Glp－1激动剂和胃泌素化合物的联合使用的制作方法

专利名称：Glp－1激动剂和胃泌素化合物的联合使用的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及包含GLP-1激动剂和胃泌素化合物的组合物、缀合物和方法及其应用。
背景技术：
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种来自下胃肠道的生理学肠降血糖素激素。GLP-1具有重要的生理学活性，包括刺激糖依赖性胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌和胃排空、抑制摄食、增强葡萄糖利用、保护β细胞、抑制β细胞凋亡以及诱导β细胞增殖[参见Nauck，M.A.ActaDiabetol，1998，35117-129；Holst J.J. Deabetes Metab Res Rev2002，18430-441；Reimer，R.A.等，Endocrinology 142(10)4522-4528；Drucker，D.J.，Molecular Endocrinology，2003，17(2)161-171和http://www.glucagon.com对GLP-1的评论]。上述的GLP-1活性使其成为用于治疗许多状况和疾病的非常理想的药物，所述状况和疾病包括糖尿病、肥胖、胃溃疡、高血压、慢性心力衰竭、液体潴留状态、代谢综合征以及相关的疾病和状况。
在此引证的任何参考文献均不被承认用作为本发明的现有技术。
发明概述在预防和/或治疗已证实GLP-1激动剂或胃泌素化合物具有疗效的状况和/或疾病中，所述状况和/或疾病包括但不限于糖尿病、高血压、慢性心力衰竭、液体潴留状态、肥胖、代谢综合征以及相关的疾病和状况，GLP-1激动剂和胃泌素化合物的组合提供了有益效果。
可选择GLP-1激动剂和胃泌素化合物的组合以提供意想不到的累加效应或强于累加效应，即协同效应。
包含GLP-1激动剂和胃泌素化合物的组合物、缀合物或方法利用了不同的机制以达到最佳的治疗效果，可改善对治疗的耐受，具有降低的因高剂量或长期单一疗法(即单独使用一种化合物治疗)引发副作用的风险。本发明的组合物、缀合物或方法容许使用低剂量的一种或两种化合物，减少了每种化合物的不利毒性作用。最适量以下的剂量可提供增加的安全界限，也可降低达到预防和治疗目的所需药物的成本。在本发明某些方面中，单一组合剂量单位增加的便利性使得灵活性增加。组合物、缀合物或联合疗法的其他优点可包括对降解和代谢更高的稳定性，更长的持续作用时间，和/或特别在低剂量下更长的持续作用时间或效果。
概括地说，本发明涉及用于预防和/或治疗状况和/或疾病的组合物、缀合物和方法，包含了提供有益效果的治疗有效量的GLP-1激动剂和胃泌素化合物。
本发明的组合物、缀合物或方法在治疗或治疗终止后可提供持久的有益效果。与单独使用GLP-1或胃泌素相比，持久的功效可通过增加的C-肽产量、胰腺胰岛素产量增加、和/或接近正常的血糖水平而得到证实。
在一方面中，本发明涉及一种组合物，优选药物组合物，包含相对于单独使用每种化合物而提供有益效果的GLP-1激动剂和胃泌素化合物。在本发明另一方面中，提供了一种包含GLP-1激动剂和胃泌素化合物的药物组合物，所述药物组合物提供了有益效果，优选在治疗后提供持久的有益效果。该药物组合物可任选地包含药学上可接受的载体、赋形剂或媒介物。
本发明也涉及在独立容器中的药物组合物，旨在用于同时给药或顺次给药以提供有益效果，优选提供持久的有益效果，包含GLP-1激动剂和胃泌素化合物两者，任选地和药学上可接受的载体、赋形剂或媒介物。
本发明进一步涉及一种缀合物，包含与胃泌素化合物相互作用或连接以提供有益效果，优选提供在此讨论的持久的有益效果的GLP-1激动剂。
本发明更进一步涉及制备本发明组合物和缀合物的方法，所述方法产生的组合物和缀合物具有有益效果，优选具有持久的有益效果。
在本发明一方面中，提供了一种制备稳定的GLP-1激动剂和胃泌素化合物药物组合物的方法，所述药物组合物适于提供有益效果，优选在治疗后提供持久的有益效果，该方法包括制备包含GLP-1激动剂、胃泌素化合物和在物理上有效稳定GLP-1激动剂的药学上可接受的载体、赋形剂或媒介物的组合物。
在本发明另一方面中，提供了一种制备稳定的GLP-1激动剂药物组合物的方法，包括混合GLP-1激动剂、胃泌素化合物和在物理上有效稳定GLP-1激动剂的药学上可接受的载体、赋形剂或媒介物，并适于提供有益效果，优选提供持久的有益效果。
本发明涉及用于预防和/或治疗在此讨论的受试者的状况和/或疾病的联合治疗，包括给予受试者治疗有效量的至少一种GLP-1激动剂和胃泌素化合物以提供有益效果。在一方面，本发明提供了在治疗后能提供持久有益效果的联合治疗或干预。
本发明进一步涉及本发明的GLP-1激动剂和胃泌素化合物、组合物或缀合物在预防和/或改善疾病严重程度、疾状况状和/或在此描述的状况和/或疾病周期性复发中的应用。本发明更进一步涉及使用本发明的GLP-1激动剂、胃泌素和胃泌素化合物，组合物或缀合物预防和/或治疗受试者疾病和/或状况。
在一方面中，本发明提供了一种用于预防和/或干预在此讨论的受试者状况和/或疾病的方法，包括给予本发明的至少一种GLP-1激动剂和至少一种胃泌素化合物、组合物或缀合物。GLP-1激动剂和胃泌素化合物、组合物或缀合物可以直接给予受试者或与细胞(如干细胞或祖细胞)接触并将细胞给予受试者。
在其他方面中，本发明提供了一种用于预防和/或干预在此讨论的受试者状况和/或疾病的方法，包括给予需要的受试者至少一种GLP-1激动剂和至少一种胃泌素化合物以提供有益效果。
在另一方面中，本发明提供了一种用于预防和/或干预在此讨论的受试者状况和/或疾病的方法，包括联合给予需要的受试者至少一种GLP-1激动剂和至少一种胃泌素化合物。
在一个特定方面中，本发明涉及诱导受试者胰岛新生，包括用足够量的本发明的GLP-1激动剂和胃泌素化合物、组合物或缀合物接触胰岛前体细胞，以增加受试者胰岛前体细胞的增殖，由此诱导胰岛新生。
在另一方面中，本发明涉及一种通过给予胃泌素化合物和GLP-1激动剂或组合物治疗有需要的患者糖尿病的方法，包括以足够量的胃泌素化合物和GLP-1激动剂作用于患者胰岛前体细胞，使之分化为成熟的胰岛素分泌细胞和/或刺激现有胰岛细胞的胰岛素合成。
本发明提供了用于处理细胞的方法，使用了本发明的GLP-1激动剂和胃泌素化合物、组合物或缀合物。特别是，本发明涉及一种用于扩增并分化干细胞或祖细胞为胰岛素分泌细胞、增强胰岛素分泌细胞增殖和/或维持胰岛细胞或前体细胞的方法。在培养或在受试者中，可用GLP-1激动剂和胃泌素化合物接触细胞。
在一方面中，提供了一种用于治疗状况和/或疾病的方法，包括给予有需要的受试者本发明的GLP-1激动剂和胃泌素化合物、组合物或缀合物及大量的细胞，由此产生有益效果，优选持久的有益效果。在一个实施方案中，所述化合物/组合物/缀合物全身用药。
在另一方面中，本发明提供了一种用于治疗患有在此讨论的状况和/或疾病的受试者的方法，包括用本发明的GLP-1激动剂和胃泌素化合物、组合物或缀合物离体接触大量的细胞，任选培养细胞，并将细胞给予需要的受试者。
在本发明的特定方面中，也提供了通过将在培养中已暴露于足够量的本发明的胃泌素化合物和GLP-1激动剂、组合物或缀合物的胰腺胰岛细胞植入糖尿病患者中，以增加胰岛中胰β细胞的数量，从而治疗需要的糖尿病患者的方法和组合物；任选地在移植前，胰β-细胞群可培养生长足够长的时间以扩增β-细胞群。
本发明也提供了包括至少一种GLP-1激动剂和至少一种胃泌素化合物的组合的组合物用于制备一种或多种预防和/或治疗状况和/或疾病的药物的应用。本发明进一步提供了GLP-1激动剂与胃泌素化合物共同用于制造治疗状况和/或疾病的药物的应用。本发明更进一步提供了GLP-1激动剂用于制造治疗状况和/或疾病的药物的应用，所述药物要与胃泌素化合物联合使用。
在一方面中，本发明涉及协同有效量的至少一种GLP-1激动剂和至少一种胃泌素化合物用于制备预防或治疗状况和/或疾病的药物的应用。在另一方面中，本发明涉及GLP-1激动剂和胃泌素化合物用于制备相对于GLP-1(7-37)或exendin具有延长作用曲线的药物的应用。另外，本发明提供了本发明的药物组合物和缀合物在制备预防和/或治疗状况和/或疾病的药物中的应用。所述药物在治疗后提供了有益效果，优选持久的有益效果。
鉴于本发明涉及一种预防和/或治疗的方法，包括组合可单独或作为缀合物给予的活性剂，因此本发明也提供了一种试剂盒，在试剂盒中包括本发明的GLP-1激动剂和胃泌素化合物以及药物组合物或缀合物。根据以下详细描述，本发明的这些和其他方面、特点以及优点对于本领域技术人员应当是显而易见的。
附图简述根据附图本发明将得到更好的理解，其中

图1是显示在急性糖尿病NOD小鼠中使用GLP-1激动剂和胃泌素化合物(INT-2)的胰岛新生疗法对空腹血糖效果的图。该图说明了GLP-1(300μg/kg)和胃泌素(3μg/kg)的联合治疗逆转了高血糖并阻止了NOD小鼠死亡。
图2是显示用GLP-1(300μg/kg)和胃泌素(3μg/kg)联合治疗的急性糖尿病NOD小鼠个体空腹血糖水平的图。
图3是显示GLP-1和胃泌素联合治疗恢复NOD小鼠模型胰腺胰岛素水平的图。
图4是显示胰腺胰岛素含量和空腹血糖水平之间相关性的图。
图5显示了用媒介物、GLP-1和胃泌素治疗的急性糖尿病NOD小鼠中胰岛素染色的细胞。
图6显示了用媒介物、GLP-1和胃泌素治疗的NOD小鼠胰管的胰岛细胞的染色。
术语表在此书面陈述的数值范围的端点包括包含于该范围内的所有数和小数(如，1-5包括1、1.5、2、2.75、3，、3.90、4和5)。也可理解的是所有的数及其小数可假定为术语“约”所修饰。此外，可以理解“一个”、“一种”和“该”包括所指受试者的复数，除非上下文另有明确规定。因此，例如所提到的含有“化合物(a compound)”的组合物包括两种或更多种化合物的混合物。术语“约”指所提到的数的正负0.1-50％、5-50％或10-40％，优选10-20％，更优选10％或15％。
在此描述的所选择的化合物含有一个或多个不对称中心并可产生对映体、非对映体和其他立体异构型，根据绝对立体化学可定义为(R)-或(S)-。因此，本发明包括所有上述可能的非对映体和对映体以及它们的外消旋和旋光纯形式。可使用手性合成子或手性试剂制备或使用常规方法拆分旋光性的(R)-和(S)-同分异构体。当在此描述的化合物含有几何非对称中心时，除非另有规定，意指所述化合物包括E和A几何异构体。所有的互变异构型也意在包括于本发明的范围内。
术语“受试者”、“个体”或“患者”指包括诸如哺乳动物的温血动物的动物，其患有或怀疑已患有或易患有在此描述的状况和/或疾病。该术语优选指人。该术语也包括饲养作为食物、供体育运动使用或作为宠物的家畜，包括马、牛、羊、家禽、鱼、猪、猫、狗和动物园动物。在此用于受试者/个体/患者的方法涉及预防及治疗应用。通常用于治疗的受试者包括易患、正患有或已患有在此讨论的状况和/或疾病的人。
术语“药学上可接受的载体、赋形剂或媒介物”指并不干扰活性成分的效果或活性且对于所给予的宿主是无毒的介质。载体、赋形剂或媒介物包括稀释剂、粘合剂、胶粘剂、润滑剂、崩解剂、填充剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂以及其他物质，例如为了制备特定组分可能需要的吸附剂。应用上述介质和试剂于活性化合物中为本领域众所周知。在本发明某些方面中，选择稳定GLP-1激动剂的载体、赋形剂或媒介物。
“药学上可接受的盐”包括存在的适于本发明应用的化合物的酸式盐或碱式盐。药学上可接受的盐的例子包括羧基的钠、钙和钾盐以及氨基的盐酸盐。其他药学上可接受的氨基盐是氢溴酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、醋酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、乳酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐和对-甲苯磺酸盐(甲苯磺酸盐)。
术语“预防和/或治疗”、或“预防和/或干预”指在状况和/或疾病发病前或后给予受试者生物学活性剂。治疗可以短期或长期方式进行。特别是，预防包括了在状况和/或疾病临床发病之前，控制和护理在有发展在此讨论的状况和/或疾病的危险的受试者。治疗或干预指在诊断时或此后控制或护理受试者。预防、治疗或干预的目的在于抗击状况和/或疾病，包括给予活性化合物以阻止或延迟症状或并发症发作，或缓解症状或并发症，或消除或部分消除状况和/或疾病。
“有益效果”指GLP-1激动剂和胃泌素化合物联合、或其组合物或缀合物的效果，大于任何一个化合物单独使用的效果。有益效果包括良好的药理学和/或治疗效果，以及改善的药物代谢动力学特性和生物活性。有益效果可以是加和效应或协同效应。在本发明优选的实施方案中，有益效果包括但不限于如下缓解或消除胰岛炎症、减缓疾病进展、增加存活率或消除或部分消除状况和/或疾病。在一个特别优选的实施方案中，所述有益效果是“持久的有益效果”，在此在治疗终止后该有益效果持续了一段长时间。在一个实施方案中，在治疗终止后一种或多种上述效果持续了一段长时间。在治疗后有益效果可持续至少约2、4、6、8、10、2-4周、2-6周、2-8周、2-12周、2-24周、2周-12个月和2周-18个月。有益效果所持续的时间与治疗持续时间相关。受试者可连续治疗约2-8周、2-12周、2-16周、2周-6个月、2-12个月，或定期治疗。持久的有益效果可表现为在治疗后一段长时间内的一种或多种效果增加的C-肽产生、增加的胰腺胰岛素产生、和/或接近正常的或低的血糖水平。
根据两种化合物效果对每种化合物效果的统计分析，有益效果可以是统计显著的效果。与单独每种化合物相比，两种化合物的“统计学显著”或“显著不同的”效果或水平可表示为高于或低于标准的水平。在本发明的实施方案中，与单独每种化合物所获得的效果相比，该差异可以是高或低1.5、2、3、4、5或6倍。
GLP-1激动剂和胃泌素化合物“加和效应”指等于两种化合物单独效果之和的效果。
GLP-1激动剂和胃泌素化合物的“协同效应”指大于两种化合物单独效果之和的加和效应的效果。
“联合治疗”、“联合疗法”和“联合给药”在此可互换地使用，指同时给予被治疗的患者活性成分。当联合给药时，每种组分可同时给予，或在不同时间点按任何顺序顺次给予。因此，每种组分可以分别给予，但在时间上应足够接近以提供所需效果，特别是有益的、加和的或协同的效果。第一化合物可按一种方案给予，其额外包含了用第二化合物处理。在某些实施方案中，该术语指在一年内给予患者GLP-1激动剂和胃泌素化合物，包括分别给予两种药物，每种含有一种化合物，以及同时给予，无论这两种化合物是组合在一个制剂内还是分别是两种制剂。
“药物”指适于给予患者药学活性化合物(如GLP-1激动剂和/或胃泌素化合物)的药物组合物。
“治疗有效量”涉及可产生一种或多种所需有益效果，优选一种或多种持久的有益效果的本发明的活性化合物(如GLP-1激动剂和胃泌素化合物)、组合物或缀合物的量或剂量。与不进行治疗相比，“治疗有效量”可提供足以有效预防和/或治疗受试者的剂量。
“协同有效量”涉及可提供协同效应，特别是协同的有益效果的本发明的活性化合物(如GLP-1激动剂和胃泌素化合物)、组合物或缀合物的量或剂量。
“最适量以下的剂量”或“最适度以下的用量”指小于在单一疗法中使用化合物时的最适剂量或用量的活性化合物剂量或用量。
术语“缔合的”、“连接的”、或“相互作用”指分子之间任何的物理缔合。该术语优选指两个分子之间稳定的缔合，归因于，例如静电的、疏水的、离子的、氢键相互作用或共价相互作用。某些相互作用或缔合的分子仅在它们之一或多个被激活后相互作用。
在上下文中，“GLP-1激动剂”理解为指任何完全或部分激活人GLP-1受体的化合物，包括肽和非肽化合物。在一个优选的实施方案中，“GLP-1激动剂”是任何结合GLP-1受体的肽或非肽小分子，优选具有通过本领域公知方法(参见，如WO 98/08871)测量低于1μM，如低于100nM的亲和常数(KD)或效能(EC50)并表现促胰岛素活性的，在此促胰岛素活性可用本领域技术人员公知的体内或体外方法测定。例如，可将GLP-1激动剂给予动物并随时间测量胰岛素浓度。
在一个实施方案中，GLP-1激动剂选自GLP-1(7-36)-酰胺、GLP-1(7-37)、GLP-1(7-36)-酰胺类似物、GLP-1(7-37)类似物或这些任一的衍生物。
在本申请中，命名“类似物”用于表示这样一种肽，其中一个或多个亲本肽的氨基酸残基已为其他氨基酸残基所取代和/或其中亲本肽的一个或多个氨基酸残基已缺失和/或其中一个或多个氨基酸残基已添加到亲本肽上。上述添加可出现在亲本肽的N-末端或C-末端或两者。通常“类似物”是这样一种肽，其中6个或更少的氨基酸已被取代和/或添加和/或缺失自亲本肽，更优选是这样的一种肽，其中3个或更少的氨基酸已被取代和/或添加和/或缺失自亲本肽，以及最优选是这样的一种肽，其中1个氨基酸已被取代和/或添加和/或缺失自亲本肽。
在本申请中，“衍生物”用于表示这样一种肽或其类似物，其通过在所述肽或其类似物的一个或多个氨基酸残基上导入如酯、烷基或亲脂性官能团而进行化学修饰。
用于鉴定GLP-1激动剂的方法描述于WO 93/19175(Novo NordiskA/S)，根据本发明可使用的合适的GLP-1类似物和衍生物的例子包括WO 99/43705(Novo Nordisk A/S)、WO 99/43706(Novo Nordisk A/S)、WO 99/43707(Novo Nordisk A/S)、WO 98/08871(Novo Nordisk A/S)、WO 99/43708(Novo Nordisk A/S)、WO 99/43341(Novo Nordisk A/S)、WO 87/06941(The General Hospital Corporation)、WO 90/11296(TheGeneral Hospital Corporation)、WO 91/11457(Buckley等)、WO98/43658(Eli Lilly & Co.)、EP 0708179-A2(Eli Lilly & Co.)、EP0699686-A2(Eli Lilly & Co.)、WO 01/98331(Eli Lilly & Co)中所提到的那些。
