-1 (7-36)-DBF-SKK-[Glnl，Leul 5]胃泌素 17，(44)GLP-1 (7-36)-8Aoc-8Aoc-[Glnl，Leul5]胃泌素 17，(45)GLP-1 (7-36) - [Leu4]胃 泌 素 6，
(46)GLP-1 (7-36) - K- [Leu4]胃 泌 素 6，
(47)GLP-1 (7-36) - AAA-[Leu4]胃 泌 素 6，
(48)GLP-1 (7-36) - SKK-[Leu4]胃 泌 素 6，
(49)GLP-l(7-36)-Peg3-SKK_[Leu4]胃泌素 6，(50)GLP-l(7-36)-Peg3-Peg3_[Leu4]胃泌素 6，(51)GLP-l(7-36)-8Aoc-SKK_[Leu4]胃泌素 6，(52)GLP-l(7-36)-DBF-SKK_[Leu4]胃泌素 6(53)
或
GLP-1 (7-36)-8Aoc-8Aoc_[Leu4]胃泌素 6，(54)
其中，每个毒蜥外泌肽-4(1-39)、毒蜥外泌肽-4(1-28)和GLP-1 (7_36)肽部分通过其C末端共价连接至各自缀合物分子的其余部分，每个[Glnl，Leul5]胃泌素17和 [Leu4]胃泌素6肽部分通过其N末端共价连接至各自缀合物分子的其余部分。在另一个方面中，本发明涉及具有以下式的肽缀合物或者其可药用盐或溶剂化
毒蜥外泌肽-4(1-28) -Peg3-Peg3-[Leu3]胃泌素 5
(55)毒蜥外泌肽-4(1-28)-Peg3-Peg3-[Alal, Leu4]胃泌素 6
(56)毒蜥外泌肽-4(l-28)-Peg3-Peg3_[Ala2,Leu4]胃泌素 16
(57)毒蜥外泌肽|t -4(l-27)-Peg3-Peg3-[Leu4]胃泌素6
(58)毒蜥外泌肽|t -4(l-28)-Peg3-Peg3-[Leu2]胃泌素4
(59)[Leul4]毒蜥外泌肽-4(l-28)-Peg3-Peg3-[Leu4]胃泌素 6
(60)
毒蜥外泌肽-4(l-28)-Peg3_Peg3-[Leu4]胃泌素 6 (61)[Orn27]毒蜥外泌肽-4(l-28)-Peg3_Peg3-[Leu4]胃泌素 6 (62)[Phe25]毒蜥外泌肽-4(l-28)-Peg3_Peg3-[Leu4]胃泌素 6 63)[Asp28]毒蜥外泌肽-4(l-28)-Peg3-Peg3_[Leu4]胃泌素 6
(64)[Tyrl3]毒蜥外泌肽-4(l-28)-Peg3_Peg3-[Leu4]胃泌素 6
(65)
毒蜥外泌肽-4(l-28)-Peg3_Peg3-[Leu4]胃泌素 6
(66)毒蜥外泌肽-4 ( 1 - 2 8 ) - P e g 3 - [ L e u 4 ]胃 泌素6
(67)毒蜥外泌肽-4 ( 1 - 2 8 ) - [ L e u 4 ]胃 泌 素6
(68)毒蜥外泌肽-4 ( 1 - 2 7 ) - [ L e u 4 ]胃 泌 素1 1
(69)毒蜥外泌肽-4 ( 1 - 2 7 ) - P e g 3 - [ L e u 4 ]胃 泌素6
(70)0420]毒蜥夕卜泌肽-4 ( 1 - 2 7 ) - P e g 3 - [ L e u 3 ]胃 泌素5
(71)毒蜥夕卜泌月太-4 ( 1 - 2 6 ) - P e g 3 - [ L e u 3 ]胃 泌素5
(72)毒蜥夕卜 泌肽4 ( 1 - 2 7 ) - P e g 3 - [ L e u 2 ]胃 泌素4
(73)[Tyrl3, Leul 4]毒蜥外泌肽-4(l_27)-Peg3_Peg3-[Leu4]胃泌素 6
(74)[Tyrl3, Phe25]毒蜥外泌肽-4(1-27)寸683- 683-0^沾]胃泌素6
(75)[Leul4, Phe25]毒蜥外泌 Jft-4(l_27)-Peg3_Peg3-[Leu4]胃泌素6
(76)[Tyrl3, Leul4, Phe25]毒蜥外泌肽 ~4 (1-27) -Peg3-Peg3- [Leu4]胃泌素 6
(77)侧链-环([Lysl2, Glul6]毒蜥外泌肽-4(1-28)-卩683-卩683-0^沾]胃泌素6
(78)侧链-环([Glul6, Lys20]毒蜥外泌肽-4(1-28)-卩683-卩683-0^沾]胃泌素6
(79)侧链-环([Lys20, Glu24]毒蜥外泌肽-4(1-28)-卩683-卩683-0^沾]胃泌素6
(80)[Lysl6]毒蜥外泌肽-4(l-28)-Peg3_Peg3-[Leu4]胃泌素 6 (81)毒蜥夕卜泌月太-4(1-28)-Peg3-K-Peg3-[Leu4]胃泌素 6 (82)毒 蜥 夕卜 泌 肽-4 ( 1 - 2 8 ) - [ T h r 4 ]胃 泌 素6
(83)毒 蜥 夕卜 泌 肽-4 ( 1 - 2 8 ) - [ P h e 4 ]胃 泌 素6
(84)[Leul4]毒蜥夕卜泌肽 _4(l_28)-[lNal3,Leu4 胃泌素 6
(85)[ L e u 1 4 ]毒蜥夕卜泌月太-4 ( 1 - 2 8 ) - [ N 1 e 4 ]胃泌素6
(86)[Leul4]毒蜥外泌肽 _4(l_28)-[Leu4, [3-(3-Pyridyl)-Ala]6]胃泌素 6
(87)[Glu9, Leul4, Phe25, Tyrl3]毒蜥外泌月太-4(1-27)-卩6§3-卩6§3-[し6じ4]胃泌素6
(88)[Leul4, Phe25, Tyrl3]毒蜥外泌月太-4(1-27)-卩6§3-卩6§3-[し6じ4，Phe3]胃泌素6 (89)[Glu9,Leul4,Phe25,Tyrl3]毒蜥外泌月太-4(1-27)-卩6§3-卩6§3-[し6じ4，卩1^3]胃泌素6
(91)
素6
素6
素 6
(95)
(96)
(97)
(98)
(99)
(100)
(101)
(102)
(103)
(104)
(105)
(I 06)
(107)
(108)
(109)(90)[Arg27, Leul4, Phe25, Tyrl3]毒蜥外泌肽-4 (1-27)-Peg3_[Leu4]胃泌素 6[Argl2, 27，Leul4，Lysl6, Phe25, Tyrl3]毒蜥外泌肽-4 (1-27) -Peg3_[Leu4]胃泌 (g2)[Argl2, 27，Leul4，Lys20, Phe25, Tyrl3]毒蜥外泌肽-4 (1-27) -Peg3_[Leu4]胃泌(93)[Argl2, 27，Leul4，Lys24, Phe25, Tyrl3]毒蜥外泌肽-4 (1-27) -Peg3_[Leu4]胃泌(94)[Argl2, Leul4, Phe25, Tyrl3]毒蜥外泌肽-4 (1-27)-Peg3_[Leu4]胃泌素 6[G[G[G[G[G[G[G[G[Gu9, Leul4, Phe25, Tyru9, Leul4, Phe25, Tyru9, Leul4, Phe25, Tyru9, Leul4, Phe25, Tyru9, Leul4, Phe25, Tyru9, Leul4, Phe25, Tyru9, Leul4, Phe25, Tyru9, Leul4, Phe25, Tyru9, Leul4, Phe25, Tyr3]毒蜥外泌肽-4(l-27)-[Leu2]胃泌素3]毒蜥外泌肽-4(l-27)-Peg3-[Leu2]胃泌素43]毒蜥外泌肽-4(l-27)-0rn-Peg3-[Leu2]胃泌素 43]毒蜥外泌肽 4(l-27)-Peg3-0rn-[Leu2]胃泌素 43]毒蜥外泌肽-4 (1-27) -Orn-Orn- [Leu2]胃泌素 43]毒蜥外泌肽-4(l-27)-[Leu4]胃泌素63]毒蜥外泌肽-4(l-27)-Peg3-[Leu4]胃泌素63]毒蜥外泌肽-4(l-27)-0rn-Peg3-[Leu4]胃泌素 63]毒蜥外泌肽-4(l-27)-Peg3-0rn-[Leu4]胃泌素 3[Glu9, Leul4, Phe25, Tyrl3]毒蜥外泌肽-4(1-27)-0rn_0rn-[Leu4]胃泌素 6[Lys (十六酰基-异 Glu)34]GLP-1(7-37)-Peg3-Peg3-[Leu4]胃泌素 6[Arg34, Lys (十六酰基-异 Glu) 26] GLP-1 (7-37) -Peg3_Peg3- [Leu4]胃泌素 6[Arg26, 34，Lys (十六酰基-异 Glu) 36] GLP-1 (7-37) -Peg3_Peg3- [Leu4]胃泌素 6[Lys (十六酰基-异 Glu)26]GLP-1(7-37)-Peg3-Peg3-[Leu4]胃泌素 6
[Arg26,34, Gly8, -ys (十六酰基-异 Glu) 36]GLP_1 (7-37)-Peg3_Peg3-
[ L e u 4 ]胃泌素6 (110)
[Aib8, Arg34, Lys (十六酰基-异 Glu) 26]GLP-1 (7-37) -Peg3_Peg3-
[ L e u 4 ]胃泌素6 (111)
[Aib8，Arg34] GLP-1 (7-37)-Peg3-Peg3_ [Leu4]胃泌素 6 (112)
[Arg34]GLP-l(7-37)-Peg3-Peg3_[Leu4]胃泌 素 6 (113)
本发明肽缀合物的以上式(使用用于所研究多种肽部分的常规和广泛使用缩写/ 名称进行书写[即毒蜥外泌肽-4 (1-39)、毒蜥外泌肽-4 (1-28)和GLP-1 (7_36)])可以如下以常规全氨基酸序列形式进行书写(接头部分用粗体突出)
(SEQ ID NO I) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS- Peg3.Peg3-QGPffLEEEEEAYGffLDF-NH2
(SEQ IDNO 2)H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSQGPWLEEEEEAYGWLD F-NH2 (无接头)
(SEQ ID NO 3) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS- κ. QGPffLEEEEEAYGffLDF-NH2
(SEQ ID NO 4) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS- AAA QGPffLEEEEEAYGffLDF-NH2
(SEQ ID NO 5) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS- SKK-QGPffLEEEEEAYGffLDF-NH2
(SEQ ID NO 6) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS- Peg3-SKK· QGPffLEEEEEAYGffLDF-NH2
(SEQ ID NO 7) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAP PPS- saoc-SKK-QGPffLEEEEEAYGffLDF-NH2
(SEQ ID NO 8) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS- DBP-SKK-QGPffLEEEEEAYGffLDF-NH2
(SEQ ID NO 9) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS- 8Aoe-aAoc QGPffLEEEEEAYGffLDF-NH2
(SEQ ID NO :10)H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSYGWLDF_NH2 (无接头)
(SEQID NO :11)H_HGEGTFTSDLSKQM EEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-K-YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO 12)H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS- aaa. YGffLDF-NH2
(SEQ ID NO : 13) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS_SKK.YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO 14) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS- PegS-SKK -YGffLDF-NH2
(SEQ ID NO 15) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS- Peg3-Peg3-YGffLDF-NH2
(SEQ ID NO 16) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS- 8Aoc-SKK-YGffLDF-NH2
(SEQ ID NO 17) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS- DBF-SKK-YGffLDF-NH2
(SEQ ID NO 18) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS- 8Aoc-8Aoc-YGffLDF-NH2
(SEQID NO 19) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEffLKNQGPffLEEEEEAYGffLDF-NH2 (无接头)
QGPffLEEEEEAYGffLDF-NH224) H-HGEGTFTSDLSKQM EEEAVRLFIEffLKN- Peg3-Peg3- (SEQ ID NO20)H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEffLKN-K-QGPffLEEEEEAYGffLDF-NH2 (SEQ ID NO 21)H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEffLKN-aaa-QGPffLEEEEEAYGffLDF-NH2 (SEQ ID NO 22)H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEffLKN-SKK-QGPffLEEEEEAYGffLDF-NH2 (SEQ ID NO 2 3) H-HGEG TFT SD L SK QME EE A VRLF I E WLKN- Pega-SKK-
(SEQ ID NO ； QGPffLEEEEEAYGffLDF-NH2
(SEQ ID NO QGPffLEEEEEAYGffLDF-NH2
(SEQ ID NO QGPffLEEEEEAYGffLDF-NH2
(SEQ ID NO QGPffLEEEEEAYGffLDF-NH225) H-HGEG TFT SD L S KQME EE A V RLF I E WLKN- BAoc-SKK-26) H-HGEGTFT SD L SKQMEEEAVRLF I EWLKN- OBF-SKK-27) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLF IEWLKN- sAoc-1Aoc-
