专利名称：通过下调ldh和pdhk表达降低乳酸水平和增加多肽生产的制作方法
技术领域：
本发明的领域一般地涉及用于在培养细胞中降低乳酸生产和增加多肽生产的方法和组合物。
背景技术：
生物制药市场迅速增长，截止2010年该产业已飙升至700亿美元。参见Genetic Engineering in Livestock New Applications andlnterdisciplinary Perspectives (Engelhard 等人，2009) Springer BerlinHeidelberg。考虑到对治疗性蛋白质的需求增加，和公司之间对市场份额的竞争增加，需要改善技术以实现治疗性蛋白质的更高生产力。针对这一目标，开发了不同的方法，例如宿主细胞改造。参见Kuystermans等人，Cytotechnology 53(1-3) 3~22 (2007);和 O' Callaghan 和 James, Brief Funct.Genomic Proteomic 7(2) :95-110 (2008)。培养的细胞，如中华仓鼠卵巢(CHO)细胞，广泛用于生产治疗性蛋白质。例如，广泛使用PH受控的补料-分批式生物反应器培养来生产重组的单克隆抗体。Langheinrich 和 Nienow, Biotechnol. Bioeng. 66 (3) : 171-9 (1999)。乳酸是在补料-分批式培养中积累的主要废物中的一种，并且表现出抑制细胞生长和蛋白质生产。参见 Glacken 等人，Biotechnol. Bioeng. 32 :491-506 (1988);和 Lao 和 Toth,Biotechnol. Prog. 13 :688-691 (1997)。这反过来导致为了控制pH，需要向培养基中加入的喊的量增加。Dietl 等人，J. Immunol. 184 (3) 1200-9 (2010) ;Langheinrich 和 Nienow,Biotechnol. Bioeng，66 (3) :171-9 (1999)。为了维持pH而增加向细胞培养基中加入的碱可以导致重量摩尔渗透压浓度增加，并且此增加可以导致细胞生长抑制和减少抗体生产力。Cruz 等人，EnzymeMicrob. Technol. 27 (1-2) :43-52(2000) ; Iran 等人，Biotechnol.Bioeng. 66 =238-246 (1999)。因此，对于开发多肽或更高效价的抗体生产工艺而言，降低乳酸水平是理想的。有许多可以影响细胞培养物中的乳酸生产的因素，例如控制丙酮酸水平。参见Liu等人，J. Biol. Chem. ,284(5) :2811-22(2009);和 Samuvel 等人，J. of Immunol. 182(4)2476-84(2009)。丙酮酸是丙酮酸脱氢酶(I3DH)和乳酸脱氢酶(LDH)的底物。PDH复合体是由三种催化酶E1、E2和E3组成的多酶单位。Patel和Korotchkina，Exp. Mol. Med. 33(4) :191-7(2001)。该复合体催化从丙酮酸转化为乙酰-CoA的限速转化反应，该反应是三羧酸(TCA)循环的切入点。PDH的活性受丙酮酸脱氢酶激酶(TOHK)和丙酮酸脱氢酶磷酸酶O3DHP)的调控。I3DHK将PDH磷酸化以抑制它的酶促活性，而I3DHP去磷酸化并因此活化 PDH。参见 Patel 和 Korotchkina，Exp. Mol. Med. 33 (4) :191-7(2001) ;Roche 和Hiromasa, Cell Mol. Life Sci. 64(7-8) :830-49(2007) ;Holness 和 Sugden, BiochemicalSociety Transactions, 31 :1143-1151 (2003)。哺乳动物细胞中有四种具有组织特异性分布的 PDHK 同种型(PDHK1、PDHK2、PDHK3 和 PDHK4)。参见 Harris 等人，Adv. EnzymeRegul. 42 :249-59 (2002);和 Bowker-Kinley 等人，Biochem. J. 329 (I) :191-6 (1998)。LDH直接催化丙酮酸和乳酸的相互转化，以及与此同时的NADH和NAD+的相互转化。在哺乳动物细胞中，LDH表现为大部分由LDHa和LDHb基因编码的A和B亚基(或分别由H和M亚基)组成的同源四聚体或异源四聚体，有时是由LDHc基因编码的C亚基组成的同源四聚体。