在一个实施方案中，所述GLP-1激动剂是GLP-1(7-36)-酰胺、GLP-1(7-37)、GLP-1(7-36)-酰胺类似物或GLP-1(7-37)类似物的衍生物，其包含亲脂取代基。
在本发明这个实施方案中，GLP-1衍生物优选带有连接在亲本肽(即GLP-1(7-36)-酰胺、GLP-1(7-37)、GLP-1(7-36)-酰胺类似物或GLP-1(7-37)类似物)上的3个亲脂取代基，更优选2个亲脂取代基，最优选1个亲脂取代基，在此每个亲脂取代基优选具有4-40个碳原子，更优选8-30个碳原子，还优选8-25个碳原子，还优选12-25个碳原子，以及最优选14-18个碳原子。
在一个实施方案中，亲脂取代基包括部分或完全氢化的环戊菲(cyclopentanophenathrene)骨架。
在另一个实施方案中，亲脂取代基是直链或支链烷基。
在又一个实施方案中，亲脂取代基是直链或分支脂肪酸的酰基。所述亲脂取代基优选是具有结构式CH3(CH2)nCO-的酰基，其中n是4-38的整数，优选是12-38的整数，更优选是CH3(CH2)12CO-、CH3(CH2)14CO-、CH3(CH2)16CO-、CH3(CH2)18CO-、CH3(CH2)20CO-和CH3(CH2)22CO-。在更优选的实施方案中，亲脂取代基是十四烷酰基。在最优选的实施方案中，亲脂取代基是十六烷酰基。
在本发明进一步的实施方案中，所述亲脂取代基具有带负电荷的基团，例如羧基。例如，亲脂取代基可以是直链或支链烷的酰基、结构式HOOC(CH2)mCO-的α，ω-二羧酸，其中m是4-38的整数，优选12-38的整数，以及最优选是HOOC(CH2)14CO-、HOOC(CH2)16CO-、HOOC(CH2)18CO-、HOOC(CH2)20CO-或HOOC(CH2)22CO-。
在本发明的GLP-1衍生物中，亲脂取代基包含能连接在亲本GLP-1肽的氨基酸的如下官能团之一上的官能团(a)连在N-末端氨基酸的α-碳的氨基，(b)连在C-末端氨基酸的α-碳的羧基，(c)任一Lys残基的ε-氨基，(d)任一Asp和Glu残基的R基的羧基，(e)任一Tyr、Ser和Thr残基的R基的羟基，(f)任一Trp、Asn、Gln、Arg和His残基的R基的氨基，或(g)任一Cys残基的R基的硫醇基。
在一个实施方案中，亲脂取代基连接在任一Asp和Glu残基的R基的羧基上。
在另一个实施方案中，亲脂取代基连接在羧基上，该羧基连接在C-末端氨基酸的α-碳上。
在最优选的实施方案中，亲脂取代基连接在任一Lys残基的ε-氨基上。
在本发明的一个优选实施方案中，亲脂取代基通过间隔基连接在亲本GLP-1肽上。间隔基必须包含至少两个官能团，一个连接在亲脂取代基的官能团上，另一个连接在亲本GLP-1肽的官能团上。
在一个实施方案中，间隔基是除Cys或Met之外的氨基酸残基，或诸如Gly-Lys的二肽。对本发明来说，短语“诸如Gly-Lys的二肽”指除Cys或Met之外的两种氨基酸的任意组合，优选二肽中C-末端氨基酸残基是Lys、His或Trp，优选Lys，以及N-末端氨基酸残基是Ala、Arg、Asp、Asn、Gly、Glu、Gln、Ile、Leu、Val、Phe、Pro、Ser、Tyr、Thr、Lys、His和Trp。优选地，亲本肽的氨基与氨基酸残基或二肽间隔基的羧基形成酰胺键，以及氨基酸残基或二肽间隔基的氨基与亲脂取代基的羧基形成酰胺键。
优选的间隔基是赖氨酰基、谷氨酰基、天冬酰胺酰基、甘氨酰基、β-丙氨酰基和γ-氨基丁酰基，其中每一个构成一个单独的实施方案。最优选间隔基是谷氨酰基和β-丙氨酰基。当间隔基是Lys、Glu或Asp时，其羧基可与氨基酸残基的氨基形成酰胺键，且其氨基可与亲脂取代基的羧基形成酰胺键。当Lys用作为间隔基时，在某些情况下额外的间隔基可插入到Lys的ε-氨基和亲脂取代基之间。在一个实施方案中，上述额外的间隔基是琥珀酸，其与Lys的ε-氨基及亲脂取代基中存在的氨基形成酰胺键。在另一个实施方案中，上述另外的间隔基是Glu或Asp，其与Lys的ε-氨基形成酰胺键并与亲脂取代基中存在的羧基形成另一个酰胺键，更确切地说，所述亲脂取代基是Nε-酰化的赖氨酸残基。
在另一个实施方案中，间隔基是无支链的烷、具有1-7个亚甲基的α，ω-二羧酸基，间隔基在亲本肽的氨基和亲脂取代基的氨基之间形成桥接。优选地，间隔基是琥珀酸。
在另一个实施方案中，连接有间隔基的亲脂取代基是结构式CH3(CH2)pNH-CO(CH2)qCO-的基团，其中p是8-33的整数，优选12-28，以及q是1-6的整数，优选2。
在另一个实施方案中，连接有间隔基的亲脂取代基是结构式CH3(CH2)rCO-NHCH(COOH)(CH2)2CO-的基团，其中r是4-24的整数，优选10-24。
在另一个实施方案中，连接有间隔基的亲脂取代基是结构式CH3(CH2)sCO-NHCH((CH2)2COOH)CO-的基团，其中s是4-24的整数，优选10-24。
在另一个实施方案中，亲脂取代基是结构式COOH(CH2)tCO-的基团，其中t是6-24的整数。
在另一个实施方案中，连接有间隔基的亲脂取代基是结构式-NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)uCH3的基团，其中u是8-18的整数。
在另一个实施方案中，连接有间隔基的亲脂取代基是结构式CH3(CH2)vCO-NH-(CH2)z-CO的基团，其中v是4-24的整数，以及z是1-6的整数。
在另一个实施方案中，连接有间隔基的亲脂取代基是结构式-NHCH(COOH)(CH2)4NH-COCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)wCH3的基团，其中w是10-16的整数。
在另一个实施方案中，连接有间隔基的亲脂取代基是结构式-NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(COOH)NHCO(CH2)xCH3的基团，其中x是0或1-22的整数，优选10-16。
在又一个实施方案中，GLP-1激动剂是Arg34，Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-十六烷酰基)))-GLP-1(7-37)。
在又一个实施方案中，GLP-1激动剂选自Gly8-GLP-1(7-36)-酰胺，Gly8-GLP-1(7-37)、Val8-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8-GLP-1(7-37)、Val8Asp22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Asp22-GLP-1(7-37)、Val8Glu22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Lys22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Lys22-GLP-1(7-37)、Val8Arg22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Arg22-GLP-1(7-37)、Val8His22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8His22-GLP-1(7-37)，其类似物和任一这些的衍生物。
在又一个实施方案中，GLP-1激动剂选自Arg26-GLP-1(7-37)、Arg34-GLP-1(7-37)、Lys36-GLP-1(7-37)、Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)、Arg26，34-GLP-1(7-37)、Arg26，34Lys40-GLP-1(7-37)、Arg26Lys36-GLP-1(7-37)、Arg34Lys36-GLP-1(7-37)、Val8Arg22-GLP-1(7-37)、Met8Arg22-GLP-1(7-37)、Gly8His22-GLP-1(7-37)、Val8His22-GLP-1(7-37)、Met8His22-GLP-1(7-37)、His37-GLP-1(7-37)、Gly8-GLP-1(7-37)、Val8-GLP-1(7-37)、Met8-GLP-1(7-37)、Gly8Asp22-GLP-1(7-37)、Val8Asp22-GLP-1(7-37)、Met8Asp22-GLP-1(7-37)、Gly8Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Glu22-GLP-1(7-37)、Met8Glu22-GLP-1(7-37)、Gly8Lys22-GLP-1(7-37)、Val8Lys22-GLP-1(7-37)、Met8Lys22-GLP-1(7-37)、Gly8Arg22-GLP-1(7-37)、Val8Lys22His37-GLP-1(7-37)、Gly8Glu22His37-GLP-1(7-37)、Val8Glu22His37-GLP-1(7-37)、Met8Glu22His37-GLP-1(7-37)、Gly8Lys22His37-GLP-1(7-37)、Met8Lys22His37-GLP-1(7-37)、Gly8Arg22His37-GLP-1(7-37)、Val8Arg22His37-GLP-1(7-37)、Met8Arg22His37-GLP-1(7-37)、Gly8His22His37-GLP-1(7-37)、Val8His22His37-GLP-1(7-37)、Met8His22His37-GLP-1(7-37)、Gly8HiS37-GLP-1(7-37)、Val8His37-GLP-1(7-37)、Met8His37-GLP-1(7-37)、Gly8Asp22His37-GLP-1(7-37)、Val8Asp22His37-GLP-1(7-37)、Met8Asp22His37-GLP-1(7-37)、Arg26-GLP-1(7-36)-酰胺、Arg34-GLP-1(7-36)-酰胺、Lys36-GLP-1(7-36)-酰胺、Arg26，34Lys36-GLP-1(7-36)-酰胺、Arg26，34-GLP-1(7-36)-酰胺、Arg26，34Lys40-GLP-1(7-36)-酰胺、Arg26Lys36-GLP-1(7-36)-酰胺、Arg34Lys36-GLP-1(7-36)-酰胺、Gly8-GLP-1(7-36)酰胺、Val8-GLP-1(7-36)-酰胺、Met8-GLP-1(7-36)-酰胺、Gly8Asp22-GLP-1(7-36)-酰胺、Gly8Glu22His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Asp22-GLP-1(7-36)-酰胺、Met8Asp22-GLP-1(7-36)-酰胺、Gly8Glu22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Glu22-GLP-1(7-36)-酰胺、Met8Glu22-GLP-1(7-36)-酰胺、Gly8Lys22-GlP-1(7-36)-酰胺、Val8Lys22-GLP-1(7-36)-酰胺、Met8Lys22-GLP-1(7-36)-酰胺、Gly8His22His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Gly8Arg22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Arg22-GLP-1(7-36)-酰胺、Met8Arg22-GLP-1(7-36)-酰胺、Gly8His22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8His22-GLP-1(7-36)-酰胺、Met8His22-GLP-1(7-36)-酰胺、His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Arg22His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Met8Arg22His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Gly8His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Met8His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Gly8Asp22His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Va18Asp22His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Met8Asp22His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Glu22His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Met8Glu22His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Gly8Lys22His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Lys22His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Met8Lys22His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Gly8Arg22His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8His22His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Met8His22His37-GLP-1(7-36)-酰胺及其衍生物。
在又一个实施方案中，GLP-1激动剂选自Val8Trp19Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Glu22Val25-GLP-1(7-37)、Val8Tyr16Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Trp16Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Leu16Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Tyr18Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Glu22His37-GLP-1(7-37)、Val8Glu22Ile33-GLP-1(7-37)、Val8Trp16Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37)、Val8Trp16Glu22Ile33-GLP-1(7-37)、Val8Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37)、Val8Trp16Glu22Val25-GLP-1(7-37)，其类似物和任一这些的衍生物。
在又一个实施方案中，GLP-1激动剂是稳定的GLP-1类似物/衍生物。在本申请全文中，“稳定的GLP-1类似物/衍生物”指在人体内具有至少10小时的通过下述方法测定的体内血浆清除半衰期的GLP-1类似物或GLP-1类似物的衍生物。稳定的GLP-1类似物/衍生物的例子可见于WO 98/08871和WO 99/43706。用于测定人体内化合物血浆清除半衰期的方法是将化合物溶解于等渗缓冲液，pH7.4，PBS或任何其他合适的缓冲液中。外周注射药剂，优选在腹部或大腿上部。在短时间间隔内频繁采集用于活性化合物测定的血样，并延长足够时间以覆盖终末消除部分(如，给药前，给药后1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、24(第2天)、36(第2天)、48(第3天)、60(第3天)、72(第4天)和84(第4天)小时)。如Wilken等，Diabetologia43(51)A143，2000所述进行活性化合物浓度的测定。根据每一单独受试者的浓度-时间数据，通过使用无区室法，利用市场上可买到的软件WinNonlin Version 2.1(Pharsight，Cary，NC，USA)计算导出的药物动力学参数。通过对浓度-时间曲线的终末log-线性区进行log-线性回归估计终末消除速率常数，并用于计算清除半衰期。
稳定的GLP-1类似物和衍生物披露于WO 98/08871(带有亲脂取代基的类似物)和WO 02/46227(融合至血清白蛋白或Ig的Fc部分的类似物)中。
在另一个实施方案中，配制GLP-1激动剂，使得其在人中具有上述所讨论的至少10小时的半衰期。可通过本领域公知的缓释制剂而获得。