无接头)
(SEQID NO :28)H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-YGWLDF-NH2 (无接头)(SEQID NO 29) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEffLKN- K. YGffLDF-NH2(SEQID NO 30) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLF IEffLKN-減辠 YGffLDF-NH2(SEQID NO 31)H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEffLKN-SKK· YGffLDF-N H2(SEQID NO 32)H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEffLKN-Peg3~SKK- YGffLDF-NH2(SEQID NO 33)H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEffLKN-Pegl-PegS- YGWLDF-NH2(SEQID NO 34) H-HGEGTFTSDLSKQM EEEAVRLFI EffLKN- 8Aoc-SKK- YGffLDF-NH2(SEQI D NO 35)H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEffLKN-DBF-SKK- YGWLDF-NH2(SEQID NO 36)H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEffLKN-8Aoi>8Aoe- YGffLDF-NH2(seqid no :37)h-haegtftsdvssylegqaakefiawlvkgrqgpwleeeeeaygwldf-nh2((SEQ ID NO 38)H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-K-QGPWLEEEEEAYGWLDF-NH2 (SEQ ID NO 39)H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEF IAffLVKGR-嫩· QGPffLEEEEEAYGffLDF-NH2
(SEQ ID NO 4 0 ) H-H AE G T F T S D V S S Y LE G Q A AKE F I Aff L VKG R- sm, QGPffLEEEEEAYGffLDF-NH2
(SEQ I D NO 41) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGR- PegS-SKK-QGPffLEEEEEAYGffLDF-NH2
(SEQ ID NO 42) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGR- Peg3.Peg3-QGPffLEEEEEAYGffLDF-NH2
(SEQ ID NO 43) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGR- gAoc-SKK-QGPffLEEEEEAYGffLDF-NH2
(SEQ I D NO 44) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGR- DBF-SKK-QGPffLEEEEEAYGffLDF-NH2
(SEQ ID NO 45) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEF IAffLVKGR- 8Aoc-eAoc-QGPffLEEEEEAYGffLDF-NH2
(SEQ ID NO :46) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRYGWLDF-NH2 (无接头)
(SEQID NO 47) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGR- K. YGffLDF-NH2
(SEQ I D NO :48) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGR- MA. YGffLDF-NH2
(SEQ ID NO :49) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGR- SKK- YGffLDF-NH2
(SEQ ID NO 50) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGR- Peg3-SKK- YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO :51)H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGR-Peg3-Peg3- YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO :52) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGR- 8Ack>SKK- YGffLDF-NH2
(SEQ ID NO :53) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGR- DBF-SKK- YGffLDF-NH2
(SEQ I D NO :54) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGR- eAoc-SAoc- YGffLD F-NH2
(SEQ ID NO 55)H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEffLKN-PeiS-Peg1-GWLDF-NH2
(SEQ ID NO 56) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEffLKN- Peg3-Peg3- AGWLDF-NH2
(SEQ ID NO :57) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEffLKN- Peg34 eg3. YAffLDF-N H2
(SEQ ID NO :58) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEffLK- Peg3-Peg3- YGffLDF-N H2
(SEQ ID NO 59) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEffLKN- Peg3-Pee3- WLDF-NH2
(SEQ ID NO :60) H-HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEffLKN- PegS-Peg3- YGffLD F-NH2
(SEQ ID NO 61) H-HGEGTFTSDLS-Orn-QM EEEAVRLFIEWLKN- Pefll-PegS- YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO :62) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWL-Orn-N-Peg3-P_3-YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO 63) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEFLKN- Peg3-Peg3- YGffLDF-N H2
(SEQ ID NO :64) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEffLKD- Peg3-Peg3- YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO 65) H-HGEGTFTSDLSKYMEEEAVRLFIEffLKN- Peg3-Peg3- YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO :66) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAV-Orn-LFIEffLKN- Peg3-Peg3· YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO :67) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEffLKN- Peg3- YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO 68)H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNYGWLDF-NH2
(SEQ I D NO 69)H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKEEEEAYGWLDF-NH2
(SEQ ID NO :70)H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEffLK- Peg3- YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO 71) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEffLK- Peg3- GWLDF-NH2
(SEQ ID NO :72) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEffL- Peg3- GffLDF-N H2
(SEQ ID NO 73) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEffLK- Peg3- WLDF-NH2
(SEQ ID NO 74) H-HGEGTFTSDLSKYLEEEAVRLFI EffLK- PeS3-Peg3- YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO 75)H-HGEGTFTSDLSKYMEEEAVRLFIEFLK-PeflS-Peg1- YGWLDF-NH2
(SEQID NO 76) H-HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEFLK- Peg3-P<ig3- YGWLDF-NH2
(SEQ I D NO :77) H-HGEGTFTSDLSKYLEEEAVRLFIEFLK- Peg34>eg3- YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO 78) H-HGEGTFTSDLS-K ()-QME-E ()-EAVRLFIEffLKN- Pe8S-PeiS-YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO :79) H-HGEGTFTSDLSKQME-E () -EAV-K () -LFI EWLKN- PeS3-Pefl3. YGWLD F-NH2
(SEQ ID NO 80) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAV-K () -LF1-E () -WLKN- Pe33-Peg3· YGWLDF-NH2
(SEQID NO 81) H-HGEGTFTSDLSKQMEKEAVRLFIEffLKN- Peg3-Peg3- YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO 82) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEffLKN- psg3-K-peg3- YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO83)H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNYGWTDF-NH2
(SEQ ID NO84)H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFI EWLKNYGWFDF-NH2
(SEQ ID NO :85) H-HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEffLKNYG-1 Nal-LDF- NH2
(SEQ ID NO 86) H-HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEffLKNYGff- Nle. DF-NH2
(SEQ ID NO :87)H-HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNYGWLD-3-(3_吡啶基)_丙氨酰基]-NH2
(SEQ ID NO :88) H-HGEGTFTSELSKYLEEEAVRLFIEFLK-Peg3-Peg3. YGWLDF-NH2
(SEQID NO 89) H-HGEGTFTSDLSKYLEEEAVRLFIEFLK- Peg3-Peg3- YGFLDF-NH2
(SEQ I D NO 90) H-HGEGTFTSELSKYLEEEAVRLFI EFLK-Peg3-Peg3-YGFLDF-N H2
(SEQ ID NO 91) H-HGEGTFTSDLSKYLEEEAVRLFIEFLR- Peg3- YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO :92) H-HGEGTFTSDLSRYLEKEAVRLFIEFLR- PegS- YGffLD F-NH2
(SEQ ID NO 93) H-HGEGTFTSDLSRYLEEEAVKLFIEFLR- P*fl3- YGWLDF-N H2
(SEQ I D NO :94) H-HGEGTFTSDLSRYLEEEAVRLFIKFLR- Peg3· YGVWLDF-NH2
(SEQID NO 95) H-HGEGTFTSDLSRYLEEEAVRLFIEFLK- Peg3· YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO96)H-HGEGTFTSELSKYLEEEAVRLFIEFLKWLDF-NH2
(SEQ ID NO :97) H-HGEGTFTSELSKYLEEEAVRLFIEFLK- Peg3- WLDF-NH2
(SEQID NO 98) H-HGEGTFTSELSKYLEEEAVRLFIEFLK- Orn-Pep- WLDF-NH2
(SEQ I D NO :99) H-HGEGTFTSELSKYLEEEAVRLFIEFLK- Peg3-Orn- WLDF-NH2
(SEQ I D NO :1 00) H-HGEGTFTSELSKYLEEEAVRLFIEFLK- 0m-Om- WLDF-NH2
(SEQ ID NO 101)H-HGEGTFTSELSKYLEEEAVRLFIEFLKYGWLDF-NH2
(SEQ ID NO102)H-HGEGTFTSELSKYLEEEAVRLFIEFLK- Pe8S- YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO 103) H-HGEGTFTSELSKYLEEEAVRLFIEFLK- Orn-PegS- YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO 104) H-HGEGTFTSELSKYLEEEAVRLFIEFLK- Peg3-Om- YGWLDF-NH2(SEQ ID NO 105)H-HGEGTFTSELSKYLEEEAVRLFIEFLK-0rn-0rn-YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO : 106) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLV-K (十六酰基-异 Glu) -GRG- Peg3-Peg3- YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO : 107) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAA-K (十 Glu) -EFIAWLVRGRG- Peg3-Peg3- YGWLDF—NH2六酰基-异
(SEQ ID NO : 108) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAREFIAWLVRG-K (十六酰基-异 Glu) -G- PegS-PegS- YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO : 109) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAA-K (十六酰基-异 Glu) -EFIAWLVKGRG- PeaS-PefS- YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO : 11 O) H-HGEGTFTSDVSSYLEGQAAREFIAffLVRG-K (十六酰基-异 Glu) -G- Pegl-PegS- YGWLDF-NH2
(SEQID NO : 111) H-H-Aib-EGTFTSDVSSYLEGQAA-K (十六酰基-异 Glu) -EFIAWLVRGRG- PegS-Pe8S- YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO 112) H-H-Aib-EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVRGRG- PeflS-PegS-YGWLDF-NH2
(SEQID NO :113) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVRGRG- Pei1-PegS- YGWLDF-NH2
其中，缩写Peg3、8Aoc、DBF、INal、bAla、Orn、DPR、Dbu、Gaba 和 Aib 表不以下非天然氨基酸部分
Peg3 -NH-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-C (O)_ (衍生自 8-氛基-3,6- 二氧杂羊酸);
8Aoc -NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C (O)-(衍生自 8_ 氨基辛酸);
DBF
INal :1_萘基丙氨酸
bAla β -丙氨酸
Gaba Y -氨基丁酸
Aib α -氨基-异丁酸
Dbu : 二氨基丁酸
DPR :二氨基丙酸
Orn :鸟氨酸
因此，关于接头部分在本发明肽缀合物中的方向，接头部分例如-Peg3-Peg3-表示化学部分
-Nh-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-C(O)-,所述接头部分左边的-NH-...部分共价连接至所述肽缀合物的源自毒蜥外泌肽-4-或GLP-1-的部分，所述接头部分右边的..· -C(O)-部分共价连接至所述肽缀合物的源自胃泌素的部分。
关于其余的具体接头部分，-K-表示赖氨酸氨基酸残基，-AAA-表示-Ala-Ala-Ala-三肽残基，-SKK-表示-Ser-Lys-Lys-三肽残基。
在上述一些本发明肽缀合物中，应理解，GLP-1 (7-36)肽序列部分来源于人 GLP-1 (hGLP-Ι)序列或是其类似物。
在上述另一些本发明肽缀合物中，应理解，毒蜥外泌肽-4(1-39)肽序列部分来源于希拉毒蜥毒蜥外泌肽_4序列的序列或是其类似物。
同样，缀合物中的[Glnl，Leul5]胃泌素17和[Leu4]胃泌素6部分来源于人胃泌[衍生自4-(2-氨基乙基)-6- 二苯并呋喃丙酸]素。
应理解，SEQ ID NO 1等同于化合物1，SEQ ID NO 2等同于化合物2，等等。
应理解，每一种单独的上述肽缀合物I至54(即化合物I或化合物2或化合物 3...(等，直到化合物54))和以下公开的每一种单独的其他肽缀合物55至113(参见实施例2中的表2和3)(即化合物55或化合物56...(等，直到化合物113))或者其可药用盐或溶剂化物构成本发明另一个独立的方面。
在本发明的上下文中，除非氨基酸以其全名提及(例如丙氨酸、精氨酸等)，否则它们以其常规的三字母和/或单字母缩写(例如Ala或A为丙氨酸，Arg或R为精氨酸，等) 表不。
在本发明的上下文中，术语“肽缀合物”指其中第一肽部分直接或经连接(即桥连或间隔连接)化学部分通过共价化学键与第二肽部分结合(即，偶联或连接)的分子。
本发明的化合物可在肽序列内具有一个或更多个分子内内酰胺桥。列于表2的化合物中每个这种桥(由前缀“侧链-环”表示)在包含羧酸的侧链和另一个包含胺的侧链之间形成。两个氨基酸残基通常被线性序列中的3个氨基酸分隔开。
在本发明的肽缀合物中，毒蜥外泌肽-4或Za与天然毒蜥外泌肽_4可有至少75 % 的同一性，例如，至少80、85、90或95%。
在本发明的肽缀合物中，胃泌素或Ya与天然胃泌素可有至少70%的同一性，例如， 至少75、80、85、9·0或95%。在本发明的肽缀合物中，GLP-1或Xa与天然GLP-1可有至少 85%的同一性，例如，至少90或95%。
在一个实施方案中，本发明多肽可包含在
SEQ ID NO : 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22， 23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47， 48，49，50，5152，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73， 74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98， 99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112 和 113 中任一个给出的氨基酸序列，或者与一个或更多个所述序列有至少约80%、85%、90%、95%、97%、98%、 99%、99. 5%同一性的其功能性片段/变体或与其一个或更多个所述序列相比具有至多 20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或I个氨基酸替换的其功能性片段/变体(有或没有信号序列，有或没有用另一残基(如丝氨酸)替换一个或更多个半胱氨酸残基)以及至少2个氨基酸长度的其连续区段。
在一个实施方案中，本发明的多肽(i)与
SEQ ID NO : 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22， 23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47， 48，49，50，5152，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，6364，65，66，67，68，69，7071，72，73， 74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98， 99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112 和 113 中任一个或其部分具有至少99%的氨基酸序列同一性；或者(ii)包含
SEQ ID NO : 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，5152，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73， 74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98， 99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112 和 113 中任一个的至少 31、 32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、 57、58、59或60个连续氨基酸；或(iii)两者。
本发明上下文中的术语“可药用盐”(本发明肽缀合物的可药用盐)旨在表示对施用所述盐的患者或对象无害的盐。其可以是适当地从例如酸加成盐和碱式盐中选择的盐。酸加成盐的实例包括氯盐、柠檬酸盐和醋酸盐。碱式盐的实例包括其中阳离子选自以下的盐碱金属阳离子如钠离子或钾离子、碱土金属阳离子如钙离子或镁离子，以及取代的铵离子如N(Rj) (R2) (R3) (R4)+型离子(其中通常R1、R2、R3和R4独立地表示氢、任选取代的 CV6烷基或任选取代的C2_6烯基)。相关的Cu烷基的实例包括甲基、乙基、1-丙基和2-丙基。可能相关的C2_6稀基的实例包括乙稀基、1-丙稀基和2_丙稀基。另一些可药用盐的实例描述于 “Remington，sPharmaceutical Sciences，，，17 版，Alfonso R. Gennaro (编)， MarkPublishing Company, Easton, PA, U. S. A.，1985(及更新的版本)和 Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology,第三版，James Swarbrick (编)，Informa Healthcare USA (Inc.)，NY, USA, 2007,以及 J. Pharm. Sc1. 66 :2(1977)。
本发明上下文中的术语“溶剂化物”指在溶质(本文中为本发明的肽缀合物或其可药用盐)与溶剂之间形成的确定化学计量的复合物。这样的溶剂可以是例如水、乙醇或其他通常为小分子的可药用有机物，例如但不限于乙酸或乳酸。当所述溶剂是水时，这样的溶剂化物一般被称为水化物。
本发明的另一方面涉及用作药物的本发明肽缀合物或其可药用 盐。在又一方面， 所述药物是在有此需要的对象中治疗一种或更多种以下疾病或异常和相关病症的药物1 型糖尿病、2型糖尿病、糖尿病前期、胰岛素抵抗综合征、葡萄糖耐量降低(IGT)、与血液葡萄糖水平升高相关的疾病状态、高血糖症、高血压、致动脉粥样化血脂异常、动脉硬化(例如动脉粥样硬化)、冠心病、外周动脉疾病、中风、微血管病、胃病、代谢综合征、癌症(例如结肠癌)、炎性肠病(IBD)和肠易激综合征(IBS)。
其他可能相关的这样的疾病或异常包括肥胖症、病态肥胖、肥胖相关炎症、肥胖相关胆囊病和肥胖引起的睡眠呼吸暂停。
在又一方面，所述药物为用于在有此需要的对象中诱导胰岛新生(例如，用于促进在胰岛中新细胞的形成)的药物。
在又一方面，所述药物为用于在有此需要的对象中诱导胰岛细胞的存活(例如，用于预防胰岛中的β_细胞的损失)的药物。
在又一方面，所述药物为用于在有此需要的对象中预防胰岛中细胞凋亡(例如，用于预防胰岛中的β_细胞损失)的药物。
在又一方面，所述药物为用于在有此需要的对象中降低血液中血红蛋白blAc (糖基化血红蛋白，HblAc)水平的药物。
本发明的又一方面涉及本发明肽缀合物在制造在有此需要的对象中治疗一种或更多种以下病症、疾病或异常的药物中的用途1型糖尿病、2型糖尿病、糖尿病前期、胰岛素抵抗综合征、葡萄糖耐量降低(IGT)、与血液葡萄糖水平升高相关的疾病状态、高血糖症、高血压、致动脉粥样化血脂异常、动脉硬化(例如动脉粥样硬化)、冠心病、外周动脉疾病、 中风、微血管病、胃病、代谢综合征、癌症(例如结肠癌)、炎性肠病(IBD)和肠易激综合征 (IBS)。
本发明的肽缀合物还可用于
制造用于在有此需要的对象中诱导胰岛新生的药物；
制造用于在有此需要的对象中预防胰岛β -细胞凋亡的药物；或
制造用于在有此需要的对象中降低血液血红蛋白b IAc (糖基化血红蛋白，HblAc) 水平的药物。
其中，本发明的另一些方面为治疗上述病症、疾病或异常的相应方法。因此，本发明的一个这种另外的方面涉及在有此需要的对象中治疗一种或更多种下述疾病或异常的方法1型糖尿病、2型糖尿病、糖尿病前期、胰岛素抵抗综合征、葡萄糖耐量降低(IGT)、与血液葡萄糖水平升高相关的疾病状态、高血糖症、高血压、致动脉粥样化血脂异常、动脉硬化(例如动脉粥样硬化)、冠心病、外周动脉疾病、中风、微血管病、胃病、代谢综合征、癌症 (例如结肠癌)、炎性肠病(IBD)和肠易激综合征(IBS)，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的本发明肽缀合物或者其可药用盐或溶剂化物。
同样，与本发明的治疗方法可能相关的另一些病症、疾病或异常包括肥胖症、病态肥胖、肥胖相关炎症、肥胖相关胆囊病和肥胖引起的睡眠呼吸暂停。
本发明的又一方面涉及在有此需要的对象中诱导胰岛新生的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的本发明肽缀合物或者其可药用盐或溶剂化物。
本发明的又一方面涉及在有此需要的对象中促进胰岛细胞存活的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的本发明肽缀合物或者其可药用盐或溶剂化物。
本发明的又一方面涉及在有此需要的对象中减少或预防胰岛细胞凋亡的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的本发明肽缀合物或者其可药用盐或溶剂化物。