在又一个实施方案中，GLP-1激动剂是exendin-4或exendin-3、exendin-4或exendin-3类似物或任一这些的衍生物。
包括于本发明中的exendins、类似物、衍生物及其片段的例子是披露于WO 97/46584，US 5,424,286和WO 01/04156中的那些。US5,424,286描述了一种使用exendin多肽刺激胰岛素释放的方法。所披露的exendin多肽包括HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGX[SEQ ID NO.20]；其中X＝P或Y，以及HX1X2GTFITSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS[SEQ ID NO.21]；其中X1X2＝SD(exendin-3)或GE(exendin-4))。WO 97/46584描述了exendin肽的截短形式。所披露的肽增加了胰岛素的分泌和生物合成，但减少了胰高血糖素的分泌和生物合成。WO 01/04156描述了exendin-4类似物和衍生物以及这些分子的制备。WO 02/46227披露了exendin-4类似物通过融合到血清白蛋白或Ig的Fc部分上得到稳定。
在一个实施方案中，exendin-4类似物是HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK[SEQ ID NO.22]。
在又一个实施方案中，GLP-1激动剂是稳定的exendin-4类似物/衍生物。在此使用的术语“稳定的exendin-4类似物/衍生物”指exendin-4(1-39)类似物或exendin-4(1-39)类似物的衍生物，其在人体内具有至少10小时的血浆清除半衰期，通过上述用于“稳定的GLP-1类似物/衍生物”的方法得到测定。
还在另一个实施方案中，GLP-1激动剂是Aib8，35GLP-1(7-36)酰胺(Aib＝α-氨基异丁酸)。
还在另一个实施方案中，GLP-1激动剂是Ser38，Lys39，40，41，42，43，44-Exendin-4(1-39)酰胺。
还在另一个实施方案中，GLP-1激动剂选自披露于WO 00/42026中的非肽小分子GLP-1激动剂。
GLP-1激动剂的氨基酸部分能通过多种本领域公知方法制备，例如固相合成、从天然来源中纯化GLP-1激动剂、重组技术或这些方法的组合。参见例如，US 5,188,666、5,120,712、5,523,549、5,512,549、5,977,071、6,191,102、Dugas和Penney 1981，Merrifield，1962，Stewart和Young 1969，以及其中引用的文献。GLP-1激动剂衍生物可通过对适当的主链进行适当的衍生作用而产生，所述适当的主链产生自例如重组DNA技术或使用肽合成和肽化学领域公知的方法进行的肽合成(如Merrifield-型固相合成)。
“胃泌素化合物”理解为指任何完全或部分与胃泌素/CCKB受体缔合和/或激活其的化合物，包括肽和非肽化合物。在本发明的方面中，选择对胃泌素/CCKB受体具有稳定的IC50，例如约0.7nM IC50的胃泌素化合物，根据本领域公知方法进行所述IC50的测定(参见，Singh等(1995)J.Biol.Chem.2708429-8438，和Kopin等(1995)J.Biol.Chem.2705019-5023描述了体外细胞生长测定，以及受体结合测定如Singh等(1995)J.Biol.Chem.2708429-8438，和Kopinetal(1995)J.Biol.Chem.2705019-5023中所描述的)。也可基于其他标准进行胃泌素化合物的选择，例如在此讨论的活性、半衰期等。
“胃泌素化合物”包括不限于各种类型的胃泌素，例如胃泌素71、胃泌素52、胃泌素34(大胃泌素)、胃泌素17(小胃泌素)、胃泌素14和胃泌素8(微胃泌素)、五肽胃泌素，、四肽胃泌素及其片段、类似物和衍生物。包括大胃泌素-34(Bonato等，1986，Life Science 39959)和小胃泌素-17(Bentley等(1966)Nature 2095 83)的胃泌素序列为本领域公知，一些序列如SEQ ID NOs.11-18所示。特别是，包括SEQID NO.15的胃泌素71、SEQ ID NO.16的胃泌素52、SEQ ID NO.11或12的胃泌素34(大胃泌素)、SEQ ID NO.13或14的胃泌素17(小胃泌素)、SEQ ID NO.17的胃泌素14和SEQ ID NO.18或19胃泌素6的胃泌素序列。胃泌素-34基本上是在胃泌素-17的N-末端氨基酸序列的延伸。大胃泌素在体内剪切释放胃泌素-17。胃泌素N-末端的Glp是焦谷氨酸，其是一种天然环化形式的谷氨酸。在多个实施方案中，Cys或Lys被添加到带有焦谷氨酸的胃泌素末端上，该焦谷氨酸为谷氨酸所取代，或该焦谷氨酸缺失。可用于本发明的胃泌素34或胃泌素-17在15位是Met或Leu，如在此的SEQ ID NOs6-9所示。
可用于本发明的胃泌素化合物的例子包括披露于US 6,288,301的化合物。在本发明的某些应用中，可选择的胃泌素化合物为肽或非肽激动剂或胃泌素受体的部分激动剂，例如A71378(Lin等.，Am.J.Physiol.258(4 Pt 1)G648，1990)。在本发明的某些应用中，可选择的胃泌素化合物为胃泌素/CCKB受体配体，包括但不限于缩胆囊素(CCK)，例如CCK 58、CCK 33、CCK 22、CCK 12和CCK 8等。
在某些方面中，胃泌素化合物可以是其活性类似物、片段或其他修饰物，例如，与内源性哺乳动物胃泌素共有氨基酸序列，例如，共有60％序列同一性，或70％同一性，或80％同一性。这样的化合物也包括增加内源性胃泌素分泌的物质、缩胆囊素或来自组织贮藏部位的具有类似活性的肽。这些化合物的例子是胃泌素释放肽、抑制胃酸分泌的奥美拉唑、以及增加CCK刺激的大豆胰蛋白酶抑制剂。
“胃泌素化合物”包括胃泌素的修饰形式，包括但不限于胃泌素71[SEQ ID NO.15]、胃泌素52[SEQ ID NO.16]、胃泌素34(大胃泌素)[SEQ ID NO.11或12]、胃泌素17(小胃泌素)[SEQ ID NO.13或14]、胃泌素14[SEQ ID NO.17]、胃泌素8、胃泌素6[SEQ ID NO.18]、五肽胃泌素和四肽胃泌素的修饰形式。修饰的胃泌素优选包括TrpMetAspPhe-NH2[SEQ ID NO.26]或TrpLeuAspPhe-NH2[SEQ IDNO.27]。
在本发明方面中，修饰的胃泌素至少包括SEQ ID NO.11或12的氨基酸1-34、18-34或29-34，或SEQ ID NO.13或14的氨基酸1-17、2-17、12-17或4-17。
本发明使用的修饰的胃泌素化合物包括PCT/CA03/01778、US系列号.10/719,450和U.S.申请系列号.60/519,933中描述的修饰的胃泌素化合物，这些文献的全文引入作为参考。
特别是，修饰的胃泌素可以是胃泌素衍生物或类似物，包括胃泌素的6个氨基酸(从C-末端)的最小序列，特别是SEQ ID NO11或12的氨基酸残基1-34、18-34或29-34，或SEQ ID NO.13或14的氨基酸残基1-17、2-17、2-17或14-17，还包括能进行加成反应的反应基团。反应基团的例子包括不限于硫醇、α氨基、ε氨基、羧基或芳环。反应基团通常能直接或通过交联剂和/或间隔区间接将胃泌素序列连接到载体上。
可通过添加或取代包含反应基团的氨基酸导入反应基团，例如通过添加Cys或Lys。因此，修饰的胃泌素可包括胃泌素序列(如胃泌素-34或胃泌素17)，其中至少一个活性氨基酸(如Cys或Lys)被添加或取代。所添加的活性氨基酸可以位于末端区域，特别是N-末端区域。
修饰的胃泌素也可任选地包含间隔基。间隔基可与反应基团相互作用，例如与包含反应基团的氨基酸。间隔基可以是一种或多种氨基酸、肽、肽模拟物、小有机分子。间隔基可包含至少1个氨基酸，优选至少2、3、4或5个氨基酸，在某些实施方案中，其是几个氨基酸的序列，包括不限于Ala或Gly。间隔基可包括交替的氨基酸(如Gly和/或Ala)、非交替的氨基酸、随机序列或特定序列。作为举例，间隔基可以是合成的作为胃泌素序列的一部分，或可以通过化学连接到胃泌素序列的氨基酸上。
修饰的胃泌素可任选地包含交联剂。交联剂可包括用于与胃泌素、间隔基和/或反应基团直接或间接起反应的同双官能或异双官能部分。交联剂可与胃泌素序列或间隔基起反应，或可添加到修饰的胃泌素末端(特别是N-末端)的反应基团上。
交联剂可以是任何能直接或通过间隔基连接胃泌素序列与载体的试剂。同双官能交联剂的例子包括不限于氨基定向的同双官能交联剂，例如双酰亚胺酯(如甲基乙酰亚胺酯-HCl)、双官能芳基卤化物(如1，5-二氯-2，4-二硝基苯)、双官能酰化剂(如二异氰酸酯)、双官能磺酰卤(如苯酚-2，4-二磺酰氯)、双官能酰叠氮(如tartryldiazide)、二醛(如戊二醛)以及二酮(如2，5-己二酮)。异双官能交联剂的例子包括氨基和巯基定向的双官能试剂(如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代丙酸酯)、羧基和巯基或氨基定向的双官能试剂(如对硝基苯基重氮乙酸酯)、以及羰基和巯基定向的双官能试剂(如1-(氨基氧)-4-[3-硝基-2-吡啶基)二硫代)]丁烷)。
修饰的胃泌素可任选地包含可以是聚合物的载体。载体可以是氨基酸(蛋白)、糖(多糖)、核苷的聚合物，合成的聚合物及其混合物。蛋白载体可以是循环系统中的蛋白。循环系统，特别是人循环系统中的蛋白载体的例子包括不限于血浆成分，例如血清、纯化的血清蛋白，例如白蛋白(特别是人血清白蛋白)、转铁蛋白或免疫球蛋白、红细胞蛋白例如血型糖蛋白A和AE-1、糖结合蛋白例如凝集素、灭活的酶、磷酸盐和硫酸盐结合蛋白、以及脂质结合蛋白。其他合适的聚合载体的例子包括不限于纤维素及其衍生物、淀粉及其衍生物、肝素及其衍生物、以及诸如聚乙二醇(PEG)和葡聚糖的合成聚合物及其衍生物。载体可以通过反应基团连接到胃泌素或间隔基上，或被引入到载体、胃泌素和/或间隔基上。例如，载体可共价连接到胃泌素或间隔基的反应基团(例如硫醇基、α和ε氨基、羧基或芳基)上，所述反应基团可以是已有的或通过化学修饰胃泌素或间隔基所添加的。
在本发明某些方面中，修饰的胃泌素可包括SEQ ID NOS 11、12、13、14、17或18的胃泌素和载体。
一组修饰的胃泌素化合物包括的化合物具有从氨基末端开始包含Z-Ym-Xn-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6的氨基酸序列，其中AA1是Tyr或Phe，AA2是Gly、Ala或Ser，AA3是Trp、Val或Ile，AA4是Met或Leu，AA5是Asp或Glu以及AA6是Phe或Tyr，且其中AA6任选地被酰胺化；Z是载体，特别是聚合物，且当该聚合物是蛋白时，Z是氨基酸序列；Ym是任选的间隔区，包括小的中性氨基酸的m个氨基酸残基，所述小的中性氨基酸包括但不限于丝氨酸和丙氨酸，以及X是SEQID NO11或12的残基1-28(＝n)或SEQ ID.NO.13或14的残基1-11的任意连续部分，只要胃泌素化合物结合胃泌素/CCKB受体即可。一般来说，m是0至约20个残基。在一个方面，Z是蛋白，特别是循环系统蛋白，更优选是血清蛋白，还优选是白蛋白，最优选是人血清白蛋白。
在实施方案中，X是来自SEQ ID NO11的18-28位的一个或多个氨基酸残基。因此，由于X的存在，胃泌素化合物可具有来自18-28、19-28、20-28、21-28位等的任何胃泌素序列。胃泌素化合物任选地包含长度m的氨基酸间隔基(Y)，m是0至约20个残基。
在实施方案中，X是来自SEQ ID NO13或14的1-11位或2-11位的一个或多个氨基酸残基。因此，由于X的存在，胃泌素化合物可具有来自2-11、3-11、4-11、5-11位等的任何胃泌素序列。胃泌素化合物任选地包含长度为m的氨基酸间隔基(Y)，m是0至约20个残基。
胃泌素化合物包括结构式Xn-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6的修饰的胃泌素化合物，在此不存在间隔基(Y)且m为0，还可进一步包含双官能交联剂用于与载体Z反应或连接，在此Z进一步包含诸如葡聚糖和PEG的非蛋白质聚合物。
特别是在此描述的修饰的胃泌素化合物可进一步包含氨基末端半胱氨酸或赖氨酸残基。
在于此描述的修饰的胃泌素化合物的某些实施方案中，胃泌素成分至少包含SEQ ID NO11或12的氨基酸残基29-34，并与聚合物、脂质或碳水化合物缔合。所述聚合物可以是合成的或天然存在的聚合物。术语聚合物包括氨基酸的蛋白聚合物，且不限于合成的聚合物。该聚合物可以是聚乙二醇(PEG)或葡聚糖。修饰的胃泌素化合物以SEQID NO11或12或“大”胃泌素-34为基础，在32位残基处分别为甲硫氨酸或亮氨酸。
另一种优选的修饰的胃泌素化合物包含结构C-Ym-X，其中C是Cys或Lys，Ym是任选的间隔区，包含m个小的中性氨基酸的氨基酸残基，以及X至少是6个氨基酸残基，至少包含胃泌素-17(SEQ ID NO13或14)的12-17位或胃泌素-34(SEQ ID NO11或12)的29-34位。该修饰的胃泌素化合物可进一步包含双功能交联剂，其中交联剂的一个活性部分共价结合于C，其他活性部分共价结合于聚合物或蛋白。
在本发明一个特定方面中，修饰的胃泌素化合物中的AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6是Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe[SEQ ID NO.23]或Tyr-Gly-Trp-Leu-Asp-Phe[SEQ ID NO.24]。
胃泌素化合物可以是通过使用蛋白质化学领域众所周知的化学合成方法所合成的，例如固相合成(Merrifield，1964，J.Am.Chem.Assoc.852149-2154)，或在均相溶液中合成(Houbenweyl，1987，Methods ofOrganic Chemistry，编辑.E.Wansch，Vol.15 I和II，Thieme，Stuttgart)。可以使用手工处理程序或通过自动操作进行合成。自动合成可以例如使用Applied Biosystems 431A肽合成仪(Perkin Elmer)进行。胃泌素化合物也可通过商业途径获得。例如，在15位具有甲硫氨酸或亮氨酸的合成的人胃泌素17可购自Bachem AG，Bubendorf，(Switzerland)和Research Plus Inc(New Jersey，USA)。
“胃泌素/CCK受体”指具有与缩胆囊素(CCK)的特征性结合亲合力的G-蛋白偶联的受体家族成员，包括不限于CCK-8、脱硫的CCK-8、CCK-33、CCK-4或胃泌素，包括不限于脱硫的或硫化的胃泌素-17，或五肽胃泌素，或其他CCK或胃泌素类似物或家族成员。CCK/胃泌素受体蛋白的例子是CCKA和CCKB/胃泌素受体，特别是CCKB/胃泌素受体。
“状况和/或疾病”指单独或联合使用GLP-1激动剂或胃泌素化合物提供了有益或治疗效果的一种或多种病理学症状或综合征。所述状况和/或疾病可能需要降低血糖水平、抑制胃酸分泌、抑制β-细胞凋亡、刺激β-细胞增殖或分化、以及减轻体重。状况和/或疾病的例子包括但不限于血脂异常、高血糖、重度低血糖症发作、中风、左心室肥大、心律失常、菌血症、败血症、肠激惹综合征、机能性消化不良、糖尿病、手术后分解代谢改变、应激诱导的高血糖、呼吸窘迫综合征、胃溃疡、心肌梗塞、葡萄糖耐量低减、高血压、慢性心力衰竭、液体潴留状态、代谢综合征和相关的疾病及障碍、肥胖症、糖尿病合并症以及其他疾病的症状，其中由于葡萄糖水平升高导致组织受损，包括阿尔茨海默病，帕金森病、和其他年龄相关的组织退行性疾病，以及升高的瘦蛋白的关节效应，例如在具有葡萄糖耐量低减的患者和非糖尿病肥胖症患者中。
在此使用的术语“糖尿病”指在包括实验动物模型和人的任何哺乳动物中出现的任何糖尿状况状，例如I型和II型糖尿病、早期糖尿病和特征在于轻度减少的胰岛素或轻度升高的血糖水平的糖尿病前状况。“糖尿病前状况”描述了根据胰岛素或葡萄糖水平证明具有症状，和/或由于家族史、遗传倾向或涉及II型糖尿病的肥胖证明易患糖尿病或相关症状的受试者，并包括先前患有糖尿病或相关状况以及处于复发风险的受试者。
“促胰岛素活性”指物质响应升高的葡萄糖水平刺激胰岛素分泌以引起或增加细胞葡萄糖摄取并减少血清葡萄糖或血糖水平的能力。促胰岛素活性可用本领域公知的方法进行分析。举例来说，可使用测定GLP-1受体结合活性或胃泌素受体结合活性、受体活化(参见Gelfand等的EP 619,322和US 5,120,712中所描述的方法)和/或胰岛素或C-肽水平的体外和体内方法。如果在化合物、组合物或缀合物存在下胰岛细胞分泌胰岛素的水平超过本底水平或不存在化合物、组合物或缀合物下的水平，则在此描述的化合物、组合物或缀合物具有促胰岛素活性。可给予动物化合物并随时间监测胰岛素浓度。
“胰岛新生”指通过分化形成新的β细胞，其可具有或不具有干细胞无限再生能力的特性。
发明实施方案详述本发明涉及利用GLP-1激动剂和胃泌素化合物以提供有益效果的组合物、缀合物和方法。特别是，本发明涉及用于预防、干预和/或治疗在此讨论的状况和/或疾病的组合物、缀合物和方法，包括GLP-1激动剂和胃泌素化合物。在本发明方面中，相对于单独使用GLP-1激动剂和/或胃泌素化合物，本发明的组合物、缀合物和方法提供了增强的有益效果，特别是持久的有益效果。所述有益效果可以是加和或协同的。
在本发明方面中，所述状况和/或疾病是糖尿病，本发明的组合物、联合治疗或缀合物的有益效果，特别是持久的有益效果可表现为如下一种或几种a)在给予具糖尿状况状的受试者后，相对于在不存在活性化合物或单独使用每种化合物下测定的水平，增加胰腺胰岛素水平。优选在受试者中化合物共同导致胰腺胰岛素水平增加至少约0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、5％、10％、15％、20％、30％、33％、35％、40％、45％或50％。
b)在给予具糖尿状况状的受试者后，减轻胰岛炎症的症状。
c)在具糖尿状况状的受试者中，相对于在不存在化合物或单独使用每种化合物下测定的水平，降低血糖水平。优选地，所述化合物导致血糖水平降低至少约1％、2％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。最优选地，所述化合物产生的血糖水平接近于正常受试者的常规水平。
d)在具糖尿状况状的受试者中，相对于在不存在化合物或单独使用每种化合物下测定的水平，增加C-肽水平。优选地，所述化合物共同导致C-肽水平增加至少约0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、5％、10％、15％、20％、30％、33％、35％、40％、45％或50％。
e)在一段长时间内维持血糖水平接近正常水平。
f)在一段长时间内维持血红蛋白Alc或糖基化的血红蛋白接近正常水平，特别是维持血红蛋白Alc％在6-8％，更特别是在约7％。
g)减少对β-细胞的破坏。优选地，所述化合物导致至少约1％、2％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的减少。
h)增加β-细胞功能。优选地，所述化合物导致β-细胞功能增加至少约1％、2％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
i)减少、阻止或减缓糖尿病受试者疾病进展的速度。
j)减少或阻止糖尿状况状的重症高血糖和酮酸中毒的发展。
k)增加具糖尿状况状受试者的存活率。
在本发明实施方案中，有益效果或持久的有益效果包括或基本上由a)-k)中的2、3、4、5、6、7、8、9、10或11种组成。在特定的实施方案中，有益效果或持久的有益效果包括或基本上由a)、b)和c)；a)、b)、c)和d)；a)、b)、c)、d)和e)；a)、b)、c)、d)、e)和f)；a)、b)、c)、d)、e)、f)和g)；a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)和h)；a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)和i)；a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)和j)；a)、d)和e)；a)、d)、e)和h)；a)、d)、e)、h)和i)；a)、d)、e)、h)、i)和j)；a)、b)、c)、d)、e)、h)、i)和j)；a)、b)、c)、d)、e)、h)、i)、j)和k)；b)、c)、d)和e)；b)、c)、d)、e)、h)、i)和j)；以及b)、h)、i)和j)组成。
一种或多种这些有益效果或持久的有益效果可在糖尿病患者或疾病模型中得到证实，例如在具有糖尿状况状的非肥胖(NOD)小鼠中，使用了本领域技术人员公知的标准方法。例如，可使用市场上可买到的方法和试剂盒来分析胰腺胰岛素水平、葡萄糖水平、C-肽水平和血红蛋白Alc。
基于包括其促胰岛素活性、增加GLP-1激动剂活性(特别是增加GLP-1激动剂的促胰岛素效果)的能力、和/或增加GLP-1激动剂物理或化学稳定性的特点，可选择用于本发明特定技术方案并提供特定有益效果的胃泌素化合物。也可基于其刺激β细胞增殖/分化的能力以及其体内半衰期来选择胃泌素化合物。
在本发明的一方面中，本发明方法、组合物和缀合物中所使用的胃泌素化合物是胃泌素17及其与聚合物缔合的类似物和衍生物。在一个特定方面中，所述胃泌素化合物是合成的人胃泌素I，具有17个氨基酸残基，在15位氨基酸处为Leu残基[SEQ ID NO.14]。
在本发明另一方面中，本发明方法、组合物和缀合物中所使用的胃泌素化合物是胃泌素34及其类似物和衍生物。在一个特定方面中，所述胃泌素化合物是合成的人胃泌素34，在32位为甲硫氨酸或亮氨酸[SEQ ID NO.11或12]。
在本发明再一方面中，本发明方法、组合物和缀合物中所使用的胃泌素化合物是胃泌素34或胃泌素17或其部分，直接或间接与血清蛋白相互作用或缔合，特别是白蛋白或免疫球蛋白，更特别是人血清白蛋白。
在本发明特定方面中，胃泌素化合物包括合成的人胃泌素34，具有SEQ ID NO.11或12的2-34位氨基酸残基，以及任选的N-末端半胱氨酸和/或载体；合成的人胃泌素，具有1-17个氨基酸残基，在15位氨基酸处为Leu残基[SEQ ID NO.14]，以及任选的N-末端半胱氨酸残基；和合成的人胃泌素，具有SEQ ID NO.13或14的2-17位或5-17位氨基酸残基，任选地带有N-末端半胱氨酸残基和/或通过间隔基[如Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala，即(GA)5][SEQ ID NO.25]连接的载体(如PEG或人血清白蛋白)，特别是，合成的人胃泌素，具有SEQ ID NO.13或14的2-17位或5-17位氨基酸残基，通过Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala[即(GA)5]间隔基连接有人血清白蛋白(HSA)聚合物，和任选的N-末端半胱氨酸残基。
基于一种或多种如下特性，可选择用于本发明特定应用的GLP-1激动剂结合GLP-1受体的能力，优选具有小于约1μM，更优选小于约100nM的亲合常数Kd；启动产生促胰岛素活性的信号转导途径的能力；促胰岛素活性；刺激β细胞增殖/分化；抗DP IV切割；和使用常规方法测定的至少约15分钟-24小时的人体内半衰期，优选2-10小时或2-8小时(参见例如，US 2003/0144206中描述的方法)。
在本发明的方面中，GLP-1激动剂是天然截短的GLP-1多肽(GLP-1(7-36)或GLP-1(7-37))，或其类似物或衍生物。这些天然存在的截短GLP-1激动剂的序列如SEQ ID NOs.4、5和6所示。
在本发明某些方面中，GLP-1激动剂可具有修饰的SEQ ID NOs.1、2或3的氨基酸序列，使得1-20位，优选1-15位，更优选1-10位，最优选1-5位的氨基酸残基不同于SEQ ID NOs.1、2或3的序列。
在本发明的一个实施方案中，GLP-1激动剂是GLP-1(7-37)或GLP-1(7-36)的类似物，其具有少于10个不同于GLP-1(7-37)或GLP-1(7-36)中那些的氨基酸残基，少于5个不同于GLP-1(7-37)或GLP-1(7-36)中那些的氨基酸残基，少于3个不同于GLP-1(7-37)或GLP-1(7-36)中那些的氨基酸残基，优选仅有1个氨基酸残基不同于GLP-1(7-37)或GLP-1(7-36)序列。
在本发明中具有特定作用的GLP-1激动剂包括GLP-1(7-37)或GLP-1(7-36)N-末端和/或C-末端添加了一个或多个氨基酸的多肽。优选地，约1-6个氨基酸可添加到N-末端和/或约1-8个氨基酸可添加到C-末端。在某些应用中，所选择的GLP-1激动剂具有最多39个氨基酸。可选择延伸的GLP-1激动剂的1-6位的氨基酸使得它们是亲本GLP-1(7-37)或GLP-1(7-36)相应位置处的氨基酸的相同氨基酸或保守取代。可选择延伸的GLP-1激动剂的38-45位的氨基酸使得它们是exendin-3或exendin-4(分别为SEQ ID NO.7和8)相应位置处的氨基酸的相同氨基酸或保守取代。
在本发明方面中，使用的GLP-1激动剂包括第8位类似物，其中这样的其类似物或片段的主链含有除丙氨酸之外的氨基酸。在第8位的氨基酸可选自甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或甲硫氨酸。
在一个实施方案中，GLP-1激动剂是GLP-1(1-37)的促胰岛素类似物，例如Met8-GLP-1(7-37)，其中第8位的丙氨酸已被甲硫氨酸所取代并缺失1-6位的氨基酸残基，和Arg34-GLP-1(7-37)，其中第34位的缬氨酸已被精氨酸所取代并缺失1-6位的氨基酸残基。
在另一个实施方案中，GLP-1激动剂选自具有GLP-1(7-37)OH和GLP-1(7-36)酰胺的序列以及相应的第8位类似物，其中这样的类似物的主链含有除丙氨酸之外的氨基酸。第8位的氨基酸可选自甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或甲硫氨酸，优选缬氨酸或甘氨酸。所述类似物可额外含有(a)选自谷氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、精氨酸的第22位氨基酸，优选谷氨酸或赖氨酸；(b)选自谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸或组氨酸的第30位氨基酸；(c)选自赖氨酸、精氨酸、苏氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸或组氨酸的第37位氨基酸；和/或(d)选自丙氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸或组氨酸的第27位氨基酸。
供本发明使用的一组GLP-1类似物和衍生物包括US 5,545,618和US专利申请系列号20040018975中描述的GLP-1激动剂。所述类似物包括在7-10位具有氨基酸取代和/或在C-末端截短和/或在基本肽中含有各种其他氨基酸取代的活化的GLP-1肽，7-34、7-35、7-36和7-37。优选的类似物包括在第7和8位具有D-氨基酸取代和/或在第7位N-烷基化或N-酰化的氨基酸的那些，因为它们对体内降解具有特定的抗性。
在本发明的方面中，GLP-1激动剂包括肽，所述肽包含或选自GLP-1(1-38)、GLP-1(1-39)、GLP-1(1-40)、GLP-1(1-41)、GLP-1(7-38)、GLP-1(7-39)、GLP-1(7-40)和GLP-1(7-41)。
在本发明的另一方面中，GLP-1激动剂的至少一个氨基酸具有至少一个直接或间接(如通过诸如γ-Glu或β-Ala的间隔基)连接的取代基。通常选择使亲本GLP-1激动剂的作用曲线更加延长、使得GLP-1激动剂更具代谢和物理稳定性、和/或增加GLP-1激动剂溶解度的取代基。特定取代基的例子是酰胺、碳水化合物和亲脂取代基。亲脂取代基包括但不限于烷基、具有ω-羧酸基的基团、直链或支链脂肪酸或链烷的酰基，例如十四烷酰基、十六烷酰基。本发明特定的组合物、缀合物和治疗使用了具有亲脂取代基的GLP-1激动剂，例如描述于WO 99/43341(Novo Nordisk)和US 2003/0119734A1(Novo Nordisk)中的那些。
在本发明的特定方面中，GLP-1激动剂是GLP-1(7-36)-酰胺或Tyr31-exendin-4(1-31)-酰胺。
本发明的某些方面提供了作为包含亲脂取代基的GLP-1(7-36)或GLP-1(7-37)衍生物的GLP-激动剂。在一个实施方案中，GLP-1激动剂是Arg34Lys26(Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基)))-GLP-1(7-37)。
在本发明的实施方案中，GLP-1激动剂包括或选自Gly8-GLP-1(7-36)-酰胺，Gly8-GLP-1(7-37)、Val8-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8-GLP-1(7-37)、Val8Asp22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Asp22-GLP-1(7-37)、Val8Glu22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Lys22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Lys22-GLP-1(7-37)、Val8Arg22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Arg22-GLP-1(7-37)、Val8His22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8His22-GLP-1(7-37)、Arg26-GLP-1(7-37)、Arg34-GLP-1(7-37)、Lys36-GLP-1(7-37)、Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)、Arg26，34-GLP-1(7-37)、Arg26，34Lys40-GLP-1(7-37)、Arg26Lys36-GLP-1(7-37)、Arg34Lys36-GLP-1(7-37)、Val8Arg22-GLP-1(7-37)、Met8Arg22-GLP-1(7-37)、Gly8His22-GLP-1(7-37)；、Val8His22-GLP-1(7-37)、Met8His22-GLP-1(7-37)、His37-GLP-1(7-37)、Gly8-GLP-1(7-37)、Val8-GLP-1(7-37)、Met8-GLP-1(7-37)、Gly8Asp22-GLP-1(7-37)、Val8Asp22-GLP-1(7-37)、Met8Asp22-GLP-1(7-37)、Gly8Glu22-GLP-1(7-37)、Val8-GLP-1(7-37)、Gly8Lys22-GLP-1(7-37)、Val8Lys22-GLP-1(7-37)、Glu22Met8Glu22-GLP-1(7-37)、Gly8Lys22-GLP-1(7-37)、Val8Lys22-GLP-1(7-37)、Met6Lys22-GLP-1(7-37)、Gly8Arg22-GLP-1(7-37)、Val8Lys22His37-GLP-1(7-37)、Gly8Glu22His37-GLP-1(7-37)、Val8Glu22His37-GLP-1(7-37)、Met8Glu22His37-GLP-1(7-37)、Gly8Lys22His37-GLP-1(7-37)、Met8Lys22His37-GLP-1(7-37)、Gly8Arg22His37-GLP-1(7-37)、Val8Arg22His37-GLP-1(7-37)、Met8Arg22His37-GLP-1(7-37)、Gly8His22His37-GLP-1(7-37)、Val8His22His37-GLP-1(7-37)、Met8His22His37-GLP-1(7-37)、Gly8His37-GLP-1(7-37)、Val8His37-GLP-1(7-37)、Met8His37-GLP-1(7-37)、Gly8Asp22His37-GLP-1(7-37)、Val8Asp22His37-GLP-1(7-37)、Met8Asp22His37-GLP-1(7-37)、Arg26-GLP-1(7-36)-酰胺、Arg34-GLP-1(7-36)-酰胺、 