本发明的又一方面涉及在有此需要的对象中降低血液血红蛋白blAc(糖基化血红蛋白，HblAc)水平的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的本发明肽缀合物或者其可药用盐或溶剂化物。
本发明的另一些方面涉及如下
在有此需要的对象中治疗与血液葡萄糖水平升高相关的疾病状态的方法；
在有此需要的对象中降低血液葡萄糖水平的方法；
在有此需要的对象中刺激胰岛素释放的方法；
用于在有此需要的对象中调节胃排空的方法；以及
用于在有此需要的对象中降低血浆脂质水平的方法。
在本发明以上的每一种方法中，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的本发明肽缀合物或者其可药用盐或溶剂化物。
在上述本发明的治疗或其他治疗干预方法的背景下所使用的术语“治疗有效量” 指足以治愈、改善、缓解或部分抑制特定疾病、异常或病症(是所述治疗或其他治疗干预的目的)的临床表现的量。足以实现上述的量定义为治疗有效量。可调整施用量和施用方法以实现最佳效力。针对给定目的有效的量尤其取决于疾病、异常或病症(是特定治疗或其他治疗干预的目的)的严重程度，所述对象的体重和一般状况，饮食，可能的同时用药 (concurrent medication)以及医学领域技术人员公知的其他因素。确定最适于向人施用本发明肽缀合物或者其可药用盐或溶剂化物的适合剂量大小和给药方案可参考本发明所获得的结果，并可在恰当设计的临床试验中加以验证。可通过常规方法确定有效剂量和治疗方案，一开始在实验室动物中使用低剂量，而后提高剂量的同时监测效果，而且也系统地改变给药方案。在确定针对给定对象的最佳剂量时临床医生可考虑多种因素。这些考虑因素是本领域技术人员公知的。
在本文中所使用的术语“治疗”指用于获得有益或期望之临床结果的方法。为本发明的目的，有益或期望之临床结果(无论是可检测的或不可检测的)包括但不限于，缓解症状、减轻疾病程度、稳定(即不恶化)疾病状态、延迟或减缓疾病进展、改善或缓和疾病状态以及(部分或全部)缓解(remission)。“治疗”还可意指与未接受治疗时的预期存活时间相比延长存活。在一些实施方案中，“治疗”可以是以预防病症、疾病或异常的发生或改变其病理学为目的而进行的干预。因此，“治疗”可指治疗性干预或者预防或阻止性措施两者。因而需要治疗的对象(例如，人)可以是已经患所述疾病或异常的对象或者待预防异常的对象。因而术语“治疗”包括与缺乏治疗相比抑制或降低病理状态或症状(例如，体重增加或高血糖)严重程度的增加，并不一定指相关疾病、异常或病症的完全终止。
本发明上下文中所使用的术语“激动剂”指活化所述受体类型的物质(配体)。
本发明上下文中所使用的术语“GLP-1受体激动剂”(有时称为“GLP-1激动剂”)指活化GL P-1受体如人GLP-1受体的物质(配体)。活化人GLP-1受体的物质包括天然GLP-1 肽激素GLP-1 (7-37)、GLP-1 (7-36)酰胺、胃泌酸调节素、毒蜥外泌肽_3、毒蜥外泌肽-4、胰高血糖素、胃泌素抑制肽(GIP)以及其功能性肽类似物和衍生物。
本发明上下文中所使用的术语“拮抗剂”指阻断、中和或抵消针对所述受体类型具有激动剂功能之另一物质(配体)的作用的物质(配体)。
在本发明的上下文中，在本发明上述多个方面提及的需要特定治疗或其他治疗干预的对象优选为哺乳动物，并且更特别地为人。
本发明的另一方面涉及药物组合物，其包含本发明的肽缀合物或者其可药用盐或溶剂化物以及可药用载体、赋形剂或载剂。
肽缀合物的合成
本发明肽缀合物可通过标准合成方法、通过使用重组表达系统或者通过任何其他合适的方法制造。因此，所述缀合物可以以多种方法合成，包括，例如包括以下方法
(a)通过标准固相法或液相法逐步或通过片段组装来合成肽缀合物，并分离和纯化最终的肽缀合物产物；
(b)在宿主细胞中表达编码肽缀合物的核酸构建体，并从所述宿主细胞培养物中回收表达产物；或
(C)进行编码肽缀合物的核酸构建体的无细胞体外表达，并回收表达产物；
或者通过方法(a)、(b)或(C)的任意组合来获得肽缀合物片段，随后连接所述片段以获得肽缀合物，并回收所述肽缀合物。
可常常优选的是通过固相或液相肽合成来合成本发明的缀合物。在这一点上，可参考 W098/11125 或尤其是 Fields,GB.等，"Principles andPractice of Solid-PhasePeptide Synthesis " ； in Synthetic Peptides, GregoryA. Grant (编)，Oxford University Press (第二版,2002)和本文的合成实施例。
本发明化合物中的一个或更多个氨基酸侧链可进一步与亲脂取代基缀合。亲脂取代基可与氨基酸侧链中的原子共价结合，或者作为替代地，可通过间隔物与氨基酸侧链缀合。该氨基酸可以是肽Z的一部分或肽Y的一部分。
不希望受到理论的束缚，认为亲脂取代基结合血流中的白蛋白，从而保护本发明化合物免受酶降解，这可增强化合物的半衰期。所述间隔物(当存在时)用于在所述化合物和所述亲脂取代基之间提供间隔。
亲脂取代基可通过酯、磺酰酯、硫代酯、酰胺或磺酰胺与氨基酸侧链或间隔物连接。因此，应理解，优选的亲脂取代基包括酰基，磺酰基，形成酯、磺酰酯、硫代酯、酰胺或磺酰胺之一部分的N原子、O原子或S原子。
优选地，亲脂取代基中的酰基与氨基酸侧链或间隔物形成酰胺或酯的一部分。
亲脂取代基可包含具有4至30个C原子的烃链。优选地，它具有至少8或12个 C原子，优选地它具有24个或更少的C原子，或者20个或更少的C原子。烃链可以是线性的或有支链的，并且可以是饱和的或不饱和的。应理解，烃链优选地被这样的部分所取代， 所述部分形成与氨基酸侧链或间隔物的连接的一部分，例如酰基、磺酰基、N原子、O原子或 S原子。最优选地，所述烃链被酰基取代，因而烃链可以是烷酰基(例如棕榈酰基、己酰基、 月桂酰基、肉豆蘧酰基或硬酯酰基)的一部分。
因此，所述亲脂取代基可具有下式
A可以是例如酰基、磺酰基、NH、N_烷基、O原子或S原子，优选地为酰基。η为3至 29的整数，优选地至少为7或至少为11，优选地为23或更少，更优选地为19或更少。
烃链可进一步被取代。例如，其可被至多3个选自NH2、OH和COOH的取代基进一步取代。如果烃链被进一步取代，优选地其仅被一个取代基进一步取代。作为替代地或另外地，烃链可包含环烷烃或杂环烷烃，例如以下所示
优选地，所述环烷烃或杂环烷烃为六元环。最优选地，其为哌啶。
或者，亲脂取代基可基于环戊烷并菲骨架，其可以是部分或完全不饱和的或者饱和的。骨架中的每个碳原子可被Me或OH取代。例如，所述亲脂取代基可以是胆酰基 (cholyl)、脱氧胆酰基或石胆酰基(Iithocholyl)。
如上所述，亲脂取代基可通过间隔物缀合至氨基酸侧链。当存在时，间隔物连接至亲脂取代基和氨基酸侧链。间隔物可独立地通过酯、磺酰酯、硫代酯、酰胺或磺酰胺与亲脂取代基和氨基酸侧链连接。因此，其可包含独立地选自酰基、磺酰基、N原子、O原子或S原子的两个部分。所述间隔物可具有式
其中B和D各自独立地选自酰基、磺酰基、NH、N-烷基、O原子或S原子，优选地选自酰基和NH。优选地，η为I至10的整数，优选地为I至5的整数。所述间隔物还可被一个或多个选自以下的取代基进一步取代=Ch烷基、Cch6烷基胺、Cch6烷基羟基和Cch6烷基羧基。
或者，所述间隔物可具有两个或更多个上式的重复单元。对于每个重复单元，B、D 和η各自独立地选择。相邻的重复单元可通过其各自的B和D部分彼此共价连接。例如， 相邻重复单元的B和D部分可一起形成酯、磺酰酯、硫代酯、酰胺或磺酰胺。间隔物各端的游离B和D单元如上所述地连接至氨基酸侧链和亲脂取代基。
优选地，所述间隔物具有5个或更少的、4个或更少的或者3个或更少的重复单元。 最优选地，所述间隔物具有2个重复单元,或者为单个单元。
所述间隔物(或者间隔物的一个·或多个重复单元，如果其具有重复单元的话)可以是例如天然或非天然氨基酸。应理解，对于具有官能化侧链的氨基酸，B和/或D可以是氨基酸侧链中的部分。所述间隔物可以是任何天然的或非天然的氨基酸。例如，间隔物(或者间隔物的一个或多个重复单元，如果其具有重复单元的话)可以是Gly、Pro、Ala、Val、 Leu、lie、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Iys、Arg、Gin、Asn、a -Glu、γ -Glu、Asp、Ser、Thr、 Gaba、Aib、bAla、5_氨基戊酰基、6_氨基己酰基、7_氨基庚酰基、8_氨基辛酰基、9_氨基壬酰基或10-氨基癸酰基。
例如，所述间隔物可以是选自Y-Glu、Gaba、b-Ala和a-Gly的单个氨基酸。
所述亲脂取代基可缀合至本发明化合物中的任何氨基酸侧链。优选地，所述氨基酸侧链包括羧基、羟基、硫醇基、酰胺或胺基，用以与所述间隔物或亲脂取代基形成酯、磺酰酯、硫代酯、酰胺或磺酰胺。例如，所述亲脂取代基可缀合至Asn、Asp、Glu、Gin、His、Lys、 Arg、Ser、Thr、Tyr > Trp> Cys或Dbu> Dpr或Orn0优选地,所述亲脂取代基缀合至Lys或 Cys0然而，在本文提供的式中显示为Lys的任何氨基酸可在加入亲脂取代基处被替换为 Dbu、Dpr 或 Orn0
亲脂取代基和间隔物的实例在下式中显示
本文中，来自本发明化合物(例如来自X)的Lys通过酰胺部分与Y-Glu(间隔物)共价连接。棕榈酰基通过酰胺部分与Y-Glu间隔物共价连接。
作为替代地或另外地，本发明化合物中的一个或多个氨基酸侧链可缀合至聚合部分，例如，用以提高溶解性和/或体内(例如，血浆中)半衰期和/或生物利用度。还已知此类修饰降低治疗性蛋白质和肽的清除率(例如，肾清除率)。
所述聚合部分优选为水溶性(两亲的或亲水的)、无毒以及药学上惰性的。合适的聚合部分包括聚乙二醇(PEG)、PEG的同聚物或共聚物、PEG的单甲基取代聚合物(mPEG)或聚氧乙烯甘油(POG) ο 参见，例如，Int. J. Hematology68 1 (1998) ；Bioconjugate Chem. 6 150(1995)以及 Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Sys. 9 :249 (1992)。
其它合适的聚合部分包括聚氨基酸，如聚赖氨酸、聚天冬氨酸和聚谷氨酸(参见，例如，Gombotz 等，(1995)，Bioconjugate Chem.，卷 6 :332-351 ；Hudecz 等，(1992)， Bioconjugate Chem.,卷 3,49-57 ；Tsukada 等·(1984), J. Natl. Cancer Inst.,卷 73 : 721-729 ；以及 Pratesi 等(1985)，Br. J. Cancer,卷 52 :841-848)。
聚合部分可以是直链或有支链的。其可具有500至40，OOODa的分子量，例如500 至 10，OOODa,1000 至 5000Da、10，000 至 20，OOODa 或 20，000 至 40，OOODa0
化合物可包含两个或更多个此类部分，在这种情况下所有这些部分的总分子量通常落在以上提供的范围内。
聚合部分可偶联(或共价连接)至氨基酸侧链的氨基、羧基或硫醇基。优选的实例为Cys残基的硫醇基和Lys残基的ε -氣基,并且还可使用Asp和Glu残基的竣基。
本领域技术人员会了解可用于实施偶联反应的合适技术。例如，可采用从Nektar Therapeutics AL购得的试剂通过马来酰亚胺基连接将携带甲氧基的PEG部分偶联至Cys 的硫醇基。还参见W02008/101017以及上述针对合适化学性质的细节所引用的参考文献。
治疗用涂
以下，应理解关于本发明肽缀合物的用途也涵盖其可药用盐或溶剂化物的用途。
本发明肽缀合物可为代谢疾病或异常(包括糖尿病尤其是I型和/或2型糖尿病和可能的肥胖症)提供有吸引力的治疗选择。
糖尿病包括特征为由胰岛素分泌、胰岛素作用缺陷或这二者所引起之高血糖症的一组代谢疾病。糖尿病的急性症状包括尿产生过量、所导致的代偿性口渴和流体摄取增多、 视力模糊、原因不明的体重降低、嗜睡和能量代谢改变。糖尿病的慢性高血糖症与大血管和微血管并发症相关，所述并发症可导致多种器官(尤其是眼(尤其以糖尿病视网膜病的形式)、肾(以糖尿病性肾病的形式)、神经(以糖尿病神经病变的形式)、心脏和血管)的长期损伤、功能障碍和在一些情况下的最终衰竭。根据致病特征，糖尿病分为I型糖尿病、2型糖尿病和妊娠糖尿病。
I型糖尿病占全部糖尿病病例的5至10%，它是由于分泌胰岛素的胰细胞的自身免疫性破坏所引起的。
2型糖尿病占糖尿病病例的90至95%，它是一系列复杂代谢障碍的结果。2型糖尿病是内源性胰岛素产生和/或全身胰岛素敏感性不足以将血浆葡萄糖水平保持为低于诊断阈值的结果。
妊娠糖尿病是指怀孕期间鉴定的任何程度的葡萄糖不耐受。
还发现了称为糖尿病前期的病症。其包括，例如空腹葡萄糖水平受损和葡萄糖耐量降低，它通常指在血液葡萄糖水平升高但低于所确立的糖尿病临床诊断水平时发生的那些状态。
较大比例的2型糖尿病和糖尿病前期对象由于很普遍地具有其他代谢风险因素而具有更大的发病和死亡风险，所述风险因素包括腹部肥胖症(腹内部器官周围的脂肪组织过多)、致动脉粥样化血脂异常(血脂异常包括高甘油三酯水平、低HDL胆固醇水平和/ 或高LDL胆固醇水平，其促使斑块在动脉壁中形成)、血压升高(高血压)、血栓前状态(例如血液中存在高水平的纤维蛋白原或纤溶酶原激活物抑制因子-1)和促炎症状态(例如， 血液中C反应蛋白升高)。
相反，肥胖症使得例如糖尿病前期、2型糖尿病、某些类型的癌症、阻塞性睡眠呼吸暂停和胆囊病的发病风险增加。
血脂异常与心血管疾病风险增加相关。高密度脂蛋白(HDL)是有临床重要性的， 因为血浆HDL浓度与动脉粥样硬化性疾病风险之间存在负相关性。存储于动脉粥样硬化斑中的大多数胆固醇来自低密度脂蛋白(LDL)，因此LDL浓度的升高与动脉粥样硬化密切相关。HDL/LDL比率是评估动脉粥样硬化、尤其是冠状动脉粥样硬化的临床风险的指标。
不希望受到任何特定理论的束缚，认为本发明肽缀合物可出乎意料地将上述 GLP-1受体激动剂与胃泌素肽的的生理作用组合，该组合方式使得所观察到的活性可显著大于使用单独肽组分的相应加和性(非缀合)组合所观察到的。因此认为本发明的肽缀合物在治疗糖尿病前期、糖尿病(尤其是I型和/或2型糖尿病)以及糖尿病相关病症、疾病或异常(如以上所述那些)方面尤其有益，包括进行治疗从而促进胰岛β_细胞形成(胰岛新生)从而产生胰岛素，这对调节血液葡萄糖浓度有益。因此，本发明的肽缀合物尤其在限制或抑制I型和/或2型糖尿病疾病进展中可具有价值。
本发明的肽还可用于促进胰岛中细胞的存活和抑制其凋亡。GLP-1和胃泌素的作用包括作用于β_细胞增殖和成熟，而且防止β_细胞凋亡并增强新生，因此本发明肽的作用可包括此类作用和其对改善胰岛素和葡萄糖调节的作用。
本发明的肽缀合物还可用作药剂用于治疗胰岛素抵抗、葡萄糖不耐受、糖尿病前期、空腹葡萄糖水平升高、I型和/或2型糖尿病、高血压和/或血脂异常(或者这些代谢风险因素的组合)、动脉粥样硬化、动脉硬化、冠心病、外周动脉疾病和中风。它们还可用于预防体重增加、促进体重降低、减少过多体重和/或治疗肥胖症(例如通过控制食欲、进食、食物摄取、热量摄取和/或能量消耗)(包括病态肥胖)以及相关疾病、异常和健康状况(包括但不限于肥胖相关炎症、肥胖相关胆囊病和肥胖引起的睡眠呼吸暂停)。本发明的肽缀合物对这些病症的作用可以全部或部分地由它们对体重的作用引起，或者可以独立于该作用。