Lys36-GLP-1(7-36)-酰胺、Arg26，34Lys36-GLP-1(7-36)-酰胺、Arg26，34-GLP-1(7-36)-酰胺、Arg26，34Lys40-GLP-1(7-36)-酰胺、Arg26Lys36-GLP-1(7-36)-酰胺、Arg34Lys36-GLP-1(7-36)-酰胺、Gly8-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8-GLP-1(7-36)-酰胺、Met8-GLP-1(7-36)-酰胺、Gly8Asp22-GLP-1(7-36)-酰胺、Gly8Glu22His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Asp22-GLP-1(7-36)-酰胺、Met8Asp22-GLP-1(7-36)-酰胺、Gly8Glu22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Glu22-GLP-1(7-36)-酰胺、Met8Glu22-GLP-1(7-36)-酰胺、Gly8Lys22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Lys22-GLP-1(7-36)-酰胺、Met8Lys22-GLP-1(7-36)-酰胺、Gly8His22His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Gly8Arg22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Arg22-GLP-1(7-36)-酰胺、Met8Arg22-GLP-1(7-36)-酰胺、Met8Arg22His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Gly8His22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8His22-GLP-1(7-36)-酰胺、Met8His22-GLP-1(7-36)-酰胺、His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Arg22His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Met8Arg22His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Gly8His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Met8His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Gly8Asp22His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Asp22His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Met8Asp22His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Glu22His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Met8Glu22His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Gly8Lys22His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Lys22His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Met8Lys22His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Gly8Arg22His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8His22His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Met8His22His37-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8-GLP-1(7-37)OH，、Gly8-GLP-1(7-37)OH、Glu22-GLP-1(7-37)OH、Asp22-GLP-1(7-37)OH、Arg22-GLP-1(7-37)OH、Lys22-GLP-1(7-37)OH、Cys22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Asp22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Arg22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Cys22-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Asp22-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Arg22-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Cys22-GLP-1(7-37)OH、Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Asp22-GLP-1(7-36)NH2、Arg22-GLP-1(7-36)NH2、Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Cys22-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Arg22-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Cys22-GLP-1(7-36)NH2、Gly8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Gly8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2、Gly8-Arg22-GLP-1(7-36)NH2、Gly8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Gly8-Cys22-GLP-1(7-36)NH2、Lys23-GLP-1(7-37)OH、Val8-Lys23-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Lys23-GLP-1(7-37)OH、His24-GLP-1(7-37)OH、Val8-His24-GLP-1(7-37)OH、Gly8-His24-GLP-1(7-37)OH、Lys24-GLP-1(7-37)OH、Val8-Lys24-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Lys23-GLP-1(7-37)OH、Glu30-GLP-1(7-37)OH、Val8-Glu30-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Glu30-GLP-1(7-37)OH、Asp30-GLP-1(7-37)OH、Val8-Asp30-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Asp30-GLP-1(7-37)OH、Gln30-GLP-1(7-37)OH、Val8-Gln30-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Gln30-GLP-1(7-37)OH、Tyr30-GLP-1(7-37)OH、Val8-Tyr30-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Tyr30-GLP-1(7-37)OH、Ser30-GLP-1(7-37)OH、Val8-Ser30-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Ser30-GLP-1(7-37)OH、His30-GLP-1(7-37)OH、Val8-His30-GLP-1(7-37)OH、Gly8-His30-GLP-1(7-37)OH、Glu34-GLP-1(7-37)OH、Val8-Glu34-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Glu34-GLP-1(7-37)OH、Ala34-GLP-1(7-37)OH、Val8-Ala34-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Ala34-GLP-1(7-37)OH、Gly34-GLP-1(7-37)OH、Val8-Gly34-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Gly34-GLP-1(7-37)OH、Ala35-GLP-1(7-37)OH、Val8-Ala35-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Ala35-GLP-1(7-37)OH、Lys35-GLP-1(7-37)OH、Val8-Lys35-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Lys35-GLP-1(7-37)OH、His35-GLP-1(7-37)OH、Val8-His35-GLP-1(7-37)OH、Gly8-His35-GLP-1(7-37)OH、Pro35-GLP-1(7-37)OH、Val8-Pro35-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Pro35-GLP-1(7-37)OH、Glu35-GLP-1(7-37)OH、Val8-Glu35-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Glu35-GLP-1(7-37)OH、Val8-Ala27-GLP-1(7-37)OH、Val8-His37-GLP-1(7-37)OH、Val8-Glu22-Lys23-GLP-1(7-37)OH、Val8-Glu22-Glu23-GLP-1(7-37)OH、Val8-Glu22-Ala27-GLP-1(7-37)OH、Val8-Gly34-Lys35-GLP-1(7-37)OH、Val8-His37-GLP-1(7-37)OH和Gly8-His37-GLP-1(7-37)OH及其衍生物。
在一个特定的实施方案中，GLP-1激动剂包括或选自Val8-GLP-1(7-37)OH、Gly8-GLP-1(7-37)OH、Glu22-GLP-1(7-37)OH、Lys22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Gly8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Gly8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Val8-His37-GLP-1(7-37)OH、Gly8-His37-GLP-1(7-37)OH、Arg34-GLP-1(7-36)NH2和Arg34-GLP-1(7-37)OH。
在另一个特定实施方案中，GLP-1激动剂包括或选自Gly8-GLP-1(7-37)、Val8GLP-1(7-37)、Val8Asp22GLP-1(7-37)、Val8Glu22GLP-1(7-37)、Val8Lys22GLP-1(7-37)和Val8His22GLP-(7-37)，及其类似物和衍生物。
在进一步的特定实施方案中，GLP-1激动剂包括或选自Gly8-GLP-1(7-36)酰胺、Val8GLP-1(7-36)酰胺、Val8Asp22GLP-1(7-36)酰胺、Val8Glu22GLP-1(7-36)酰胺、Val8Lys22GLP-1(7-36)酰胺和Val8His22GLP-1(7-36)酰胺，及其类似物和衍生物。
在本发明更进一步的实施方案中，GLP-1激动剂是exendin(如exendin3和exendin4)或其类似物、衍生物或片段。可在本发明中使用的exendins的例子包括不限于WO 9746584、US 5,424,286和WO01/04156中披露的那些。US 5,424,286描述了使用exendin多肽刺激胰岛素释放。在该美国专利中描述的exendin多肽包括HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGX，其中X＝P或Y，和HX1X2GTFITSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS；其中X1X2＝SD(exendin-3)或GE(exendin-4)。WO 9746584描述了能增加胰岛素分泌和生物合成并减少胰高血糖素的截短的exendin肽。WO01/04156描述了exendin-4的类似物和衍生物及其制备方法。
在另一个实施方案中，GLP-1激动剂是exendin-4(1-39)的促胰岛素类似物，特别是Ser2Asp3-exendin-4(1-39)，其中第2和3位的氨基酸残基已分别被丝氨酸和天冬氨酸取代(在本领域中该特定的类似物也称为exendin-3，SEQ ID NO.7)。
在本发明某些方面中，GLP-1激动剂是稳定的GLP-1激动剂，特别是稳定的GLP-1类似物或衍生物，或稳定的exendin-4或exendin-3类似物或衍生物。
可选择相较于单独使用GLP-1激动剂或胃泌素化合物提供有益效果，特别是统计显著的有益效果或持久的有益效果的本发明的药物组合物。与糖尿病状况相关的有益效果可通过在此描述的一种或多种有益效果得到证实，特别是上述有益效果a)-j)中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种。
提供了包含GLP-1激动剂的具有有益效果，特别是统计显著的有益效果或持久的有益效果的药物组合物，所述GLP-1激动剂选自Gly8-GLP-1(7-37)、Val8GLP-1(7-37)、Val8Asp22GLP-1(7-37)、Val8Glu22GLP-1(7-37)、Val8Lys22GLP-1(7-37)、Val8His22GLP-1(7-37)、Arg34Lys26(Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基)))-GLP-1(7-37)、Gly8-GLP-1(7-36)酰胺、Val8GLP-1(7-36)酰胺、Val8Asp22GLP-1(7-36)酰胺、Val8Glu22GLP-1(7-36)酰胺、Val8Lys22GLP-1(7-36)酰胺和Val8His22GLP-1(7-36)酰胺，以及胃泌素化合物(如SEQ ID NO.11、12、13或14)，任选地缔合于血清蛋白。
在一方面，提供了包含GLP-1(7-36)[SEQ ID NO.5]和胃泌素-17(leu)[SEQ ID NO.14]的具有统计显著的有益效果或持久的有益效果的药物组合物。
在一方面，提供了包含Arg34Lys26(Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基)))-GLP-1(7-37)和胃泌素-17(leu)[SEQ ID NO.14]的具有统计显著的有益效果或持久的有益效果的药物组合物。
在另一方面，提供了包含Aib8，35GLP-1(7-36)酰胺或Ser38，Lys39，40，41，42，43，44-Exendin-4(1-39)酰胺和胃泌素-17(leu)[SEQ IDNO.14]的具有统计显著的有益效果或持久的有益效果的药物组合物。
提供了包含GLP-1激动剂的具有统计显著的有益效果或持久的有益效果的药物组合物，所述GLP-1激动剂选自Gly8-GLP-1(7-37)、Val8GLP-1(7-37)、Val8Asp22GLP-1(7-37)、Val8Glu22GLP-1(7-37)、Val8Lys22GLP-1(7-37)、Val8His22GLP-1(7-37)、Arg34Lys26(Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基)))-GLP-1(7-37)、Gly8-GLP-1(7-36)酰胺、Val8GLP-1(7-36)酰胺、Val8Asp22GLP-1(7-36)酰胺、Val8Glu22GLP-1(7-36)酰胺、Val8Lys22GLP-1(7-36)酰胺和Val8His22GLP-1(7-36)酰胺，以及胃泌素化合物，所述胃泌素化合物具有包含从氨基末端开始的Z-Ym-Xn-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6的氨基酸序列，其中AA1是Tyr或Phe，AA2是G1y、Ala或Ser，AA3是Trp、Val或Ile，AA4是Met或Leu，AA5是Asp或Glu以及AA6是Phe或Tyr；Z是聚合物，且当该聚合物是蛋白时，Z是氨基酸序列；Ym是任选的间隔区，包括小的中性氨基酸m个的氨基酸残基，所述小的中性氨基酸包括但不限于丝氨酸和丙氨酸，以及X是SEQ ID NO11或12的残基1-28或SEQ ID.NO.13或14的残基1-11的任意连续部分，AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6优选是Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe或Tyr-Gly-Trp-Leu-Asp-Phe。在一个特定的实施方案中，Z是血清蛋白，特别是人血清白蛋白。
在本发明某些方面中，利用了GLP-1激动剂药学上可接受的盐和/或胃泌素化合物药学上可接受的盐。
在本发明特定方面中，提供了适合给予受试者以提供持久的有益效果以治疗状况和/或疾病优选糖尿病的药物组合物。在一个预防和/或治疗糖尿病的实施方案中，所述组合物以给予受试者导致血糖水平接近正常水平并在停止治疗后维持该水平一段长时间的这样一种的形式存在。
本发明提供了包含连接到胃泌素化合物或与其相互作用的GLP-1激动剂的缀合物，其中所述相互作用是例如通过氨基或羧基的。本发明也涉及本发明分离的共价缀合物，以及包含本发明共价缀合物的组合物。GLP-1激动剂可通过OH与胃泌素化合物的COOH之间的酯键缀合到物质上。GLP-1激动剂和胃泌素化合物的缀合物可缀合有中间间隔基或接头。合适的间隔基或接头可以是单糖或二糖、氨基酸、硫酸酯、琥珀酸酯、乙酸酯或包含一个或多个上述部分的寡聚间隔基或接头。
本发明也提供了制备缀合物的方法，所产生的缀合物具有改良的药物代谢动力学特性、生物活性和有益效果。该方法包括在容许两种化合物之间形成共价键的条件下将GLP-1激动剂与胃泌素化合物温育。因此，本发明涉及一种制备包含共价键合或连接到胃泌素化合物上的GLP-1激动剂的共价缀合物的方法，所述方法包括在足以在GLP-1激动剂和胃泌素化合物之间形成共价键或键合的条件、pH和时间下将GLP-1激动剂与胃泌素化合物温育；并分离共价缀合物。上述制备包含GLP-1激动剂和胃泌素的缀合物的方法提供了具有足够量的共价连接到GLP-1激动剂上的GLP-1激动剂的缀合物。
也可通过重组技术将GLP-1激动剂的N-末端或C-末端序列融合到胃泌素化合物序列上以制备N-末端或C-末端融合蛋白或嵌合蛋白，其包含与胃泌素化合物缀合的GLP-1激动剂，任选地具有间隔基或接头。