药物组合物
以下，应理解关于药物组合物中的一种或更多种本发明肽缀合物的内容也涵盖本发明肽缀合物的可药用盐或溶剂化物。
本发明的肽缀合物可配制成药物组合物，其适于在有或没有贮存的情况下施用， 并且所述药物组合物通常包含治疗有效量的至少一种本发明的缀合物和可药用载体、赋形剂或载剂。
术语“可药用载体”包括任何标准药用载体。用于治疗用途的可药用载体是药学领域公知的，并描述于例如"Remington' s PharmaceuticalSciences",第 17 版，Alfonso R. Gennaro (编),Mark Publishing Company,Easton,PA,USA, 1985 中。例如，可使用弱酸性或生理pH下的无菌盐水和磷酸盐缓冲盐水。合适的pH缓冲剂可以是，例如磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、 碳酸氢铵、二乙醇胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸或醋酸盐(例如醋酸钠)或者其混合物。该术语还涵盖在美国药典中所列的用于动物(包括人)的任何载体试剂。
本发明的药物组合物可采用单位剂型。在此类形式中，所述组合物被分成包含适当量的一种或更多种活性组分的单位剂量。所述单位剂型可表现为经包装的制剂，所述包装包含独立量的制剂，例如，经包装的片剂、胶囊剂以及小瓶或安瓿瓶中的粉末剂。单位剂型还可本身为例如胶囊剂、扁囊剂或片剂，或者可以为适当数目的任何这些经包装形式。单位剂型还可以以单剂量注射剂形式提供，例如采用包含液相(通常为水性)组合物的笔形装置(pen device)的形式。可将组合物配制成用于任何合适的施用途径和手段。可药用载体或稀释剂包括适于例如口服、intraviteral、经直肠、经阴道、经鼻、局部、经肠或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、经皮和透皮)施用或者通过吸入施用的制剂中使用的那些。制剂方便地以单位剂型存在，并可通过药物制剂领域公知的任何方法来制备。
皮下或透皮施用模式可对本发明的肽缀合物尤其适用。
本发明的又一方面涉及用于递送本发明药物制剂的装置、剂型和包装。因此，在本文描述的稳定的或保存的制剂或溶液中的至少一种肽缀合物或特定部分或变体可通过多种递送方法(包括如本领域所公知的SC或頂注射；透皮、经肺、经粘膜、植入、渗透泵、药筒 (cartridge)、微泵或其他技术人员所领会的方法)施用至根据本发明的患者。
本发明的又一方面涉及口服制剂和施用。用于口服的制剂可依赖于共同施用辅剂 (例如，间苯二酚和非离子型表面活性剂如聚氧乙烯油基醚和正十六烷基聚乙烯醚)以人为地提高肠壁的渗透性，以及共同施用酶抑制剂(例如，胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸 (DFF)和抑肽酶(trasylol))以抑制酶促降解。用于口服施用的固体型剂型的活性成分化合物可与至少一种添加剂混合，所述添加剂包括蔗糖、乳糖、纤维素、甘露醇、海藻糖、棉子糖、麦芽糖醇、葡聚糖、淀粉、琼脂、精氨酸盐/酯、几丁质、壳聚糖、果胶、黄蓍胶、阿拉伯胶、 明胶、胶原、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合物和甘油酯。这些剂型还可包含其他类型的添加剂，例如非活性稀释剂、润滑剂(如硬脂酸镁)、对羟基苯甲酸酯、防腐剂(如山梨酸、抗坏血酸、α-生育酚)、抗氧化剂(如半胱氨酸)、崩解剂、粘合剂、增稠剂、缓冲剂、甜味剂、 调味剂、香料，等。
MS
本发明上下文中使用的本发明肽缀合物的通常剂量为约0. 001至约100mg/kg体重/天，如约0. 01至约50mg/kg体重/天，例如约0. 05至约10mg/kg体重/天，以一个或更多个剂量施用，如I至3个剂量。如上文在一定程度上已指出的，施用的准确剂量将尤其依赖于待治疗疾病或异常的特性和严重程度；待治疗对象的性别、年龄、体重和一般情况；正在接受或待接受治疗的可能的其他伴发疾病或异常；以及医药领域技术人员已知的其他因素。
联合治疗
如上述，应理解下文中提及本发明的肽缀合物时也延伸至其可药用盐或溶剂化物以及包含多于一种不同本发明肽缀合物的组合物。
本发明的肽缀合物可作为联合治疗的一部分与用于治疗所述疾病或异常(例如， 糖尿病、肥胖症、代谢综合征、血脂异常或高血压)的另一种活性药剂一起施用，并且在这种情况下，可同时或分别给予两种活性药剂，例如作为同一药物组合物或制剂的成分，或者作为分开的制剂。
因此，本发明的肽缀合物可与已知类型的抗糖尿病药剂联合使用，所述抗糖尿病药剂包括但不限于二甲双胍、磺酰脲、格列奈类(glinide)、DPP-1V抑制剂、格列酮类 (glitazone)或者胰岛素或胰岛素类似物。在一个优选的实施方案中，本发明的肽缀合物与胰岛素或其类似物、DPP-1V抑制剂、磺酰脲或者二甲双胍(特别是磺酰脲或二甲双胍) 联合施用以实现充分的血糖控制。在一个更加优选的实施方案中，所述肽缀合物与胰岛素或胰岛素类似物联合施用以实现充分的血糖控制。适当的胰岛素类似物的实例包括但不限于 Lantus 、Novorapid > Humalog 、Novomix 、Actraphane HM> Levemir Degludec 和Apidra 。在这一点上其他相关的抗糖尿病药剂包括GLP-1受体激动剂，如艾塞那肽 (exenatide) (Byetta ;毒蜥外泌肽-4)和利拉鲁肽(Iiraglutide) (Victoza )。
本发明的肽缀合物还可以与已知类型的抗肥胖药剂联合使用，所述抗肥胖药剂包括但不限于肽YY或其类似物、神经肽Y(NPY)或其类似物、大麻素受体I拮抗剂 (cannabinoid receptorIantagonist)、脂肪酶抑制剂、人 prolslet 肽(HIP)、黑皮质素受体4激动剂(melanocortin receptor4agonist)或者黑色素浓集激素(melanin concentrating hormone)受体 I 拮抗剂。
本发明肽的缀合物还可以与已知类型的抗高血压药剂联合使用，所述抗高血压剂包括但不限于血管紧张肽转化酶抑制剂、血管紧张肽II受体阻断剂、利尿剂、β -阻断剂或钙通道阻断剂。
本发明的肽缀合物还可以与已知类型的抗血脂异常药剂联合施用，所述抗血脂异常药剂包括但不限于他汀类(statin)、贝特类(fibrate)、烟酸类(niacin)和/或胆固醇吸收抑制剂。
本发明的肽缀合物还可以与已知类型的质子泵抑制剂(即，具有药理学活性的药剂，如抑制剂H7K+-ATP酶)联合使用，所述质子泵抑制剂包括但不限于苯并咪唑衍生物型药剂或咪唑并卩比卩定衍生物型药剂，如Omeprazole 、Lansoprazole 、Dexlansoprazole 、 Esomeprazole 、Pantoprazole 、Rabeprazole 、Zolpidem 、Alpidem 、Sar ip idem 或 Necopidem 。
此外，本发明的肽缀合物还可以与已知类型的抗炎药剂联合施用，所述抗炎药剂包括但不限于留体类和皮质类固醇类，如倍氯米松、甲基泼尼松龙、倍他米松、泼尼松、地塞米松和氢化可的松；非留体类抗炎剂(NSAID)，如丙酸衍生物(例如，阿明洛芬、苯恶洛芬、布氯酸、卡洛芬、芬布芬、非诺洛芬、氟洛芬、氟比洛芬、布洛芬、吲哚 洛芬、酮洛芬、咪洛芬、萘普生、奥沙普秦、吡洛芬、普拉洛芬、舒洛芬、噻洛芬酸和硫恶洛芬)、醋酸衍生物(例如，吲哚美辛、阿西美辛、阿氯芬酸、环氯茚酸、双氯芬酸、芬氯酸、芬克洛酸、吩噻唑酸、呋罗芬酸、异丁芬酸、伊索克酸、欧比那酸(oxpinac)、舒林酸、噻平酸、托美丁、齐多美辛和佐美酸)、芬那酸衍生物(例如，氟芬那酸、甲氯芬那酸、甲芬那酸、尼氟灭酸和托芬那酸)、联苯羧酸衍生物(例如，二氟尼柳和氟苯沙酸)、昔康类(例如，伊索昔康、吡罗昔康、舒多昔康和替诺昔康)、水杨酸类(例如，乙酰水杨酸和柳氮磺吡啶)和吡唑啉酮类(例如，阿扎丙宗、 节哌立隆(bezpiperylon)、非泼拉酮、莫非保松、轻保泰松和苯基保泰松)；C0XII抑制剂如罗非昔布和塞来昔布；干扰素β制品(例如，干扰素β-la或干扰素β-lb);和某些其他化合物，如5-氨基水杨酸，以及其前药和可药用盐。
也证明二甲基胍具有抗炎特性[参见Haffner等，Diabetes54 :1566-1572(2005)] 并且因此也可用于本发明。
每个所引用的出版物和专利申请的全部内容通过引用并入本文。
以下实施例表明本发明的某些特定的实施方案。使用标准技术进行以下实施例， 所述标准技术除非另有详细说明，否则是本领域技术人员所公知的或常规的。应理解，这些实施例仅为说明性目的并且目的不在于确定本发明的条件或范围。同样，不应将它们解释为以任何方式限制本发明的范围。实施例
在实施例中所使用的缩写包括
NMP N-甲基吡咯烷酮
DCM: 二氯甲烷
DMF :N，N-二甲基甲酰胺
HATU :2_ (7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)_1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯
DIPEA :二异丙基乙胺
EtOH:乙醇
Et2O:乙醚
Peg3 :8_氛基-3,6_ 二氧杂羊酸基
8Aoc 8-氨基辛酰基
DBF :4-(2-氨乙基)_6_ 二苯并呋喃丙酰基
TFA:三氟乙酸
MeCN 乙腈
HPLC :高效液相色谱
MS :质谱
IBMX :3-异丁基-1-甲基黄嘌呤
BSA:牛血清白蛋白
cAMP :环腺苷一磷酸
DMEM =Dulbecco 改良的 Eagle 培养基
FCS :胎牛血清
HEPES :N_2-羟乙基哌嗪-N' _2_乙磺酸
p-ERK :磷酸化细胞外调节激酶
PBS :磷酸盐缓冲盐水
Boc :叔丁氧羰基
NEP N-甲基吡咯烷酮
利拉鲁肽[Arg34，Lys(十六酰基-异 Glu) 26] GLP-1 (7-37)
实施例1:化合物的合成和肽的特性
材料和方法
除非另有说明，否则以下使用的试剂和溶剂为市售标准实验室试剂或分析级，并且使用时没有进一步纯化。
合成本发明肽缀合物的一般方案
使用标准Fmoc化学，用CEM Liberty肽合成仪进行固相肽合成。使用前，在 NMP(IOml)中膨胀 TentaGel S Ram 树脂(lg ;0. 25mmol/g)，并使用 DCM 和 NMP 在管和反应容器之间转移。在适当处使用假脯氨酸(pseudoproline)(在肽合成期间用于尽可能减小聚集的二妝)，如 Fmoc-Phe-Thr (Ψ-Me, Me-pro) -OH 和 Fmoc-Asp-Ser (Ψ-Me, Me-pro) -0H, 并且形成Peg3、8Aoc和DBF接头部分(参见上文)的非天然氨基酸以Fmoc保护氨基酸(SP， 分别为Fmoc-Peg3-0H、Fmoc-8Aoc-0H和Fmoc-DBF-OH)形式使用，之后对一般方案没有任何改变。
偶联
在CEM Discover 微波单元中，将 NMP/DMF/DCM(I I I ；0. 2M ；5ml)中的 Fmoc-氨基酸与 HATU/NMP(0. 5M ；2ml)和 DIPEA/NMP(2. OM ；lml) 一起添加至树脂中。将偶联混合物加热至75°C 5分钟，同时将氮气以气泡形式通过该混合物。随后用NMP (4 X IOml) 洗涤该树脂。
去保护
将哌啶/NMP(20% ；10ml)添加至树脂中用于初始去保护，将该混合物微波加热 (40 0C ;30秒)。排干反应容器，添加第二份哌啶/NMP (20% ; 10ml)，再次加热(75 °C ;3分钟)。随后用NMP (6 X IOml)洗涤该树脂。
切割
用EtOH(3 X IOml)和Et2O (3 X IOml)洗涤树脂，并且在室温(r. t.)下干燥至恒重。 用TFA/乙二硫醇 (95/5，40ml，2小时；室温)处理从树脂上切割粗制肽。在减压下除去大部分TFA，沉淀粗制肽并且用Et2O洗涤3次，然后在室温下干燥至恒重。
纯化和表征
利用配置有合适的柱和级分收集器的PerSeptive Biosystems VISION工作站通过制备型反相HPLC纯化粗制肽至大于90%纯度，使用缓冲液A (O. 1% TFA, aq.)和缓冲液 B (O.1 % TFA, 90 % MeCN, aq.)的梯度运行。通过分析型HPLC和MS分析级分，合并相关级分并冻干。通过HPLC和MS表征终产物。
合成实施例
如上述，使用TentaGel S Ram 树脂(O. 67g ;0· 23mmol/g)和 Fmoc 化学，用 CEM Liberty肽合成仪合成毒蜥外泌肽_4 (1-39)-Peg3_Peg3_[Glnl, Leul5]胃泌素17 (化合物 I)。使用 Fmoc-8-氛基-3,6_ 二氧杂辛酸和假脑氛酸 Fmoc-Phe-Thr (Ψ-Me,Me-Pro)-OH 和 Fmoc-Ser (tBu) -Ser (Ψ-Me, Me-Pro) -0H。
如上述，从树脂上切割肽，以35ml/分钟的缓冲液A(0.1 % TFA ；aq.)和缓冲液 B (O. 1% TFA ；90% MeCN ；aq.)之混合物的流速，用 Gemin1-NX 柱(5X25cm ;10 μ m ;C18)进行纯化。经47分钟用从20%至50%缓冲液B的线性梯度洗脱产物，通过级分收集器收集级分(9ml)。用分析型HPLC和MS分析相关的级分，合并并冻干以得到白色粉末(122mg)，通过分析型HPLC分析为具有58%的纯度。
以4ml/ 分钟的缓冲液 A (O. 1% TFA ；aq.)和缓冲液 B (O. 1% TFA, 90% MeCN ；aq.) 之混合物的流速，用Luna柱(I X 25cm ；5ym；C8)对产物再次进行纯化。经47分钟用从20% 至50%缓冲液B的线性梯度洗脱产物，通过级分收集器收集级分(2ml)。用分析型HPLC和 MS分析相关的级分，合并并冻干以得到白色粉末(63mg)，通过分析型HPLC分析为具有82% 的纯度。
用TentaGel S Ram树脂(O. 70g ;0. 23mmol/g)和其他与上述用于合成和切割相同的条件合成化合物I的另一部分。
以35ml/分钟的缓冲液 A (O. 1% TFA ；aq.)和缓冲液 B (O. 1% TFA ；90% MeCN ；aq.) 之混合物的流速，用Gemin1-NX柱(5X 25cm ; 10 μ m ;C18)进行纯化。经47分钟用从20%至 50%缓冲液B的线性梯度洗脱产物，通过级分收集器收集级分(9ml)。用分析型HPLC和MS 分析相关的级分，合并并冻干以得到白色粉末(113mg)，通过分析型HPLC分析为具有57% 的纯度。
以4ml/ 分钟的缓冲液 A (O. 1% TFA ；aq.)和缓冲液 B (O. 1% TFA, 90% MeCN ；aq.) 之混合物的流速，用Luna柱(I X 25cm ；5ym；C8)再次对产物进行纯化。经47分钟用从20% 至55%缓冲液B的线性梯度洗脱产物，通过级分收集器收集级分(2ml)。用分析型HPLC和 MS分析相关的级分，合并并冻干以得到白色粉末(29mg)，通过分析型HPLC分析为具有77% 的纯度。