本发明涉及使用在此描述的方法制备的缀合物。本发明也涉及包含本发明缀合物和药学上可接受的载体、赋形剂或媒介物的药物制剂或组合物。
本发明进一步涉及基本上纯的共价缀合物的药物制剂或组合物，所述缀合物包含共价连接胃泌素化合物的GLP-1激动剂，与仅有GLP-1激动剂相比，其提供了有益效果，优选持久的有益效果。在一个实施方案中，提供了基本上由包含共价连接而非通过中间间隔基或接头连接到胃泌素化合物的GLP-1激动剂的共价缀合物组成的药物制剂。在另一个实施方案中，提供了基本上由包含通过中间间隔基或接头共价连接到胃泌素化合物的GLP-激动剂的共价缀合物组成的药物制剂。
在本发明方面中，与单独使用GLP-1激动剂或胃泌素化合物的活性或GLP-1(7-37)OH的活性相比，包含GLP-1激动剂和胃泌素化合物的组合物或缀合物在治疗后具有更加持久的促胰岛素活性。
本发明提供了用于预防、治疗和/或干预受试者状况和/或疾病的方法，包括给予本发明的胃泌素化合物和GLP-1激动剂或药物组合物以提供有益效果，特别是持久的有益效果。
在本发明提供有益效果，特别是统计显著的有益效果或持久的有益效果的方法中，GLP-1激动剂可选自Gly8-GLP-1(7-37)、Val8GLP-1(7-37)、Val8Asp22GLP-1(7-37)、Val8Glu22GLP-1(7-37)、Val8Lys22GLP-1(7-37)、Val8His22GLP-1(7-37)、Arg34Lys26(Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基)))-GLP-1(7-37)、Gly8-GLP-1(7-36)酰胺、Val8GLP-1(7-36)酰胺、Val8Asp22GLP-1(7-36)酰胺、Val8Glu22GLP-1(7-36)酰胺、Val8Lys22GLP-1(7-36)酰胺和Val8His22GLP-1(7-36)酰胺，以及胃泌素化合物可包含SEQ ID NO.11、12、13或14，任选地缀合于血清蛋白。
在本发明某些方法中，给予了GLP-1(7-36)[SEQ ID NO.5]和胃泌素-17(leu)[SEQ ID NO.14]。
在本发明某些其他方法中，给予了Arg34Lys26(Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基)))-GLP-1(7-37)和胃泌素-17(leu)[SEQ ID NO.14]。
在本发明某些其他方法中，给予了Aib8，35GLP-1(7-36)酰胺或Ser38，Lys39，40，41，42，43，44-Exendin-4(1-39)酰胺和胃泌素-17(leu)[SEQ IDNO.14]。
在本发明提供有益效果，特别是统计显著的有益效果或持久的有益效果的某些另外方法中，GLP-1激动剂选自Gly8-GLP-1(7-37)、Val8GLP-1(7-37)、Val8Asp22GLP-1(7-37)、Val8Glu22GLP-1(7-37)、Val8Lys22GLP-1(7-37)、Val8His22GLP-1(7-37)、Arg34Lys26(Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基)))-GLP-1(7-37)、Gly8-GLP-1(7-36)酰胺、Val8GLP-1(7-36)酰胺、Val8Asp22GLP-1(7-36)酰胺、Val8Glu22GLP-1(7-36)酰胺、Val8Lys22GLP-1(7-36)酰胺和Val8His22GLP-1(7-36)酰胺，以及胃泌素化合物从氨基末端开始包含Z-Ym-Xn-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6的氨基酸序列，其中AA1是Tyr或Phe，AA2是Gly、Ala或Ser，AA3是Trp、Val或Ile，AA4是Met或Leu，AA5是Asp或Glu以及AA6是Phe或Tyr；Z是聚合物，且当该聚合物是蛋白时，Z是氨基酸序列；Ym是任选的间隔区，包括小的中性氨基酸的m个氨基酸残基，所述小的中性氨基酸包括但不限于丝氨酸和丙氨酸，以及X是SEQ ID NO11或12的残基1-28或SEQ ID.NO.13或14的残基1-11的任意连续部分，AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6优选是Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe或Tyr-Gly-Trp-Leu-Asp-Phe。在一个特定的实施方案中，Z是血清蛋白，特别是人血清白蛋白。
在一方面中，本发明提供了一种用于预防和/或干预受试者中在此讨论的状况和/或疾病的方法，包括给予至少一种GLP-1激动剂和至少一种胃泌素化合物。GLP-1激动剂和胃泌素化合物可直接给予受试者或与细胞接触(如，干细胞或祖细胞)并将细胞给予受试者。
本发明也提供了一种用于预防和/或治疗受试者中在此讨论的状况和/或疾病的联合治疗，包括给予所述受试者治疗有效量的至少一种GLP-1激动剂和胃泌素化合物以提供有益效果。在本发明的一方面中，所提供的联合治疗或干预提供了在治疗之后持久的有益效果。
特别是，本发明提供了一种用于治疗或预防受试者中状况和/或疾病的联合治疗，包括给予所述受试者治疗有效量的至少一种GLP-1激动剂和至少一种胃泌素化合物以产生有益效果，优选持久的有益效果。
本发明也涉及一种治疗方法，包括联合给予具糖尿状况状的受试者治疗有效量的至少一种GLP-1激动剂和至少一种胃泌素化合物，刚一给予所述联合，就产生了有益效果，优选持久的有益效果，显示出降低的血糖水平和/或增加的胰腺胰岛素。
在本发明的一方面中，在给予受试者前混合治疗有效量GLP-1激动剂和胃泌素化合物。在一个实施方案中，在生理学可接受pH下混合治疗有效量的GLP-1激动剂和胃泌素化合物。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于刺激受试者中β细胞增殖的方法，包括给予治疗有效量的本发明组合物或缀合物，或联合给予GLP-1激动剂和胃泌素化合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于增加受试者中β细胞数量和/或大小的方法，包括给予治疗有效量的本发明组合物或缀合物，或联合给予GLP-1激动剂和胃泌素化合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于预防或治疗I型或II型糖尿病的方法，包括给予治疗有效量的本发明组合物或缀合物，或联合给予GLP-1激动剂和胃泌素化合物。
还在另一个实施方案中，本发明提供了一种在II型糖尿病人中用于改善疾病进展或获得较不严重疾病阶段的方法，包括给予治疗有效量的本发明组合物或缀合物，或联合给予GLP-1激动剂和胃泌素化合物。
本发明涉及一种延迟葡萄糖耐量低减或由非胰岛素需求的II型糖尿病到胰岛素需求的II型糖尿病进展的方法，包括给予治疗有效量的本发明组合物或缀合物，或联合给予GLP-1激动剂和胃泌素化合物。
本发明也涉及一种增加受试者胰岛素合成能力的方法，包括给予治疗有效量的本发明组合物或缀合物，或联合给予GLP-1激动剂和胃泌素化合物。
本发明进一步涉及在受试者中诱导胰岛新生，包括将胰岛前体细胞与足够量的本发明的GLP-1激动剂和胃泌素化合物、组合物或缀合物接触，以及增加受试者胰岛前体细胞增殖由此诱导胰岛新生。
本发明涉及一种在糖尿病患者中增加胰腺胰岛移植物中功能性β细胞量的方法，所述方法包括给予患者治疗有效量的本发明的GLP-1激动剂和胃泌素化合物、或组合物或缀合物。
在一方面中，本发明提供了用于在需要的患者中治疗糖尿病的方法，通过给予包含足够量的胃泌素化合物和GLP-1激动剂的组合物以实现患者胰腺胰岛前体细胞分化为成熟胰岛素-分泌细胞和/或刺激现有胰岛细胞中的胰岛素合成。所述组合物可全身给药或通过在表达载体中含有一种或多种核酸构建体的宿主细胞原位表达，其中所述核酸构建体包含胃泌素化合物编码序列或GLP-1激动剂编码序列或两种化合物的编码序列，以及在胰腺胰岛前体细胞中起作用的转录和翻译调控区。
本发明提供了用于处理细胞，优选培养中的细胞的方法，使用了本发明的GLP-1激动剂和胃泌素化合物，或本发明的组合物或缀合物。本发明也提供了基于细胞的治疗方法，使用了本发明的GLP-1激动剂和胃泌素化合物，或本发明的组合物或缀合物。常规培养和基于细胞的治疗方法的描述参见PCT/CA03/33595。
在一方面中，本发明涉及一种用于扩大并分化干细胞或祖细胞为胰岛素分泌细胞的方法，包括将干细胞或祖细胞与足够量的本发明的GLP-1激动剂和胃泌素化合物或组合物或缀合物接触，以扩大并分化干细胞或祖细胞。与不存在所述化合物、组合物或缀合物下所达到的结果相比，扩大和分化的量应具有显著差异，特别是与单独使用GLP-1激动剂或胃泌素化合物所达到的结果相比，该量应显著更大。在一个实施方案中，在培养中将所述干细胞或祖细胞与所述化合物、组合物或缀合物接触。在另一个实施方案中，在受试者中将所述干细胞或祖细胞与所述化合物、组合物或缀合物接触。在将干细胞植入受试者中以在受试者中扩大并分化所述干细胞的之前、过程中或之后，可将所述化合物、组合物或缀合物给予受试者。所述干细胞可获得自胰腺胰岛、脐带、胚胎、或干细胞系。该方法可额外包括给予免疫抑制剂。
本发明也涉及一种用于增强培养中的胰岛素分泌细胞增殖的方法，包括将所述细胞与足够量的本发明的GLP-1激动剂和胃泌素化合物、组合物或缀合物接触，以增强所述细胞的增殖。与不存在所述化合物、组合物或缀合物下所达到的结果相比，增殖的量应具有显著差异。在一个实施方案中，与单独使用GLP-1激动剂或胃泌素化合物所达到的结果相比，增殖的量应显著更大。
本发明还涉及一种在培养中用于维持胰岛细胞或前体细胞的方法，包括在培养中足够维持细胞的量的本发明的GLP-1激动剂和胃泌素化合物、组合物或缀合物存在下培养细胞。与在不存在所述化合物、组合物或缀合物或单独使用GLP-1激动剂或胃泌素化合物下所培养的细胞相比，所述细胞可在培养中维持明显更长的一段时间。在本发明的GLP-1激动剂和胃泌素化合物或组合物或缀合物存在下培养细胞在制备并维持供移植用的细胞中特别有用。
在一方面中，本发明提供了一种治疗状况和/或疾病的方法，包括将本发明的GLP-1激动剂和胃泌素化合物、组合物或缀合物与大量的细胞给予需要的受试者以由此产生有益效果、优选持久的有益效果。
一种用于治疗患在此描述的状况和/或疾病的受试者的方法，包括用本发明的GLP-1激动剂和胃泌素化合物、组合物或缀合物离体接触大量的细胞，任选地培养所述细胞，并将细胞给予需要的受试者。
在前述基于细胞治疗方法的实施方案中，所述细胞是胰管细胞，且在该方法中使用的化合物/组合物/缀合物的量是通常能有效增加受试者中胰岛素分泌细胞的量。所述细胞可以是自体的(即来自同一受试者)，或可以来自相同物种的另一个体，或来自不同物种。
本发明也涉及一种用于治疗受试者中糖尿病的方法，包括将胰腺胰岛制备物移植入受试者中并给予治疗有效量的本发明的GLP-1激动剂和胃泌素化合物、组合物或缀合物。
在本发明基于细胞的方法中，可依据状况和/或疾病的严重程度、给药方式和/或给药部位改变给予患有状况和/或疾病个体的细胞的数量。一般来说，细胞的治疗有效量是安全且有效的量，特别是提供一种或多种有益效果，特别是持久的有益效果或协同效应所必需的量。
可使用多种本领域技术人员所显而易见的方法将细胞给予受试者。合适的方法包括注射细胞到受试者的靶位中。细胞可插入到递送装置中以利于注射或植入受试者中。递送装置的例子包括用于将细胞和液体注射入受试者体内的管，如导管。可用多种不同方法制备用于递送的细胞。例如，可将细胞悬浮在溶液或凝胶中，或与药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂混合，在其中细胞保持了活力。药学上可接受的载体、赋形剂和稀释剂包括盐水、含水缓冲溶液、溶剂和/或分散介质。使用上述载体和稀释剂为本领域众所周知。所述溶液一般是无菌的，且应通常是等渗的。优选选择在制造和贮藏条件下是稳定的细胞溶液，并通过使用例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等的来抗微生物污染以进行保存。
细胞的给药方式包括不限于全身性心内、冠状动脉内、静脉内、皮内或动脉内注射以及直接注射入预期作用部位或在该部位周围的组织和器官中。可通过任何便利的途径给予细胞制备物，例如通过输注或快速浓注，且可与其他生物活性剂一起给予。在某些方面中，给药优选是全身性的。可通过任何便利的途径给予细胞制备物，例如通过输注或快速浓注，且可与其他生物活性剂一起给予。
本发明的方法可进一步包含测量或监测一种或多种如下标记物血糖、血清葡萄糖、血糖基化血红蛋白、胰腺β细胞量、血清胰岛素、胰腺胰岛素水平、形态度量测定的β细胞量、胰岛素分泌细胞数量、以及胰岛素分泌细胞的葡萄糖应答性。
本发明也涉及包括至少一种GLP-1激动剂和至少一种胃泌素化合物的组合的组合物用于制备在治疗状况和/或疾病中提供有益效果、优选持久的有益效果的药物。在一方面中，本发明涉及治疗有效量的至少一种GLP-1激动剂和至少一种胃泌素化合物在制备在治疗状况和/或疾病中提供有益效果、优选持久的有益效果的药物中的应用。在本发明的一个实施方案中，提供了GLP-1激动剂和胃泌素化合物在制备用于在治疗后增加(优选持久增加)受试者中β细胞数量和/或大小的药物中的应用。在本发明的另一个实施方案中，提供了GLP-1激动剂和胃泌素化合物在制备用于在治疗后刺激(优选持久刺激)β细胞增殖的药物中的应用。还在本发明的一个实施方案中，提供了GLP-1和胃泌素在制备用于治疗I型和II型糖尿病的药物中的应用。
本发明额外提供了本发明的药物组合物和缀合物在制备在状况和/或疾病治疗中具有有益效果、优选持久的有益效果的药物中的应用。
可在细胞培养中或使用实验动物通过标准的药学程序测定本发明的化合物、组合物和缀合物的疗效和毒性，例如通过计算诸如ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)或LD50(50％群体致死的剂量)统计资料的统计参数。治疗指数是疗效与毒性作用的剂量比，其可表示为ED50/LD50。优选具有大治疗指数的药物组合物。
本发明的化合物、组合物、药物和缀合物可以任何在受试者或患者体内能导致活性剂与其作用部位接触的方式给予。所述活性成分可同时或顺次给予，且可在不同的时间点以任何顺序给予，以提供所需的有益效果。所述化合物、缀合物和组合物可配制为用于缓释、局部或全身性递送的剂型。选择优化了本发明组合物、缀合物和治疗效果的给药剂型和途径落入熟练的医师和兽医的能力范围内。
组合物可以口服剂型给予，例如片剂、胶囊(分别包括缓释或定时释放的剂型)、丸剂、粉剂、粒剂、酏剂、酊剂、混悬剂、糖浆剂和乳剂。它们也可在静脉内(推注或输注)、腹膜内、皮下或肌内剂型给予，所有的都利用了药学领域普通技术人员众所周知的剂型。本发明的组合物可通过鼻内途经局部施用合适的鼻内媒介物给予，或透皮途径给予，例如使用常规的透皮皮肤贴剂。在整个给药方案中，使用了透皮给药系统的给药剂量设计应当是连续而非间断的。
一种特定的给药途径是肠胃外给药，优选外周肠胃外给药。肠胃外给药通常理解为指通过无菌注射器或诸如输液泵的一些其他机械装置。对于本发明来说，肠胃外途径包括静脉内、肌内、皮下和腹膜内给药途径。就肠胃外给药而言，在此描述的化合物或缀合物在适当的pH下可与蒸馏水混合。
本发明包括提供加和或协同活性、递送加和或协同有效量或递送以提供本发明的GLP-1激动剂和胃泌素化合物、缀合物或组合物的治疗有效量的量的联合治疗。因此，适用于本发明的药物组合物包括其中包含协同有效量或治疗有效量的活性成分的组合物。
本发明的给药方案可取决于诸如药剂的药物代谢动力学特性及其给药方式和途径；物种、年龄，性别、健康、医疗条件以及患者体重、症状的性质和程度、并存治疗的类型、治疗频率、给药途径、患者的肾和肝功能以及所需效果的公知因素而改变。普通熟练的医师或兽医可容易地测定预防、对抗或阻止状况的进展所需的药物有效量。
本发明的组合物、药物或治疗可包含单位剂量的至少一种GLP-1激动剂和单位剂量的至少一种胃泌素化合物。“单位剂量”指能给予患者的单元剂量，即单次剂量，其易于操作和包装，保持了物理和化学稳定的单位剂量包括这样的活性剂或与一种或多种固体或液体药用赋形剂、载体或媒介物的混合物。
在一方面中，提供了一种包含治疗有效最适剂量以下的GLP-1激动剂和胃泌素化合物的药物组合物，与单独使用胃泌素化合物或GLP-1激动剂剂量相比，在治疗后能在一段长时间内更有效地减少或降低葡萄糖水平。
在另一方面中，提供了一种改良的药物组合物，包含治疗有效最适量以下的GLP-1激动剂和胃泌素化合物，以用于长期或短期治疗状况或疾病、特别是糖尿病的形式存在。
在一个实施方案中，所述组合物包括以等于或比提供有益效果、特别是持久的有益效果以治疗状况和/或疾病所必需的每一化合物的剂量低至少1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍的剂量存在的GLP-1激动剂和胃泌素化合物。
在一方面中，本发明提供了一种药物组合物，包含0.5-6000、100-1500、100-6000、1000-6000、2000-6000和3000-6000微克每单位剂量的GLP-1激动剂及0.5-6000、100-3000、100-6000、1000-6000、2000-6000和3000-6000微克每单位剂量的胃泌素化合物。
在本发明另一方面中，提供了一种药物组合物，包含0.1-20、0.1-30、0.1-40、0.1-50和0.1-60微克/公斤/天的GLP-1和0.1-20、0.1-30、0.1-40、0.1-50和0.1-60微克/公斤/天的胃泌素化合物。
本发明的组合物或制剂可连续给予受试者2周-12个月、2周-6个月、2-16周、2周-12周和/或2-8周，或定期给药。
在一个实施方案中，选择本发明组合物中的GLP-激动剂与胃泌素化合物的比值以增加GLP-1激动剂和/或胃泌素化合物活性并提供有益效果、优选持久的有益效果。
GLP-1激动剂与胃泌素化合物可以所选择的以增加一种或两种化合物活性以产生有益效果、特别是持久的有益效果，和或产生累加或协同效应的比值存在。在实施方案中，GLP-1激动剂与胃泌素化合物的比可以是1∶1-1∶110、1∶1-1∶100、1∶1-1∶75、1∶1-1∶50、1∶1-1∶25、1∶1-1∶10、1∶1-1∶5和1∶1。在另一个特定的实施方案中，胃泌素化合物与GLP-1激动剂的比可以是1∶1-1∶110、1∶1-1∶100、1∶1-1∶75、1∶1-1∶50、1∶1-1∶25、1∶1-1∶10和1∶1-1∶5。
GLP-1激动剂可与治疗有效重量比为约1∶1-1∶150，特别是1∶1-1∶50的胃泌素化合物联合使用。在另一个实施方案中，胃泌素化合物可与可与治疗有效重量比为约1∶1-1∶150，特别是1∶1-1∶50的GLP-1激动剂联合使用。
本发明的组合物或其部分通常包含基于预期给药形式选择的合适的药用稀释剂、赋形剂、媒介物或载体，并相容于常规的制药实践。所述载体、媒介物等可适用于提供活性化合物的加和、协同有效量或治疗有效量。
合适的药学稀释剂、赋形剂、媒介物和载体描述于权威教科书Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company中。作为例子，以胶囊或片剂形式供口服给药，活性成分与口服无毒的药学上可接受的惰性载体，例如乳糖、淀粉、蔗糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、葡萄糖、钙、硫酸盐、磷酸二钙、甘露醇、山梨糖醇等结合。对于以液体形式供口服给药，所述药物成分可与任何口服无毒的药学上可接受的惰性载体，例如乙醇、甘油、水等结合。合适的粘合剂(如明胶、淀粉、玉米甜味剂、天然糖类包括葡萄糖；天然及合成树胶和蜡)、润滑剂(如油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠和氯化钠)、崩解剂(如淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土和黄原胶)、调味剂和着色剂也可与所述组合物或其组分结合。
在本发明的一方面中，所述药物组合物具有约7-10的pH。
本发明组合物肠胃外给药剂型可包括水溶液、糖浆剂、水或油混悬液和乳剂，带有诸如棉籽油、椰子油或花生油的食用油。可用于水混悬液的分散剂或悬浮剂包括诸如西黄蓍胶的合成或天然树胶、藻酸盐、阿拉伯胶、葡聚糖、羧甲基纤维素钠、明胶、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。
用于肠胃外给药的组合物可包含无菌的水溶剂或非水溶剂，例如水、等渗盐水、等渗葡萄糖溶液、缓冲溶液或其他方便用于治疗活性剂肠胃外给药的溶剂。供肠胃外给药所用的组合物也可包括常规添加剂，例如稳定剂，缓冲液或防腐剂，如抗氧化剂例如甲基羟基苯甲酸酯或类似的添加剂。
在一个实施方案中，提供了包含结晶或无定形的GLP-1激动剂和结晶或无定形的胃泌素化合物的固态药物组合物(如片剂、胶囊、粉末状或雾化形式)。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含GLP-1激动剂和胃泌素化合物药学上可接受的盐的液态药物剂型，以及可重配以提供能稳定且适于肠胃外给药的混悬液的冻干药物剂型。
在一个特定的实施方案中，本发明涉及包含GLP-1激动剂和胃泌素化合物药学上可接受盐和起溶解作用的溶剂系统的含水组合物。本发明也提供了包含GLP-1激动剂和胃泌素化合物药学上可接受盐以及至少一种溶解剂的含水剂型。
本发明的组合物可通过例如细菌保留过滤器过滤、添加灭菌剂到组合物中、辐射组合物或加热组合物以进行灭菌。或者，本发明的化合物、缀合物和组合物可以无菌固体制剂形式提供，如冻干粉，其在即将使用前易溶解于无菌溶剂中。
除了在此描述的剂型之外，所述组合物也可配制为贮存制剂。可通过植入(例如皮下或肌内植入)或肌内注射给予这样的长效剂型。因此，例如，所述组分可与合适的聚合物或疏水物质(例如，在可接受的油中作为乳剂)、或与离子交换树脂配制，或作为微溶的衍生物，例如作为微溶盐配制。
本发明的组合物及其组分可包含可溶性聚合物作为靶向药物载体。
在制备药物组合物后，它们可置于合适的容器中并贴上用于指示状况治疗的标签。对于本发明组合物给药而言，上述标签应包括给药量、频次和方法。
本发明也包括联合使用本发明组合物和一种或多种附加治疗剂的方法，所述附加治疗剂包括不限于免疫抑制药、减肥药、抗糖尿病药、食欲调节剂、抗高血压药、用于与状况和/或疾病引发的或相关的并发症治疗和/或预防的药剂，特别是糖尿病和肥胖、止恶心、止头痛药物，以及治疗或预防副作用的常规药物。
由于本发明涉及一种包含可分别或作为缀合物给予的活性剂的组合的治疗方法，所以本发明也提供了一种包含GLP-1激动剂和胃泌素化合物的试剂盒、以试剂盒形式存在的药物组合物或缀合物。本发明也涉及一种在一个盒子中包含一瓶GLP-1激动剂和另一瓶胃泌素的药物试剂盒。试剂盒可包含覆盖容器的包装，所述容器含有本发明的缀合物或组合物，且该容器也覆盖有用于给予受试者所述缀合物或组合物的说明书。
通过特定的实施例，本发明将得到更详细的描述。所提供的下列实施例仅作为例证的目的，并不意在以任何方式来限制本发明。本领域技术人员应容易识别各种可改变或修改以产生基本上相同结果的非关键参数。
实施例1在急性糖尿病NOD小鼠中联合使用胃泌素和GLP-1(Bachem，GLP-1(7-36)酰胺，人)的效果该实施例显示了通过在用GLP-1和胃泌素全身处理后体内刺激β-细胞新生而用于在糖尿病NOD小鼠中逆转糖尿病的方法和组合物。用媒介物(PBS)、GLP-1(300微克/公斤/天)、或GLP-1(300微克/公斤/天)+胃泌素(3微克/公斤/天)，在糖尿病发病后2天内向腹膜内每日注射两次，处理12-16周龄的雌性NOD小鼠仅18天。通过空腹血糖(FBG)水平(与正常的＜6.0mM的FBG相比，9-15mM)确定糖尿病的发病。每日监测小鼠尿糖水平一次，每周监测FBG水平一次。
在处理开始时，空腹血糖水平在11-14mM之间变化。处理18天后，FBG在媒介物-处理的小鼠中为24±1mM，在用GLP-1单独处理的小鼠中为13±2Mm，以及在联合使用GLP-1和胃泌素处理的小鼠中为6±1mM(平均值±SE，在处理组中小鼠n＝4，在对照组中小鼠n＝6)。
处理18天后，停止处理并每周监测一次FBG再持续6周。完成处理后一周，在联合处理注射的小鼠中FBG水平回归到正常值，并在该水平上一直保持到处理后6周研究结束。相较而言，未处理组的动物在5周后由于疾病加重而死亡。单独用GLP-1处理的小鼠FBG水平直到处理停止后2周才显示出短暂的改善，之后空腹血糖水平进行性增加并类似于在研究结束时未处理的媒介物组中所观察到的水平。
该研究结果如图1所示。
这些结果显示了在短期内GLP-1和胃泌素联合处理糖尿病NOD小鼠，使高血糖恢复正常以有效地治疗糖尿病，并对空腹血糖水平具有延长的效果，表明刺激了β细胞新生和胰岛素产生。
实施例2在急性糖尿病NOD小鼠中联合使用胃泌素(G1)和GLP-1的效果目的NOD小鼠自发形成胰岛素依赖型糖尿病，结果导致了胰腺胰岛β-细胞的自体免疫破坏。该研究目的在于通过在NOD小鼠中使用GLP-1和胃泌素(G1)再生胰岛β-细胞以校正糖尿病。
方法用媒介物(PBS)或联合使用300微克/公斤/天的GLP-1和3微克/公斤/天的胃泌素(G1)，通过腹膜内注射(i.p.)处理12-16周龄的雌性NOD小鼠仅18天。在糖尿病发病后2-5天内，注射动物18天，每天两次。糖尿病发病时空腹血糖(FBG)水平为9-15mM(正常的FBG＜6.0mM)。在处理过程中，每日监测小鼠尿糖水平一次，每周监测FBG水平一次，并在处理停止后再持续6周。测定每组的胰腺胰岛素水平并进行胰腺组织的组织学分析。固定胰腺组织并对胰岛素产生细胞进行染色。通过形态测定分析测定β细胞量。
结果在18天的日常处理后，在联合使用300微克/公斤/天的GLP-1和3微克/公斤/天的G1处理的动物中，空腹血糖为6.1±0.7mM，而在媒介物体处理组中，空腹血糖为24.4±1.5mM。相较而言，单独使用GLP-1处理的动物具有12.5±2.2mM的空腹血糖水平。这些数据表明在控制NOD小鼠葡萄糖水平中，GLP-1和胃泌素联合处理较单独使用GLP-1更有效。
在18天后停止所有的处理并每周监测FBG一次，再持续6周。处理完成后一周，在联合处理注射的小鼠中FBG水平恢复正常(＜6mM)在整个研究过程中保持在该水平上，在处理后6周FBG为4.3±0.2mM。相比之下，GLP-1处理的动物达到了最高血糖水平(超过30mM)并患有糖尿病并发症。在处理后5周由于疾病加重，未处理组动物死亡(图1和图2)。
这些数据表明即使在处理后6周，联合使用GLP-1和胃泌素能有效地恢复正常的血糖水平，而GLP-1处理的动物发展为重症高血糖。
图3显示了非糖尿病动物每个胰腺中具有约10μg的胰岛素，而具有升高的葡萄糖水平的急性糖尿病动物中具有0.5-1.0μg的胰腺胰岛素。这些数据表明NOD小鼠需要少于其10％的胰腺胰岛素来调控葡萄糖水平。糖尿病发病5周后，未处理的动物具有最低水平的胰腺胰岛素，在该阶段动物具有30-32mM的葡萄糖水平并患有糖尿病并发症。GLP-1处理组具有1.0-1.5μg的胰腺胰岛素水平，其高于未处理组动物，暗示在NOD小鼠模型中GLP-1刺激了某些胰岛细胞再生。
令人惊奇地，GLP-1和胃泌素处理的动物每个胰腺具有超过8μg的胰岛素，不仅显著高于GLP-1，而且超过了80％的正常非糖尿病动物的胰腺胰岛素水平。这些研究表明GLP-1和胃泌素联合处理能强效刺激胰岛细胞再生，由此在处理后能在一段长时间内逆转疾病。
GLP-1和胃泌素能恢复糖尿病发病后和处理前所测定的低水平的胰腺胰岛素含量至类似于血糖正常小鼠中所测定的水平。在NOD小鼠中高血糖的校正与胰腺胰岛素含量增加是显著相关的(r＝0.90)，如图4所示。
图5显示了处理前在急性糖尿病NOD小鼠中胰岛素染色的细胞(暗褐色)很少。在未处理组中随时间这些胰岛细胞的数量进一步减少。组织学检查揭示了在GLP-1和胃泌素处理的小鼠中，在胰管附近大的、密度高的胰岛素-染色的胰岛，以及周围为单核白细胞所环绕但不侵入。
在实验过程(8周)中，β细胞量从0.41mg减少到0.01mg，而在用GLP-1和胃泌素处理的动物组中β细胞量增加到1.05mg。已有报道在非糖尿病动物中β细胞量在1.0-1.5mg范围内。甚至当在处理后6周检查时，在NOD小鼠中GLP-1和胃泌素处理显著地增加β细胞量至接近正常水平。
图6显示了在用媒介物、GLP-1和胃泌素处理的NOD小鼠中来自胰管的胰岛细胞的染色。该数据表明在实验过程(8周)中，胰管中胰岛细胞簇的β细胞量从0.06减少到0.01mg，而在GLP-1和胃泌素处理的NOD小鼠中这些簇的β细胞量增加到0.17mg。这些数据表明GLP-1和胃泌素处理在NOD小鼠中诱导了胰岛新生，包括胰管中的胰岛细胞前体。
总之，这些研究表明在NOD小鼠模型中，GLP-1和胃泌素处理诱导了胰岛细胞再生，足以在重量上超过这些疾病模型中正在进行的破坏，在胰腺中产生了网状聚集的胰岛细胞。
结论用GLP-1和胃泌素短期处理糖尿病NOD小鼠，使高血糖恢复正常，并在处理后对空腹血糖水平具有至少6周的延长效果。此外，数据显示GLP-1和胃泌素能刺激胰腺胰岛素水平到约80-90％的正常水平，而单独使用GLP-1仅有不大的效果。
此外，胰腺的组织学分析显示胰岛细胞出现正常并具有大量的胰岛素产生细胞，尽管周围环绕着炎性细胞。胰腺的形态测定分析显示GLP-1和胃泌素处理增加了胰腺中β细胞量，并显示出通过增加胰管中β细胞量以诱导新生的表现。GLP-1和胃泌素处理是胰岛细胞再生的有效诱导物，在NOD小鼠模型中能恢复正常的葡萄糖和胰腺胰岛素水平。
实施例3在新近发作糖尿病的NOD小鼠中PCT/CA03/01778的修饰的胃泌素化合物/缀合物和GLP-1联合阻止糖尿病进展在新近发作糖尿病的NOD小鼠中研究GLP-1和未修饰的胃泌素以及GLP-1和修饰的胃泌素化合物/缀合物联合的处理效果，以确定是否给予GLP-1和胃泌素以阻止新近发作糖尿病的NOD小鼠中重症高血糖并增加胰腺胰岛素含量。要使用的GLP-1是人/小鼠GLP-1的GLP-1生物学活性片段(与加工产生该片段的前体相比，具有7-36位残基；获得自Bachem H6795)。要使用的胃泌素化合物/缀合物是如下化合物B胃泌素—具有17个氨基酸残基并在第15位氨基酸残基处为Leu的合成的人胃泌素I、化合物E胃泌素—具有2-17位氨基酸残基的合成的人胃泌素I、化合物Q胃泌素—具有2-17位氨基酸残基并通过(GA)5(即Gly-Aia-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala)连接有HAS聚合物的合成的人胃泌素I。
监测12-14周龄的非肥胖糖尿病(NOD)雌性小鼠的糖尿病发作进展(空腹血糖＞8.0-15mmol/l)，并在症状发作后48小时内，对四组小鼠分别处理如下一组仅用媒介物处理；另一组给予100微克/公斤/天的GLP-1，剩下的组用GLP-1(100微克/公斤/天)和胃泌素化合物(等价于3微克/公斤/天胃泌素)联合处理，通过腹膜内途径进行每一处理的每日给药。
处理进行14-18天。每周监测动物空腹血糖(FBG)水平一次。在禁食后约12小时并在最后一次肽或媒介物注射后24小时，测定FBG水平。刚一停止处理，就监测所有小鼠的FBG水平，持续再4周(第2-6周)以便确定是否阻止了处理性处理终止后持续的高血糖。在第14天-18天停止处理。
该实验设计包括在6周时对小鼠进行数据取样，以及收集血液用于FBG和血浆C-肽测定，并处死小鼠用于胰腺胰岛素测定和对胰岛炎症(胰岛炎)打分。从处理一开始，小鼠就不再接受胰岛素-置换处理或进行免疫抑制。可评估以下参数生存率、胰腺胰岛素水平、胰岛炎症的存在和空腹血糖水平。
在糖尿病动物中，GLP-1与具有更长半衰期的修饰的胃泌素化合物/缀合物(化合物E或Q)联合使用提供了增强的血糖水平降低作用实施例4使用标准的Fmoc合成技术，产生两种不同的“活性”胃泌素化合物化合物A是修饰的胃泌素-17肽，在N-末端具有额外的Cys；化合物B是修饰的胃泌素-17肽，具有10个额外的交替的甘氨酸和丙氨酸(每种氨基酸各5个)的氨基酸，作为间隔区与N-末端额外的Cys相连。
监测非肥胖糖尿病(NOD)雌性小鼠糖尿病发展(测定的空腹血糖，FBG水平大于6.6mmol/l)，并在糖尿病刚一发病就分成四组。小鼠或用媒介物处理作为对照，或用胃泌素-17，用化合物A，或用化合物B处理(对于所有三种胃泌素处理组，使用相同摩尔浓度的活性成分，即胃泌素)，通过腹膜内注射(i.p.)给药，每日一次持续14天。
可测量确定空腹血糖(FBG)水平和胰腺胰岛素水平。此外，可测量胃泌素的血清半衰期和胃泌素的循环血清水平。
应当预计到的是三个胃泌素处理的组，用化合物A或化合物B处理的NOD小鼠的两个组都维持较高的血清胃泌素循环水平。此外，与未修饰的胃泌素相比，在用化合物A或化合物B处理的小鼠中测定的胃泌素半衰期更长。
此外，也应当预计到的是与用媒介物处理的记录了日益增高的FGB水平的对照组相比，所有三个处理组的动物都减少了FBG水平。与用未修饰的胃泌素处理的动物相比，用化合物A或化合物B处理的动物甚至可具有更低的FBG水平以及增加的胰腺胰岛素水平。
本发明并不限于在此描述的特定实施方案的范围，原因在于这样的实施方案仅旨在单独说明本发明的一个方面，并且任何功能等价的实施方案都落入本发明的范围内。当然，除已在此显示且描述的那些之外，根据前文所述和附图本发明的各种修饰对于本领域技术人员是显而易见的。这样的修饰旨在落入附加的权利要求范围内。
在此提及的所有出版物、专利和专利申请其全文引入作为参考，如同每篇出版物、专利和专利申请被明确并单独标明其全文引入作为参考。在此所有引用的文献并不被承认可用作为本发明的现有技术。
表1
序列表SEQ ID NO.1GLP-1(1-37)His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Aep-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-GlySEQ ID NO.2GLP-1(1-36)His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-ArgSEQ ID NO.3GLP-1(1-36)NH2His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-XaaXaa是NH2SEQ ID NO.4GLP-1(7-37)His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-GlySEQ ID NO.5GLP-1(7-36)His-A1a-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-ArgSEQ ID NO.6GLP-1(7-36)酰胺His-A1a-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-XaaXaa是NH2SEQ ID NO.7E endin-3(Heloderma horridum horridum)Genbank Accession No.P20394hsdgtrtsdl skqmeeeavr ltiewlkngg pssgappe