将来自第一合成(63mg;82%)和第二合成(29mg;77%)的产物合并，并且以4ml/ 分钟的缓冲液A (O. 1% TFA ；aq.)和缓冲液B (O. 1% TFA ；90% MeCN ；aq.)之混合物的流速， 用Kromasil柱(I X 25cm ;10 μ m ;C8)再一次进行纯化。经47分钟用从25%至65%缓冲液 B的线性·梯度洗脱产物，通过级分收集器收集级分(2ml)。用分析型HPLC和MS分析相关的级分，合并并冻干以得到白色粉末(33mg)，通过分析型HPLC分析为具有94%纯度。以MS 测得质量为6553. 39Da(计算值6553. 06Da)。
如上述，使用TentaGel S Ram 树脂(O. 55g ;0· 23mmol/g)和 Fmoc 化学，用 CEM Liberty肽合成仪合成毒蜥外泌肽_4 (1-28) -Peg3_Peg3-[Leu4]胃泌素6 (化合物33)。使用 Fmoc-8-氛基-3,6- 二氧杂辛酸和假脑氛酸 Fmoc-Phe-Thr (Ψ-Me, Me-Pro) -0H。
如上述，从树脂上切割肽，以35ml/分钟的缓冲液A(0.1 % TFA ；aq.)和缓冲液 B (O. 1% TFA ；90% MeCN ；aq.)之混合物的流速，用 Gemin1-NX 柱(5 X 25cm ; 10 μ m ;C18)进行纯化。经47分钟用从25%至55%缓冲液B的线性梯度洗脱产物，通过级分收集器收集级分(9ml)。用分析型HPLC和MS分析相关的级分，合并并冻干以得到白色粉末(70mg)，通过分析型HPLC分析为具有90%的纯度。以MS测得质量为4364. 08Da(计算值4364.1lDa)。
如上述，使用TentaGel S Ram 树月旨(1. 15g ;0· 25mmol/g)和 Fmoc 化学，用 CEM Liberty 妝合成仪使用 Fmoc-Phe-Thr (Ψ-Μθ,Μθ-Ργο) -OH合成[Glu9, Leul4, Phe25, Tyrl3] 毒蜥外泌肽-4 (1-27)-[Leu4]胃泌素6 (化合物101)。在偶联和去保护期间使用NEP替换 NMP0
如上述，从树脂上切割肽，以35ml/分钟的缓冲液A(0.1 % TFA ；aq.)和缓冲液 B(0. 1% TFA ；90% MeCN ；aq.)之混合物的流速，用 Gemin1-NX 柱(5X25cm ；10μ m ；C18)进行纯化。经47分钟用从20%至50%缓冲液B的线性梯度洗脱产物，通过级分收集器收集级分(9ml)。用分析型HPLC和MS分析相关的级分，合并并冻干以得到白色粉末(50mg)， 通过分析型HPLC进行分析为具有85%的纯度。以MS测得质量为3952. 00. 08Da(计算值 3951. 97Da)。
如上述，使用TentaGel S Ram 树月旨(1. 16g ;0· 23mmol/g)和 Fmoc 化学，用 CEM Liberty 肽合成仪合成 GLP-1 (7-36)-Peg3-Peg3-[Glnl，Leul5]胃泌素 17(化合物 42)。使用 Fmoc-8-氨基-3,6- 二氧杂辛酸和假脑氨酸 Fmoc-Ser (tBu) -Ser (Psi Me, Me Pro) -0H。
如上述，从树脂上切割肽，以35ml/分钟的缓冲液A(0.1 % TFA ；aq.)和缓冲液 B (O. 1% TFA ；90% MeCN ；aq.)之混合物的流速，用 Gemin1-NX 柱(5X25cm ;10 μ m ;C18)进行纯化。经47分钟用从25%至45%缓冲液B的线性梯度洗脱产物，通过级分收集器收集级分(9ml)。用分析型HPLC和MS分析相关的级分，合并并冻干以得到白色粉末(172mg)， 通过分析型HPLC进行分析为具有86 %的纯度。以MS测得质量为5664. 72Da(计算值 5664. 70Da)。
如上述，使用TentaGel S Ram 树脂(1. 30g ;0· 25mmol/g)和 Fmoc 化学，用 CEM Liberty 肽合成仪合成[Arg34, Lys (十六酰基-异 Glu) 26] GLP-1 (7-37)-Peg3_Peg3-[Leu4] 胃泌素6(化合物107)。在偶联和去保护期间使用NEP代替NMP。在酰化处使用 Fmoc-Lys (Dde) -OH 以及 Fmoc_8-氛基-3,6- 二氧杂辛酸和假脑氛酸 Fmoc-Phe-Thr (Ψ-Me, Me-Pro)-OH。
将连接固相的肽N末端使用DCM中的Boc20(330mg)和DIPEA (54 μ I)进行Boc保护。随后用水合肼/ΝΕΡ(4% ;2Χ 15分钟)切除Dde保护基团，用NEP(8X2分钟)、DIEA/ NEP(10% ；5Χ5分钟)和NEP(8X2分钟)洗涤树脂。使用Fmoc-Glu-OtBu和十六烷酸，如上述用CEMLiberty肽合成仪完成合成。在偶联和去保护期间使用NEP代替NMP。
如上述，从树脂上切割肽，以35ml/分钟的缓冲液A(0.1 % TFA ；aq.)和缓冲液 B (O. 1% TFA ；90% MeCN ；aq.)之混合物的流速，用 Gemin1-NX 柱(5X25cm ;10 μ m ;C18)进行纯化。经47分钟用从30%至70%缓冲液B的线性梯度洗脱产物，通过级分收集器收集级分(9ml)。用分析型HPLC和MS分析相关的级分，合并并冻干以得到白色粉末(60mg)，通过分析型HPLC分析为具有88%的纯度。以MS测得质量为4819. %Da(计算值4819. 45Da)。
实施例2 :通过本发明的肽缀合物体外活化(EC5tl)GLP-1受体和胃泌素CCK-B受体
材料和方法
人GLP-1受体(GLP-1R)效力测定
使用来自Perkin-Elmer 的 FlashPlate cAMP 试剂盒，通过测量 GLP-1 (7-36)、毒蜥外泌肽-4(1-39)或测试的本发明缀合物刺激受体后诱导的cAMP来评估本发明肽缀合物的体外作用。简言之，将表达人GLP-1R的HEK293细胞(通过转染GLP-1R的cDNA并且选择稳定克隆来产生的稳定细胞系)以40，000个细胞/孔接种在包被了 O. 01%聚-L-赖氨酸的96微孔板上，并在100 μ I生长培养基[DMEM，10% FCS，青霉素(100IU/ml)，链霉素 (100 μ g/ml)]中培养I天。在分析当天,去除生长培养基,用200 μ I Tyrode缓冲液[Tyrode 盐(9. 6g/l)，IOmM HEPES, pH7. 4]洗涤细胞I次。在37°C下在含有浓度递增的测试化合物、100 μ M IBMX和O.1 % BSA 的100 μ I Tyrode缓冲液中孵育细胞15分钟。通过添加 25 μ 10. 5Μ HCl终止反应，并在冰上孵育60分钟。进一步的详细方法参照W02008/152403。
CCK-B 受体(CCK-B R)效力测定
为了测试CCK-BR的结合和活化，我们以与产生hGLP_lR细胞系的(如上)类似的生产方法制备了表达人或小鼠CCK受体之一的稳定细胞系。简言之，我们使用HEK293 细胞用于转染全部克隆至转染质粒pIRES-neo2dNGFR的人或小鼠CCK-A R或CCK-B R[hCCK-A R(基因同一性L19315)、hCCK-B R(NM_176875)、mCCK-A R(NM_009827)和 mCCK-B R(NM_007627)]的cDNA。根据标准方案在生长培养基中培养细胞，并使用质粒用 Lipofectamin(Invitrogen)进行转染。使用G418在生长培养基(只有获得和整合入cDNA 表达质粒的细胞存活)中选择稳定表达CCK受体的细胞并繁殖。冷冻存活的细胞备用。
在分别稳定表达人和小鼠CCK-B R(高亲和性胃泌素受体)的HEK293细胞中通过测量p-ERK(使用AlphaScreen SureFire p_ERK测定)评估本发明肽缀合物的体外作用。 胃泌素受体效力测定(AlphaScreen SureFire p_ERK测定)如下进行
第I天细胞接种
将所述表达CCK-B R的细胞以20，000个细胞/孔接种在包被了聚D-赖氨酸的96 孔板的100 μ I生长培养基[DMEM,10% FCS，青霉素(100IU/ml)，链霉素(100 μ g/ml)]中。 将细胞在孵育器中(37°C，5% CO2)孵育2天。
第3天更换为无血清培养基
将生长培养基更换为80 μ I无血清培养基[DMEM，青霉素(100IU/ml)，链霉素 (100 μ g/ml)]/孔，在孵育器中(37°C，5% CO2)继续孵育细胞19小时。
第4天肽缀合物刺激和AlphaScreen SureFire p-ERK测定
1. 19小时后，加入含有5种不同浓度肽缀合物之一的20 μ I无血清培养基(每个浓度一式三份进行)，在室 温下孵育细胞5分钟。
2.立刻将板翻转以丢弃刺激培养基，每孔加入60μ I IX裂解缓冲液(来自 SureFire测定试剂盒)。
3.将板在板振动器上摇动5分钟,然后置于冰上。
4. SureFire P-ERK 测定将 4 μ I 各上清液转移至 384 孔 proxiplate (Perkin Elmer)。
5.将各4μ I的两个对照裂解物(未受刺激的和刺激的)添加至proxiplate, — 式两份。
6.将60份反应缓冲液、10份活化缓冲液、I份受体珠和I份供体珠混合(反应缓冲液+活化缓冲液+珠)。在proxiplate的每孔加入7 μ I上述反应缓冲液+活化缓冲液 +珠，在添加至孔之前，将混合物小心重悬。
7.在暗箱中在22°C孵育器中孵育板2小时。
8.使用适当的阅读程序(Perkin-Elmer)用Envision 光发射阅板器 (Perkin-Elmer)分析板。
在上述测定中测试本发明的肽缀合物(即，人GLP-1R活化效力、人CCK-B R活化效力和小鼠CCK-B R活化效力)。
人GLP-1 (7-36)和毒蜥外泌肽_4 (1-39)在人GLP-1受体(hGLP_lR)活性效力测定中用作阳性对照，h[Glnl，Leu15]胃泌素17和CCK-8 (由CCK的C末端8个活性氨基酸残基组成)在人CCK-B受体(hCCK-B R)效力测定和小鼠CCK-B受体(mCCK_B R)测定中用作阳性对照。
在本发明CCK受体活化研究中，h[Glnl，Leul5]胃泌素17 (具有序列H QGPffLEEEEEAYGffLDF-NH2)用作对照化合物。谷氨酰胺(Gln)残基可在一定程度上重排为 PyroGlu，但没有失去受体结合活性。
结果(EC5tl值,单位为mol/1)总结于下表1、Ia和2中。
表1.本发明化合物(肽缀合物)在活化hGLP-lR、hCCK-B R和mCCK_B R中的体外效力(EC50, mol/1) ο
化 合物号 ~33~" ..........37........肽缀合物參·外 a1.4(1-39)-Peg3-Peg3-[Gln1 ,Leul 5胃法素!.7hGLP-1 R EC50 5.68x10"1l} TTiiirir^ Ilixiirc~hCCK-B R EC50 1,90x10'3 Βδχ 35~~ 2.59x1 Ct'~mCCK-B R EC50 5.40x10'3 ~ 7.15x1 ~~ 7.31x10'" ^ 38GLP-1 {7-36)-K-[Gln1 ,Leul 5] f 泌素-178.42x10—17.73x1 Ci1.14x10—z39GLP-1 (7-36)-AAA-[Gln1.Leu 15] f 泌素 Π 一1.14x10'!C1.88x10'*5.41x10.a40GLP-1 f/-36)-SKK-[Gln1 ,Leul 5] f 泌素 171.16x10—w1.56x10's5.86x1 Oj5 ~41GLP-1 i7-36>-Peg3-SKK-[Gln1 ,Leul 5] f 泌素 I 9.26x10'°—"8.76χ θ'95.1 Ixfcr3—42GLP-1 (7-36)-Peg3-Peg3-[Gtn1 .Leu 15] f 泌素} 77.78x1 Om8.20x1 Oy5.83x10"43GLP-1 {7-36)-8Aoc-SKK-[Gln1 .Leu 15] f 泌素 17islxio^5.19x10'5aisxio"544GLP-1 (7-36)-DBF-SKK-[Gln1 ,Leul 5] 'f 泌素 | J1.37x1 O^i2.57x10'38.69x10'845GLP-1 (7-36)-8Aoc-8Aoc-[Gln1 .Leu15] f 泌素 171.22x10'*131.28x1 ~7.14x10^对眞GLP-1 ￠7-36)1.mxw''11时照毒外》狀...4(1-39)ImxW7tl对照h[Gln1.Leu15pt|:l74.69x1 Ojs1,82x16'5对照CCK-86.1x1 Ο**1.63x10-
表Ia.本发明化合物(肽缀合物)在活化hGLP-lR、hCCK_B R和mCCK-B R中的体外效力(EC50, mol/1) ο
力(EC50
权利要求
1.具有式I的肽缀合物 R1-Z-L-Y-R2(I)其中R1为H、Cy烷基、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；R2 为 OH 或 NH2 ；Z包含具有以下序列的毒蜥外泌肽-4(1-39)序列或其类似物Za His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-1le-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-P ro-SerL是任选的接头部分；以及Y包含具有以下序列的胃泌素17序列或其类似物YaGln-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Y15-Asp-Phe 其中 Y15 选自 Leu、Nle、Phe 和 Thr。
2.根据权利要求1所述的肽缀合物，其中(i)相对于所述毒蜥外泌肽_4的序列，Za在多至10个位置上具有替换和/或包含I 至12个氨基酸的C末端截短；和/或( )相对于所述胃泌素17的序列，Ya相对于所述胃泌素17的序列在多至5个位置上具有替换和/或包含I至13个氨基酸的N末端截短。
3.根据权利要求1或2所述的肽缀合物，其中 Za是具有式IIa的肽序列His-Z2-Z3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Z9-Z10-Zll-Z12-Z13-Z14-Glu-Z16-Z17-Z18-Z19 -Z20-Z21-Z22-Z23-Z24-Z25-Z26-Z27-Z28-Z29-Z30-Z31-Z32-Z33-Z34-Z35-Z36-Z37-Z38-Z39(IIa)其中Z2 选自 Gly、Ala、Ser、Aib、Thr、Leu 和 lie ;Z3选自Glu和Asp ；Z9选自Asp和Glu ；ZlO 选自 Leu, Val, Ile 和 Ala ；Zll 选自 Ser 和 Aib ；Z12 选自 Ser、Gin、Arg、Cys> Lys> Glu 和 Orn ；Z13 选自 Arg、Ser、Gin、Tyr 和 Glu ；Z14 选自 Gly、Cys> Phe> Tyr> Trp> Lys> Met> Leu、Nle 和 lie ;Z16 选自 Asp、Gly、Aib、Glu、Lys 和 Cys ；Z17 选自 Glu、Cys> Lys> Ser 和 Gln ；Z18 选自 Ala 和 Aib ；Z19 选自 Val、Leu、Ile 和 Ala ；Z20 选自 Arg、Lys、Cys、Orn 和 Glu ；Z21 选自 Leu 和 Glu ；Z22 选自 Phe 和 Ala ；Z23 选自 lie 和 Leu ；Z24 选自 Glu、Cys、Lys、Ala 和 Arg ；Z25 选自 Trp、Cys、Lys 和 Phe ；Z26 选自 Leu 和 lie ；Z27 选自 lie、Val、Gin、Lys、Cys、Arg 和 Orn ；Z28 选自 Asn、Ser、Asp、Aib、Gin、Lys、Cys、Arg、Tyr> bAla、Glu、Orn 和 Leu,或缺失； Z29选自Gly、Aib和bAla,或缺失；Z30 选自 Gly、Cys、Lys 和 Arg,或缺失；Z31选自Pro、Ser和Asp,或缺失；Z32选自Ser和Lys，或缺失；Z33为Ser，或缺失；Z34选自Gly和Lys，或缺失；Z35为Ala，或缺失；Z36为Pro，或缺失；Z37为Pro，或缺失；Z38为Pro，或缺失；Z39为Ser，或缺失；L为具有式lib的肽序列 Ll-L2-L3-L4(IIb)其中L1 选自 Ser、Ala、Lys、Orn、bAla、8Aoc、DBF、Peg3、Cys 和 Gin,或缺失；L2 选自 Ser、Ala、Lys、Orn、bAla、8Aoc、DBF、Peg3、Cys 和 Gin,或缺失；L3 选自 Ser、Ala、Lys、Orn、bAla、8Aoc、DBF、Peg3、Cys 和 Gin,或缺失；L4 选自 Ser、Ala、Lys、Orn、bAla、8Aoc、DBF、Peg3、Cys 和 Gin,或缺失；之为具有式lie的肽序列Yl-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Yll-Y12-Y13-Y14-Y15-Asp-Y17(IIc)其中Y1为Gln，或缺失；Y2为Gly，或缺失；Y3为Pro，或缺失；Y4为Trp，或缺失；Y5为Leu,或缺失；Y6为Glu，或缺失；Y7为Glu，或缺失；Y8为Glu，或缺失；Y9为Glu，或缺失；Y10为Glu，或缺失；Y11为Ala，或缺失；Y12选自Ala和Tyr，或缺失；Y13选自Gly和Ala，或缺失；Y14 选自 Trp, PheUNal 和 Met ；Y15 选自 Leu、Nle、Phe 和 Thr ；以及 Y17选自Phe和3-(3-吡啶基)_丙氨酸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的肽缀合物其中Za是具有式IIIa的肽序列His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Z9-Leu-Ser-Z12-Z13-Z14-Glu-Z16-Glu-Ala-Va 1-Z20-Leu-Phe-1le-Z24-Z25-Leu-Z27-Z28(IIIa)其中Z9选自Asp和Glu ；Z12 选自 Lys > Arg 和 Orn ；Z13 选自 Gln 和 Tyr ；Z14 选自 Met 和 Leu ；Z16 选自 Glu、Cys 和 Lys ；Z20 选自 Arg、Lys 和 Orn ；Z24 选自 Lys 和 Glu ；Z25 选自 Trp、Lys、Cys 和 Phe ；Z27 选自 Lys、Arg 和 Orn ；Z28选自Asn和Asp,或缺失；L是具有式IIIb的肽序列 L1-L2-L3-L4 (IIIb)其中LI 选自 Peg3、Gin、Cys> Lys 和 Orn,或缺失；L2 选自 Peg3、Gin、Cys> Lys 和 Orn,或缺失；L3 选自 Peg3、Gin、Cys> Lys 和 Orn,或缺失；L4 选自 Peg3、Gin、Cys> Lys 和 Orn,或缺失；Ya是具有式IIIc的肽序列 Y12-Y13-Y14-Y15-Asp-Y17 (IIIc)其中Y12选自Tyr和Ala，或缺失；Y13选自Gly和Ala，或缺失；Y14 选自 Trp、INal 和 Phe ；Y15 选自 Leu、Nle、Thr 和 Phe ；以及 Y17选自Phe和3-(3-吡啶基)_丙氨酸。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的肽缀合物，其中 Za是具有式IVa的肽序列His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Z9-Leu-Ser-Z12-Gln-Met-Glu-Z16-Glu-Ala-Va1-Arg-Leu-Phe-1Ie-Glu-Trp-Leu-Z27-Z28(IVa)其中Z9选自Glu和Asp ；Z12 选自 Lys 和 Orn ；Z16 选自 Glu 和 Lys ；Z27 选自 Lys 和 Orn ；Z28选自Asn和Asp,或缺失；L是具有式IVb的肽序列 L1-L2-L3-L4(IVb)其中LI 选自 Peg3、Gin、Cys> Lys 和 Orn,或缺失；L2 选自 Peg3、Gin、Cys> Lys 和 Orn,或缺失；L3 选自 Peg3、Gin、Cys> Lys 和 Orn,或缺失；L4 选自 Peg3、Gin、Cys> Lys 和 Orn,或缺失；Ya是具有式IVc的肽序列 Y12-Y13-Trp-Leu-Asp-Phe (IVc)其中Y12为Tyr，或缺失；以及 Y13为Gly，或缺失。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的肽缀合物，其中 Za为具有式Va的肽序列His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Z9-Leu-Ser-Z12-Tyr-Leu-Glu-Z16-Glu-Ala-Va1-Arg-Leu-Phe-1Ie-Glu-Phe-Leu-Z27-Z28(Va)其中Z9选自Glu和Asp ；Z12 选自 Lys 和 Orn ；Z16 选自 Glu 和 Lys ；Z27 选自 Lys 和 Orn ；Z28选自Asn和Asp,或缺失；L为具有式Vb的肽序列 L1-L2-L3-L4(Vb)其中LI 选自 Peg3、Gin、Cys> Lys 和 Orn,或缺失；L2 选自 Peg3、Gin、Cys> Lys 和 Orn,或缺失；L3 选自 Peg3、Gin、Cys> Lys 和 Orn,或缺失；L4 选自 Peg3、Gin、Cys> Lys 和 Orn,或缺失；Ya为具有式Vc的肽序列 Y12-Y13-Trp-Leu-Asp-Phe(Vc)其中Y12为Tyr，或缺失；以及Y13为Gly，或缺失。
7.根据前述权利要求中任一项所述的肽缀合物，其中式I的所述肽序列包含一个或更多个分子内桥。
8.根据权利要求7所述的肽缀合物，其中所述分子内桥在两个氨基酸残基的侧链之间形成，所述两个氨基酸残基被式I的线性氨基酸序列中的3个氨基酸分隔开。
9.根据权利要求8所述的肽缀合物，其中所述分子内桥在残基对X和x+3、x+4或x+5 的侧链之间形成。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的肽缀合物，其中所述分子内桥为内酰胺环。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的肽缀合物，其中所述分子内桥涉及残基对，其中Z12 为 Lys 并且 Z16 为 Glu ；Z12 为 Glu 并且 Z16 为 Lys ；Z16 为 Glu 并且 Z20 为 Lys ；Z16 为 Lys 并且 Z20 为 Glu ；Z20 为 Glu 并且 Z24 为 Lys ；Z20 为 Lys 并且 Z24 为 Glu。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的肽缀合物，其中Za与天然毒蜥外泌肽_4有至少75%的同一性，例如至少80、85、90或95%的同一性。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的肽缀合物，其中Ya与天然胃泌素有至少70% 的同一性，例如至少75、80、85、90或95%的同一性。
14.根据前述权利要求中任一项所述的肽缀合物，其中所述式I的肽具有以下序列或者其可药用盐或溶剂化物毒蜥外泌肽_4 毒蜥外泌肽_4 毒蜥外泌肽_4 毒蜥外泌肽_4 毒蜥外泌肽_4 毒蜥外泌肽_4 毒蜥外泌肽_4 毒蜥外泌肽_4 毒蜥外泌肽_4 毒蜥外泌肽_4 毒蜥外泌肽_4 毒蜥外泌肽_4 毒蜥外泌肽_4 毒蜥外泌肽_4 毒蜥外泌肽_4 毒蜥外泌肽_4 毒蜥外泌肽_4 毒蜥外泌肽_4 毒蜥外泌肽_4 毒蜥外泌肽4 (61-39)-Peg3-Peg3-[Glnl，Leul5]胃泌素 17， 1-39)-[Glnl，Leul5]胃泌素 17，1-39)-K-[Glnl，Leul5]胃泌素 17，1-39)-AAA-[Glnl，Leul5]胃泌素 17，1-39)-SKK-[Glnl，Leul5]胃泌素 17，1-39)-Peg3-SKK-[Glnl，Leul5]胃泌素 17， 1-39)-8Aoc-SKK-[Glnl，Leul5]胃泌素 17， 1-39)-DBF-SKK-[Glnl，Leul5]胃泌素 17， 1-39)-8Aoc-8Aoc-[Glnl，Leul5]胃泌素 17， 1-39)-[Leu4]胃泌素 6，1-39)-K-[Leu4]胃泌素 6，1-39)-AAA-[Leu4]胃泌素 6，1-39)-SKK-[Leu4]胃泌素 6， l-39)-Peg3-SKK-[Leu4]胃泌素 6， l-39)-Peg3-Peg3-[Leu4]胃泌素 6， l-39)-8Aoc-SKK-[Leu4]胃泌素 6，1-39)-DBF-SKK-[Leu4]胃泌素 6， l-39)-8Aoc-8Aoc-[Leu4]胃泌素 6，1-28)-[Glnl, Leul5]胃泌素 17，-28)-K-「GinI，Leu15 胃泌素 17，毒蜥外泌肽_4 毒蜥外泌肽_4 毒蜥外泌肽_4 毒蜥外泌肽_4 毒蜥外泌肽_4 毒蜥外泌肽_4 毒蜥外泌肽_4 毒蜥外泌肽_4 毒蜥外泌肽4 ( 毒蜥外泌肽_4 毒蜥外泌肽_4 毒蜥外泌肽_4 毒蜥外泌肽_4 毒蜥外泌肽_4 毒蜥外泌肽_4 毒蜥外泌肽_41-28)-AAA-[Glnl，Leul5]胃泌素 17，1-28)-SKK-[Glnl，Leul5]胃泌素 17，1-28)-Peg3-SKK-[Glnl，Leul5]胃泌素 17， 1-28)-Peg3-Peg3-[Glnl，Leul5]胃泌素 17， 1-28)-8Aoc-SKK-[Glnl，Leul5]胃泌素 17， 1-28)-DBF-SKK-[Glnl，Leul5]胃泌素 17， 1-28)-8Aoc-8Aoc-[Glnl，Leul5]胃泌素 17， 1-28)-[Leu4]胃泌素 6，-28)-K-[Leu4]胃泌素 6，1-28)-AAA-[Leu4]胃泌素 6，1-28)-SKK-[Leu4]胃泌素 6， l-28)-Peg3-SKK-[Leu4]胃泌素 6， l-28)-Peg3-Peg3-[Leu4]胃泌素 6， l-28)-8Aoc-SKK-[Leu4]胃泌素 6，1-28)-DBF-SKK-[Leu4]胃泌素 6， l-28)-8Aoc-8Aoc-[Leu4]胃泌素 6。
15.根据权利要求1至11所述的肽缀合物，其中所述式I的肽具有以下序列或者其可药用盐或溶剂化物毒蜥外泌肽-4(l-28)-Peg3-Peg3-[Leu3]胃泌素 5毒蜥外泌肽 _4 (1-28)-Peg3_Peg3-[Alal, Leu4]胃泌素 6毒蜥外泌肽-4(l-28)-Peg3-Peg3-[Ala2，Leu4]胃泌素 6毒蜥外泌肽-4(l-27)-Peg3-Peg3-[Leu4]胃泌素 6毒蜥外泌肽-4(l-28)-Peg3-Peg3-[Leu2]胃泌素 4[Leul4]毒蜥外泌肽-4 (1-28)-Peg3_Peg3-[Leu4]胃泌素 6[Orn12]毒蜥外泌肽-4 (1-28)-Peg3_Peg3-[Leu4]胃泌素 6
毒蜥外泌肽-4 (1-28)-Peg3_Peg3-[Leu4]胃泌素 6[Phe25]毒蜥外泌肽-4(l-28)-Peg3-Peg3-[Leu4]胃泌素 6[Asp28]毒蜥外泌肽-4(l-28)-Peg3-Peg3-[Leu4]胃泌素 6[Tyrl3]毒蜥外泌肽 4 (1-28)-Peg3_Peg3-[Leu4]胃泌素 6
毒蜥外泌肽-4 (1-28)-Peg3_Peg3-[Leu4]胃泌素 6毒蜥外泌肽-4(l-28)-Peg3-[Leu4]胃泌素6毒蜥外泌肽-4(l-28)-[Leu4]胃泌素6毒蜥外泌肽-4(l-27)-[Leu4](胃泌素11毒蜥外泌肽-4(l-27)-Peg3-[Leu4]胃泌素6毒蜥外泌肽-4(l-27)-Peg3-[Leu3]胃泌素5毒蜥外泌肽-4(l-26)-Peg3-[Leu3]胃泌素5毒蜥外泌肽-4(l-27)-Peg3-[Leu2]胃泌素4[Tyrl3, Leul4]毒蜥外泌肽-4 (1-27)-Peg3_Peg3-[Leu4]胃泌素 8Tyrl3, Phe25]毒蜥外泌肽-4 (1-27)-Peg3_Peg3-[Leu4]胃泌素 6[Leul4, Phe25]毒蜥外泌肽-4 (1-27)-Peg3_Peg3-[Leu4]胃泌素 6Tyrl3, Leul4, Phe25]毒蜥外泌肽-4 (1-27)-Peg3_Peg3-[Leu4]胃泌素 6侧链-环([Lysl2，Glul6]毒蜥外泌肽-4(1-28)-Peg3_Peg3-[Leu4]胃泌素 6侧链-环([Glul6, Lys20]毒蜥外泌肽-4 (1-28)-Peg3_Peg3-[Leu4]胃泌素 6侧链-环([Lys20，Glu24]毒蜥外泌肽-4 (1-28)-Peg3_Peg3-[Leu4]胃泌素 6[Lysl6]毒蜥外泌肽-4 (1-28)-Peg3_Peg3-[Leu4]胃泌素 6毒蜥外泌肽-4(l-28)-Peg3-K-Peg3-[Leu4]胃泌素 6毒蜥外泌肽-4(l-28)-[Thr4]胃泌素6毒蜥外泌肽-4(l-28)-[Phe4]胃泌素6[Leul4]毒蜥外泌肽-4(l-28)-[lNal3，Leu4]胃泌素 6[Leul4]毒蜥外泌肽-4 (1-28)-[Nle4]胃泌素6[Leul4]毒蜥外泌肽 _4 (1-28) _[Leu4, [3- (3-Pyridyl) -Ala] 6]胃泌素 6 [Glu9, Leul4, Phe25, Tyrl3]毒蜥外泌肽-4 (1-27)-Peg3_Peg3-[Leu4]胃泌素 6 [Leul4, Phe25, Tyrl3]毒蜥外泌肽-4 (1-27)-Peg3_Peg3-[Leu4，Phe3]胃泌素 6 [Glu9, Leul4, Phe25, Tyrl3]毒蜥外泌肽-4 (1-27) -Peg3_Peg3-[Leu4，Phe3]胃泌素 6 [Arg27, Leul4, Phe25, Tyrl3]毒蜥外泌肽-4 (1-27)-Peg3_[Leu4]胃泌素 6 [Argl2, 27，Leul4, Lysl6, Phe25, Tyrl3]毒蜥外泌肽-4 (1-27) -Peg3_[Leu4]胃泌素 6 [Argl2, 27，Leul4, Lys20, Phe25, Tyrl3]毒蜥外泌肽-4 (1-27) -Peg3_[Leu4]胃泌素 6 [Argl2, 27，Leul4, Lys24, Phe25, Tyrl3]毒蜥外泌肽-4 (1-27) -Peg3_[Leu4]胃泌素 6 [Argl2, Leul4, Phe25, Tyrl3]毒蜥外泌肽-4 (1-27)-Peg3_[Leu4]胃泌素 6丨_[Leu2]胃泌素4 -Peg3-[Leu2]胃泌素 4 -0rn-Peg3- [Leu2]胃泌素 4 -Peg3-0rn- [Leu2]胃泌素 4 -Orn-Orn- [Leu2]胃泌素 4 -[Leu4]胃泌素.6 -Peg3-[Leu4]胃泌素 6 -0 rn-Peg3-[Leu4]胃泌素 6 -Peg3-0rn- [Leu4]胃泌素 6 -Orn-Orn- [Leu4]胃泌素 6。[Gu9,Leul4，Phe25，Tyr3]毒蜥外泌肽-4 (1-27[Gu9,Leul4，Phe25，Tyr3]毒蜥外泌肽-4 (1-27[Gu9,Leul4，Phe25，Tyr3]毒蜥外泌肽-4 (1-27[Gu9,Leul4，Phe25，Tyr3]毒蜥外泌肽-4 (1-27[Gu9,Leul4，Phe25，Tyr3]毒蜥外泌肽-4 (1-27[Gu9,Leul4，Phe25，Tyr3]毒蜥外泌肽-4 (1-27[Gu9,Leul4，Phe25，Tyr3]毒蜥外泌肽-4 (1-27[Gu9,Leul4，Phe25，Tyr3]毒蜥外泌肽-4 (1-27[Gu9,Leul4，Phe25，Tyr3]毒蜥外泌肽-4 (1-27[Gu9,Leul4，Phe25，Tyr3]毒蜥外泌肽-4 (1-27