SEQ ID NO.8Exendin-4(Heloderma suspectum)Genbank Accession No.HWGH4Ghgegtftsdl skqmeeeavr lfiewlkngg pssgapppsSEQ ID NO.9Exendin4(1-31)HGBGTFTSDLSKQMBBAVR LFIBWLKNGGPYSEQ ID NO.10Exendin-4(9-39)DLSKQMBBBAVRLPIBWLKNGGPSSGAPPPSSEQ ID NO.11胃泌素34Xaa-Leu-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Pro-His-Leu-Val-Ala-Asp-Pro-Ser-Lys-Lys-Gln-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-PheXaa＝焦谷氨酸SKQ ID NO.12胃泌素34Xaa-Leu-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Pro-His-Leu-Val-Ala-Asp-Pro-Ser-Lys-Lys-Gln-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Leu-Asp-PheXaa＝焦谷氨酸SEQ ID NO.13胃泌素17Xaa-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-PheXaa＝焦谷氧酸SEQ ID NO.14胃泌素17Xaa-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Leu-Asp-PheXaa＝焦谷氨酸
SEQ ID NO.15胃泌素71mqrlcvyvli falalaafse aswkprsqqp daplgtganr dlelpwleqq gpashhrrqlgpqgpphlva dpskkqgpwl eeeeeaygwm dfgrrsaede nSEQ ID NO.16胃泌素52DLBLPWLEQQ GPASHHRRQL GPQGPPHLVA DPSKKQGPWL BBEEPAYGWM DFSEQ ID NO.17胃泌素14WLBEEERAYGWM DFSEQ ID NO.18胃泌素6YGWM DFSEQ ID NO.19胃泌素6YGWL DFSEQ ID NO.20HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIBWLKNGGXSEQ ID NO.21HX1X2GTFITSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSSEQ ID NO.22HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIBWLKNGGPSSGAPPSKKKKKKSEQ ID NO.23Tyr-Gly-TrP-Met-Aep-PheSEQ ID NO.24Tyr-Gly-Trp-Leu-Asp-Phe
SEQ ID NO.25Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-AlaSEQ ID NO.26TrpMetAspPhe-NH2SEQ ID NO.27TrpLeuAspPhe-NH权利要求
1.一种药物组合物，包含相对于单独使用每种化合物提供了有益效果的GLP-1激动剂和胃泌素化合物以及任选的药学上可接受的载体、赋形剂或媒介物。
2.权利要求1的药物组合物，以一种给药后在受试者中提供持续一段长时间的正常血糖水平的形式存在。
3.任一前述权利要求的药物组合物，包含治疗有效量的GLP-1激动剂和胃泌素化合物，以一种用于长期或短期治疗有需要的受试者的形式存在。
4.权利要求3的药物组合物，其中相对于单独给予每种化合物用于糖尿病治疗的量，所述治疗有效量是最适量以下的。
5.任一前述权利要求的药物组合物，其中选择GLP-1激动剂与胃泌素化合物的比以增加GLP-1激动剂或胃泌素化合物的活性。
6.权利要求1的药物组合物，其中GLP-1激动剂与胃泌素化合物的比为约1∶1-1∶110、1∶1-1∶100、1∶1-1∶75、1∶1-1∶50、1∶1-1∶25、1∶1-1∶10、1∶1-1∶5和1∶1。
7.权利要求1的药物组合物，其中胃泌素化合物与GLP-1激动剂的比为约1∶1-1∶110、1∶1-1∶100、1∶1-1∶75、1∶1-1∶50、1∶1-1∶25、1∶1-1∶10和1∶1-1∶5。
8.任一前述权利要求的药物组合物，其中GLP-1激动剂与治疗有效重量比为约1∶1.5-1∶150、优选1∶2-1∶50的胃泌素化合物联合使用。
9.任一前述权利要求的药物组合物，其中GLP-1激动剂和胃泌素化合物的剂量比治疗状况和/或疾病所需的单独的每种化合物的剂量低至少约1.1-1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。
10.权利要求1的药物组合物，在药学上可接受的赋形剂、载体或媒介物中包含加和量的GLP-1激动剂和胃泌素化合物。
11.权利要求1的药物组合物，在药学上可接受的赋形剂、载体或媒介物中包含协同有效量GLP-1激动剂和胃泌素化合物。
12.权利要求1的药物组合物，包含0.1-20、0.1-30、0.1-40、0.1-50及0.1-60微克/公斤/天的GLP-1激动剂和0.1-20、0.1-30、0.1-40、0.1-50及0.1-60微克/公斤/天的胃泌素化合物。
13.权利要求2的药物组合物，其中所述有益效果是以下的一种或多种缓解或消除胰岛炎症、减缓疾病进展、增加存活率、或减轻疾病或状况的症状。
14.任一前述权利要求的药物组合物，其中所述有益效果是在治疗终止后持续一段长时间的持久的有益效果。
15.权利要求14的药物组合物，其中所述有益效果在治疗后持续至少约2、4、5、6或10周、2-4周、2-8周、2-12周、2-24周、2周-12个月、和2周-18个月。
16.权利要求15的药物组合物，其中所述持久的有益效果可表现为在治疗后增加的C-肽产量、增加的胰腺胰岛素产量和持续一段长时间的接近正常或低血糖水平。
17.任一前述权利要求的药物组合物，其中所述有益效果是胰腺胰岛素水平增加至少约0.5％、1％、2％、5％、10％、15％、20％、30％、33％、35％、40％、45％或50％。
18.任一前述权利要求的药物组合物，其中所述有益效果是血糖水平减少至少约2％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
19.任一前述权利要求的药物组合物，其中所述有益效果是治疗后血糖水平减少至少2、4、6、8或10周、2-4周、2-6周、2-8周、2-12周、2-24周、2周-12个月和2周-18个月的一段时间。
20.任一前述权利要求的药物组合物，其中所述GLP-1激动剂是GLP-1(1-37)、GLP-1(7-36)酰胺、其片段、类似物和衍生物，以及GLP-1的活性代谢物和前药。
21.任一前述权利要求的药物组合物，其中所述GLP-1是SEQIDNO.5的GLP-1(7-36)或SEQ ID NO.14的胃泌素-17(leu)。
22.任一前述权利要求的药物组合物，其中所述GLP-激动剂包含结构式GLP-1(7-R)的亲本多肽，其中R是36、37、38、39、40、41、42、43、44和45，且其中任选地至多5、10或15个氨基酸残基为任意α-氨基酸残基所取代。
23.任一前述权利要求的药物组合物，其中所述GLP-1激动剂是表1所列GLP-1的类似物或衍生物。
24.任一前述权利要求的药物组合物，其中所述胃泌素化合物是胃泌素71[SEQ ID NO.15]、胃泌素52[SEQ ID NO.16]、胃泌素34(大胃泌素)[SEQ ID NO.11或12]、胃泌素17(小胃泌素)[SEQ ID NO.13或14]、胃泌素14[SEQ ID NO.17]、胃泌素8、胃泌素6[SEQ ID NO.18或19]、五肽胃泌素和四肽胃泌素。
25.任一前述权利要求的药物组合物，其中所述胃泌素化合物是结构式Z-Ym-Xn-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6的化合物，其中AA1是Tyr或Phe，AA2是Gly、Ala或Ser，AA3是Trp、Val或Ile，AA4是Met或Leu，AA5是Asp或Glu，以及AA6是Phe或Tyr，其任选地酰胺化；Z是载体，优选是聚合物，更优选是蛋白；Ym是任选的间隔区，包含小的中性氨基酸的m个氨基酸残基，所述小的中性氨基酸包括但不限于丝氨酸和丙氨酸，以及X是SEQ ID NO11或12的残基1-28或SEQ ID NO.13或14的残基1-11的任意连续部分，AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6优选为Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe或Tyr-Gly-Trp-Leu-Asp-Phe。
26.任一前述权利要求的药物组合物，其中所述GLP-1激动剂选自Gly8-GLP-1(7-37)、Val8GLP-1(7-37)、Val8Asp22GLP-1(7-37)、Val8Glu22GLP-1(7-37)、Val8Lys22GLP-1(7-37)、Val8His22GLP-1(7-37)、Arg34Lys26(Ne(g-Glu(Na-十六烷酰)))-GLP-1(7-37)、Gly8-GLP-1(7-36)酰胺、Val8GLP-1(7-36)酰胺、Val8Asp22GLP-1(7-36)酰胺、Val8Glu22GLP-1(7-36)酰胺、Val8Lys22GLP-1(7-36)酰胺和Val8His22GLP-1(7-36)酰胺，以及所述胃泌素化合物是包含SEQ ID NO.11、12，、13、14、17或18的胃泌素。
27.任一前述权利要求的药物组合物，其中所述GLP-1激动剂是Arg34Lys26(Ne(g-Glu(Na-十六烷酰)))-GLP-1(7-37)，以及所述胃泌素化合物是15Leu胃泌素17[SEQ ID NO.14]。
28.权利要求27的药物组合物，其中所述胃泌素化合物缔合于血清蛋白，优选人血清白蛋白。
29.一种制备稳定的GLP-1激动剂药物组合物的方法，包括混合GIP-1激动剂、胃泌素化合物以及药学上可接受的载体、赋形剂或媒介物，所述药学上可接受的载体、赋形剂或媒介物能有效地在物理上稳定GLP-1激动剂并适于提供有益效果，优选持久的有益效果。
30.一种缀合物，包含与胃泌素化合物连接以提供有益效果、特别是持久的有益效果的GLP-1激动剂。
31.权利要求30的缀合物，其中所述GLP-1激动剂选自Gly8-GLP-1(7-37)、Val8GLP-1(7-37)、Val8Asp22GLP-1(7-37)、Val8Glu22GLP-1(7-37)、Val8Lys22GLP-1(7-37)、Val8His22GLP-1(7-37)、Arg34Lys26(Ne(g-Glu(Na-十六烷酰)))-GLP-1(7-37)、Gly8-GLP-1(7-36)酰胺、Val8GLP-1(7-36)酰胺、Val8Asp22GLP-1(7-36)酰胺、Val8Glu22GLP-1(7-36)酰胺、Val8Lys22GLP-1(7-36)酰胺和Val8His22GLP-1(7-36)酰胺，以及所述胃泌素化合物是包含任选地缔合于血清蛋白的SEQ ID NO.11、12，、13、14、17或18的胃泌素。
32.一种治疗或预防受试者中状况和/或疾病的方法，包括给予所述受试者治疗有效量的前述任一权利要求的GLP-1激动剂和胃泌素化合物或组合物或缀合物，以产生持久的有益效果。
33.权利要求32的方法，其中所述持久的有益效果是治疗后血糖水平减少至少2、4、6、8或10周、2-4周、2-6周、2-8周、2-12周、2-24周、2周-12个月和2周-18个月的一段时间。
34.一种治疗方法，包括给予受试者治疗有效量的至少一种GLP-1激动剂并联合给予至少一种胃泌素化合物，刚给予具糖尿状况状的患者就提供了持久的有益效果。
35.权利要求34的方法，其中给予至少一种GLP-1激动剂并联合给予至少一种胃泌素化合物，提供了对至少一种糖尿状况状的持久的有益效果。
36.权利要求34或35的方法，其中在给予受试者前合并治疗有效量的GLP-1激动剂和胃泌素化合物。
37.权利要求34或35的方法，其中将治疗有效量的GLP-1激动剂和胃泌素化合物顺次给予受试者。
38.任一前述权利要求的方法，其中所述治疗有效量的GLP-1激动剂和胃泌素化合物是协同有效量的。
39.一种制备稳定的GLP-1激动剂药物组合物的方法，包括混合GLP-1激动剂、胃泌素化合物和药学上可接受的载体、赋形剂或媒介物，所述药学上可接受的载体、赋形剂或媒介物能有效地在物理上稳定GLP-1激动剂并适于提供有益效果，优选持久的有益效果。
40.一种治疗状况和/或疾病的方法，包括将任一前述权利要求的GLP-1激动剂和胃泌素化合物或组合物或缀合物和大量的细胞给予需要的受试者，由此产生有益效果、优选持久的有益效果。
41.任一前述权利要求的方法，其中所述状况和/或疾病是血脂异常、高血糖、重度低血糖症发作、中风、左心室肥大、心律失常、菌血症、败血症、肠激惹综合征、呼吸窘迫综合征、机能性消化不良、糖尿病、手术后分解代谢改变、应激诱导的高血糖、胃溃疡、心肌梗塞、葡萄糖耐量低减、高血压、阿尔茨海默病和其他中枢及外周神经变性状况、慢性心力衰竭、液体潴留状态、代谢综合征及相关疾病和障碍及肥胖症。
42.权利要求40或41的方法，其中所述状况和/或疾病是糖尿病。
43.一种用于诱导受试者胰岛新生的方法，包括将胰岛前体细胞与足够量的任一前述权利要求的GLP-1激动剂和胃泌素化合物或组合物或缀合物接触，以增加受试者中胰岛前体细胞的增殖，由此诱导胰岛新生。
44.一种用于扩增并分化干细胞为胰岛素分泌细胞的方法，包括将干细胞与有效量的任一前述权利要求的GLP-1激动剂和胃泌素化合物或组合物或缀合物接触。
45.任一前述权利要求的方法，其中所述GLP-1激动剂选自Gly8-GLP-1(7-37)、Val8GLP-1(7-37)、Val8Asp22GLP-1(7-37)、Val8Glu22GLP-1(7-37)、Val8Lys22GLP-1(7-37)、Val8His22GLP-1(7-37)、Arg34Lys26(Ne(g-Glu(Na-十六烷酰)))-GLP-1(7-37)、Gly8-GLP-1(7-36)酰胺、Val8GLP-1(7-36)酰胺、Val8Asp22GLP-1(7-36)酰胺、Val8Glu22GLP-1(7-36)酰胺、Val8Lys22GLP-1(7-36)酰胺和Val8His22GLP-1(7-36)酰胺，以及所述胃泌素化合物是包含任选地缔合于血清蛋白的SEQ ID NO.11、12，、13、14、17或18的胃泌素。
46.任一前述权利要求的方法，其中所述GLP-1激动剂是Arg34Lys26(Ne(g-Glu(Na-十六烷酰)))-GLP-1(7-37)，以及所述胃泌素化合物是15Leu胃泌素17[SEQ ID NO.14]。
47.包含至少一种GLP-1激动剂和至少一种胃泌素化合物的组合的组合物在制备用于治疗状况和/或疾病的药物中的应用。
48.GLP-1激动剂在制造用于与胃泌素化合物联合治疗状况和/或疾病的药物中的应用。
49.权利要求45或46的应用，其中所述GLP-1激动剂选自Gly8-GLP-1(7-37)、Val8GLP-1(7-37)、Val8Asp22GLP-1(7-37)、Val8Glu22GLP-1(7-37)、Val8Lys22GLP-1(7-37)、Val8His22GLP-1(7-37)、Arg34Lys26(Ne(g-Glu(Na-十六烷酰)))-GLP-1(7-37)、Gly8-GLP-1(7-36)酰胺、Val8GLP-1(7-36)酰胺、Val8Asp22GLP-1(7-36)酰胺、Val8Glu22GLP-1(7-36)酰胺、Val8Lys22GLP-1(7-36)酰胺和Val8His22GLP-1(7-36)酰胺，以及所述胃泌素化合物是包含SEQ ID NO.11、12，、13、14、17或18的胃泌素。
50.任一前述权利要求的应用，其中所述GLP-1激动剂是Arg34Lys26(Ne(g-Glu(Na-十六烷酰)))-GLP-1(7-37)，以及所述胃泌素化合物是15Leu胃泌素17[SEQ ID NO.14]。
51.任一前述权利要求的应用，其中所述状况和/或疾病是血脂异常、高血糖、重度低血糖症发作、中风、左心室肥大、心律失常、菌血症、败血症、肠激惹综合征、机能性消化不良、呼吸窘迫综合征、糖尿病、手术后分解代谢改变、应激诱导的高血糖、胃溃疡、心肌梗塞、葡萄糖耐量低减、高血压、阿尔茨海默病和其他中枢及外周神经变性状况、慢性心力衰竭、液体潴留状态、代谢综合征及相关疾病和障碍及肥胖症。
52.任一前述权利要求的组合物或缀合物的试剂盒形式。
全文摘要
本发明涉及用于预防和/或治疗状况和/或疾病的组合物、缀合物和方法，包含治疗有效量的GLP－1激动剂和胃泌素化合物。在预防和/或治疗已证实GLP－1激动剂或胃泌素化合物具有疗效的状况和/或疾病中联合使用GLP－1激动剂和胃泌素化合物提供了有益效果，特别是持久的有益效果，所述状况和/或疾病包括但不限于糖尿病、高血压、慢性心力衰竭、液体潴留状态、肥胖症、代谢综合征和相关疾病及障碍。可选择GLP－1激动剂和胃泌素化合物的组合，以提供出乎意料的加和效应或协同效应。
文档编号A61K38/26GK1938334SQ200580010353
公开日2007年3月28日 申请日期2005年1月28日 优先权日2004年1月30日
发明者A·克鲁茨, A·佩斯特拉克, Y·休 申请人:瓦拉塔药品公司