16.具有式VI的肽缀合物R1-X-L-Y-R2(VI)其中R1为H、Cy烷基、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；R2 为 OH 或 NH2 ；X包含具有以下序列的GLP-1 (7-36)序列或其类似物Xa，His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AIa-Lys-Glu-Phe-1le-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-ArgL是包含多至4个天然或非天然氨基酸或者其组合的接头，或者缺失；Y包含具有以下序列的胃泌素-17序列或其类似物YaGln-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Y15-Asp-Phe 其中 Y15 选自 Leu、Nle、Phe 和 Thr。
17.根据权利要求16所述的肽缀合物，其中(i)相对于所述GLP-1的序列，Xa在多至5个位置上具有替换和/或包含I至2个氨基酸的C末端截短；和/或( )相对于所述胃泌素17的序列，Ya相对于所述胃泌素17的序列在多至5个位置上具有替换和/或包含I至13个氨基酸的N末端截短。
18.根据权利要求16至17中任一项所述的肽缀合物，其中 Xa为具有式VIIa的肽序列His-X8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-X26-Glu-Phe-1le-Ala-Trp-Leu-Val-X34-Gly-X36(VIIa)其中X8 选自 Ala、Aib 和 Gly ；X26选自Arg和Lys X34选自Arg和Lys X36选自Arg和Lys L为具有式VIIb的肽序列 L1-L2-L3-L4 (VIIb)其中LI 选自 Ser、Ala、Lys> Orn> bAla、8Aoc、DBF、Peg3、Cys> Gin,或缺失 L2 选自 Ser> Ala、Lys> Orn> bAla、8Aoc、DBF、Peg3、Cys> Gin,或缺失 L3 选自 Ser> Ala、Lys> Orn> bAla、8Aoc、DBF、Peg3、Cys> Gin,或缺失 L4 选自 Ser> Ala、Lys> Orn> bAla、8Aoc、DBF、Peg3、Cys> Gin,或缺失 Ya为具有式VIIc的肽序列Yl-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Yll-Y12-Y13-Y14-Y15-Asp-Y17(VI Ic)其中Yl为Gln，或缺失 Y2为Gly，或缺失 Y3为Pro，或缺失 Y4为Trp，或缺失 Y5为Leu,或缺失 Y6为Glu，或缺失 Y7为Glu，或缺失 Y8为Glu，或缺失 Y9为Glu，或缺失 YlO为Glu，或缺失；Yll为Ala，或缺失；Y12选自Ala、Tyr，或缺失；Y13选自Gly、Ala，或缺失；Y14 选自 Trp、Phe、INal 和 Met ；Y15 选自 Leu、Nle、Phe 和 Thr ；以及 Y17选自Phe和3-(3-吡啶基)_丙氨酸。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的肽缀合物，其中Xa为具有式VIIIa的肽序列His-X8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Al a-X26-Glu-Phe-1le-Ala-Trp-Leu-Val-X34-Gly-X36(VIIla)其中X8 选自 Ala、Aib 和 Gly ；X26 选自 Arg 和 Lys ；X34 选自 Arg 和 Lys ；X36 选自 Arg 和 Lys ；L为具有式VIIIb的肽序列 L1-L2-L3-L4(VII I b)其中LI 选自 Peg3、Orn> Cys> Lys> Gln,或缺失；L2 选自 Ser、Ala、Orn> Cys、Lys> Gln,或缺失；L3 选自 Lys、Ala、Cys> Orn> Gin,或缺失；L4 选自 Lys、Orn> Ala、Peg3、Cys> Lys> Gin,或缺失；Ya为具有式VIIIc的肽序列 Y12-Y13-Y14-Y15-Asp-Phe (VIIIc)其中Y12选自Tyr、Ala，或缺失；Y13选自Gly、Ala，或缺失；Y14选自Trp和Phe ；以及 Y15 选自 Leu、Thr 和 Phe。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的肽缀合物，其中 Xa为具有式IXa的肽序列His-X8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Al a-X26-Glu-Phe-1le-Ala-Trp-Leu-Val-X34-Gly-X36(IXa)其中X8 选自 Ala、Aib 和 Gly ；X26 选自 Arg 和 Lys ；X34 选自 Arg 和 Lys ；X36 选自 Arg 和 Lys ；L为具有式IXb的肽序列 L1-L2-L3(IXb)其中LI 选自 Peg3、Gin、Cys、Lys 和 Orn,或缺失 L2 选自 Peg3、Gin、Cys、Lys 和 Orn,或缺失 L3 选自 Peg3、Gin、Cys、Lys 和 Orn,或缺失 L4 选自 Peg3、Gin、Cys、Lys 和 Orn,或缺失 Ya为具有式IXc的肽序列 Y12-Y13-Trp-Leu-Asp-Phe (IXc)其中Y12为Tyr，或缺失；以及 Y13为Gly，或缺失。
21.根据权利要求16至20中任一项所述的肽缀合物，其中Xa与天然毒蜥外泌肽_4有至少85%的同一性，例如至少90、95、97、98、99或99. 5%的同一性。
22.根据权利要求16至21中任一项所述的肽缀合物，其中至少一个Lys或Cys还与亲脂取代基缀合。
23.根据权利要求16至21中任一项所述的肽缀合物，其中所述式VI的肽具有以下序列或者其可药用盐或溶剂化物3)-[Glnl, Leul5]胃泌素 17，3)-K-[Glnl, Leu15]胃泌素 17，5)-AAA-[Glnl，Leu15]胃泌素 17，5)-SKK-[Glnl，Leu15]胃泌素 17，3)-Peg3-SKK-[Glnl, Leu15]胃泌素 17，3)-Peg3-Peg3-[Glnl, Leul5]胃泌素 17，3)-8Aoc-SKK-[Glnl, Leu15]胃泌素 17，5)-DBF-SKK-[Glnl，Leu15]胃泌素 17，3)-8Aoc-8Aoc-[Glnl, Leul5]胃泌素 17，3)-[Leu4]胃泌素 6,3)-K-[Leu4]胃泌素 6，3) -AAA- [Leu4]胃泌素 6,3)-SKK-[Leu4]胃泌素 6，3)-Peg3-SKK-[Leu4]胃泌素 6，3) -Peg3-Peg3- [Leu4]胃泌素 6,3)-8Aoc-SKK-[Leu4]胃泌素 6，3) -DBF-SKK- [Leu4]胃泌素 6 5)-8Aoc_8Aoc-[Leu4]胃泌素 6，[Aib8, Arg34]GLP-1 (7-37)-Peg3_Peg3-[Leu4]胃泌素 6 [Arg34] GLP-1 (7-37) -Peg3_Peg3- [Leu4]胃泌素 6。
24.根据权利要求16至22中任一项所述的肽缀合物，其中所述式VI的肽具有以下序列或者其可药用盐或溶剂化物[Lys (十六酰基-异 Glu) 34] GLP-1 (7-37) -Peg3_Peg3-[Leu4]胃泌素 6，GLP-17-36GLP-17-36GLP-17-36GLP-17-36GLP-17-36GLP-17-36GLP-17-36GLP-17-36GLP-17-36GLP-17-36GLP-17-36GLP-17-36GLP-17-36GLP-17-36GLP-17-36GLP-17-36GLP-17-36GLP-17-36[Arg34, Lys (十六酰基-异 Glu) 26] GLP-1 (7-37) -Peg3_Peg3-[Leu4]胃泌素 6[Arg26, 34，Lys (十六酰基-异 Glu) 36]GLP-1 (7-37) -Peg3_Peg3-[Leu4]胃泌素 6[Lys (十六酰基-异 Glu) 26] GLP-1 (7-37) -Peg3_Peg3- [Leu4]胃泌素 6[Arg26，34，Gly8，Lys(十六酰基-异 Glu)36]GLP-l (7-37)-Peg3_Peg3-[Leu4]胃泌素6[Aib8，Arg34, Lys (十六酰基-异 Glu) 26]GLP_1 (7-37)-Peg3_Peg3-[Leu4]胃泌素 6。
25.根据权利要求1至24所述的肽缀合物或者其可药用盐或溶剂化物，其用作药物。
26.根据权利要求25所述的肽缀合物或者其可药用盐或溶剂化物，其用作在有此需要的对象中治疗选自以下的疾病或异常的药物1型糖尿病、2型糖尿病、糖尿病前期、胰岛素抗性综合征、葡萄糖耐量降低(IGT)、与血液葡萄糖水平升高相关的疾病状况、高血糖症、 高血压、致动脉粥样化血脂异常、动脉硬化(例如动脉粥样硬化)、冠心病、外周动脉疾病、 中风、微血管病、胃病、代谢综合征、癌症(例如结肠癌)、炎性肠病(IBD)和肠易激综合征 (IBS)。
27.根据权利要求25所述的肽缀合物或者其可药用盐或溶剂化物，其用作在有此需要的对象中诱导胰岛新生的药物。
28.根据权利要求25所述的肽缀合物或者其可药用盐或溶剂化物，其用作在有此需要的对象中预防胰岛中细胞凋亡的药物。
29.根据权利要求25至28中任一项所述的肽缀合物或者其可药用盐或溶剂化物，其中所述对象为人。
30.在有此需要的对象中治疗选自以下的疾病或异常的方法1型糖尿病、2型糖尿病、 糖尿病前期、胰岛素抗性综合征、葡萄糖耐量降低(IGT)、与血液葡萄糖水平升高相关的疾病状况、高血糖症、高血压、致动脉粥样化血脂异常、动脉硬化(例如动脉粥样硬化)、冠心病、外周动脉疾病、中风、微血管病、胃病、代谢综合征、癌症(例如结肠癌)、炎性肠病(IBD) 和肠易激综合征(IBS)，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的权利要求1至29所述的肽缀合物或者其可药用盐或溶剂化物。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述对象为人。
32.药物组合物，其包含权利要求1至29所述的肽缀合物或者其可药用盐或溶剂化物， 以及可药用载体、赋形剂或载剂。
33.根据权利要求32所述的药物组合物，其用于预防体重增加或促进体重降低。
34.根据权利要求1至29中任一项所述的化合物，其用于改善循环葡萄糖水平、葡萄糖耐量和/或循环胆固醇水平，降低循环LDL水平，和/或提高HDL/LDL比率的方法中。
35.根据权利要求1至29中任一项所述的化合物，其用于治疗由体重超重引起或以其为特征的病症的方法中，例如治疗和/或预防肥胖症、病态肥胖、肥胖相关炎症、肥胖相关胆囊病、肥胖引起的睡眠呼吸暂停、代谢综合征、糖尿病前期，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的权利要求1至29中任一项所述的肽缀合物或者其可药用盐或溶剂化物。
36.根据权利要求1至29中任一项所述的化合物在有此需要的个体中预防体重增加或促进体重降低的用途。
37.根据权利要求1至29中任一项所述的化合物在对有此需要的个体改善循环葡萄糖水平、葡萄糖耐量和/或循环胆固醇水平，降低循环LDL水平和/或提高HDL/LDL比率的方法中的用途。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的化合物、用途或方法，其中所述化合物作为联合治疗的一部分与用于治疗糖尿病、肥胖症、血脂异常或高血压的药剂一起施用。
39.根据权利要求38所述的化合物、用途或方法，其中用于治疗糖尿病的所述药剂为二甲双胍、磺酰脲、格列奈类、DPP-1V抑制剂、格列酮类、胰岛素或胰岛素类似物。
40.根据权利要求38所述的化合物、用途或方法，其中用于治疗肥胖症的所述药剂为胰高血糖素样肽受体I激动剂、肽YY或其类似物、大麻素受体I拮抗剂、脂肪酶抑制剂、黑皮质素受体4激动剂或黑色素浓集激素受体I拮抗剂。
41.根据权利要求38所述的化合物、用途或方法，其中用于治疗高血压的所述药剂为血管紧张肽转化酶抑制剂、血管紧张肽II受体阻断剂、利尿剂、β -阻断剂或钙通道阻断剂。
42.根据权利要求38所述的化合物、用途或方法，其中用于治疗血脂异常的所述药剂为他汀类、贝特类、烟酸类和/或胆固醇吸收抑制剂。
43.以合成方式制造权利要求1至24中任一项所述的肽缀合物的方法。
44.以重组方式制造权利要求1至24中任一项所述的肽缀合物的方法。
45.根据权利要求1至24中任一项所述的化合物在对有此需要的个体改善循环葡萄糖水平、葡萄糖耐量和/或循环胆固醇水平，降低循环LDL水平和/或提高HDL/LDL比率之方法中的用途，其中使用药物假期剂量方案。
46.用于制造根据上述权利要求中任一项所述的化合物的方法。
47.药物组合物，其包含权利要求1至29所述的肽缀合物或者其可药用盐或溶剂化物与一种或更多种权利要求1至29所述的肽缀合物或者其可药用盐或溶剂化物以及可药用载体、赋形剂或载剂相组合。
48.包含至少一种根据权利要求1至29所述的肽缀合物或者其可药用盐或溶剂化物的装置，其用于将所述肽缀合物递送至对象。
49.包含至少一种根据权利要求1至29所述的肽缀合物或者其可药用盐或溶剂化物的药盒，其还包含包装或使用说明。
全文摘要
本发明尤其涉及某些肽缀合物和所述缀合物在治疗多种疾病或异常(包括糖尿病(1型和/或2型)和糖尿病相关疾病或异常)中的用途。
文档编号C07K14/595GK103003300SQ201180027138
公开日2013年3月27日 申请日期2011年4月27日 优先权日2010年4月27日
发明者特赖因·斯科夫隆德·吕厄·内鲁普, 托尔文·奥斯特尔隆德, 雅各布·林德·托尔博尔格, 克尔德·福斯格劳, 乌尔丽卡·莫滕松, 玛丽安娜·布罗尔松, 卡米拉·罗尔斯特德 申请人:西兰制药公司