参见 Baumgart 等人，J. Biol. Chem. 271 (7) :3846-55 (1996) ;Li 等人，J. Biol. Chem. 258(11) :7029-32(1983) ；Skory C. D. , Appl. Environ. Microbiol. 66 (6)2343-8(2000);和 Read 等人，Proteins 43(2) :175-185 (2001)。例如，在 CHO 细胞中，已经显示了 LDH同种型为A3B和A2B2四聚体的中间物。Jeong等人，Biochem. Biophys.Res. Commun. 289 (5) :1141-9 (2001)。之前的研究已经显示，通过同源重组(Chen等人，Biotechnol. Bioeng. 72 (I) :55_61 (2001))、反义技术(Jeong 等人，Biochem. Biophys.·Res. Commun. 289 (5) :1141-9(2001))或小干扰或短干扰 RNA (siRNA) (Kim 和 Lee, Appl.Microbiol. Biotechnol. 74 (I) : 152-9 (2007))破坏基因来下调 CHO 细胞中的 LDHa,可以降低乳酸水平，但未实现蛋白质生产力的可观改善。例如，在LDHa特异性siRNA的情况下，尽管报道乳酸水平降低45-79%，比生产力(Qp)和产品(抗体)效价没有显著的改善，提示在CHO细胞中只敲低LDHa不足以有效改善Qp和产品产量。因此，需要更有效的降低乳酸生产的方法来实现更佳的治疗性多肽生产。本文引用的所有出版物、专利和专利申请出于全部目的都通过引用全文整合到本文中，其与具体和分别指明每个出版物、专利和专利申请都通过引用整合的程度相同。
发明简介本发明提供了用于在培养细胞中降低乳酸生产和增加多肽生产的方法和组合物。本发明人发现在表达多肽(例如，抗体)的培养细胞中，通过siRNA同时下调LDH和TOHK，减少了乳酸水平、乳酸生产速率和重量摩尔渗透压浓度，并增加了比多肽生产力(例如，比生产力)和多肽生产(例如，生产能力)。此外，这些具有下调的LDH和TOHK的培养细胞没有表现出对细胞生长、细胞活力和生产的多肽的品质的负面影响。在一个方面，本发明提供了在培养细胞中降低乳酸生产的方法，方法包括培养表达a)乳酸脱氢酶(LDH)特异性的小干扰RNA(SiRNA)和b)丙酮酸脱氢酶激酶(I3DHK)特异性的siRNA的细胞。在另一个方面，本发明提供了培养的细胞，其包含a) LDH特异性的siRNA和TOHK特异性的siRNA。在一些实施方案中，培养的细胞进一步表达对第二种roHK特异性的siRNA。在一些实施方案中，培养的细胞进一步表达对第三种I3DHK特异性的siRNA。在一些实施方案中，其中培养的细胞进一步表达对第四种I3DHK特异性的siRNA。在另一个方面，本发明提供了在培养细胞中降低乳酸生产的方法，方法包括培养这样的细胞，所述细胞包含编码乳酸脱氢酶(LDH)特异性的小干扰RNA (siRNA)的第一种异源核酸序列和编码丙酮酸脱氢酶激酶(TOHK)特异性的siRNA的第二种异源核酸序列，其中第一种异源核酸序列与第一个启动子有效连接，且其中第二种异源核酸序列与第二个启动子有效连接。在另一个方面，本发明提供了培养的细胞，其包含编码LDH特异性的siRNA的第一种异源核酸序列和编码TOHK特异性的siRNA的第二种异源核酸序列，其中第一种异源核酸序列与第一个启动子有效连接，且其中第二种异源核酸序列与第二个启动子有效连接。在一些实施方案中，细胞还包含编码第二种I3DHK特异性的siRNA的第三种异源核酸序列，且其中第三种异源核酸序列与第三个启动子有效连接。在一些实施方案中，细胞还包含编码第三种TOHK特异性的siRNA的第四种异源核酸序列，且其中第四种异源核酸序列与第四个启动子有效连接。在一些实施方案中，其中细胞还包含包括编码第四种I3DHK特异性的siRNA的第五种异源核酸序列，且其中第五种异源核酸序列与第五个启动子有效连接。在一些实施方案中，LDH是LDHa、LDHb或LDHc。在一些实施方案中，PDHK选自PDHK1、PDHK2、PDHK3和PDHK4。在一些实施方案中，PDHK选自PDHKl、PDHK2和PDHK3。在一些实施方案中，PDHK选自PDHKl和PDHK2。在一些实施方案中，PDHK选自I3DHKl和Η)ΗΚ3。在一些实施方案中，PDHK选自Η)ΗΚ2和Η)ΗΚ3。 在一些实施方案中，在培养的细胞中降低乳酸生产的方法包括培养这样的细胞，所述细胞包含编码乳酸脱氢酶(LDH)特异性的siRNA的第一种异源核酸序列和编码三种对于第一、第二和第三种TOHK特异性的不同siRNA的第二、第三和第四种异源核酸序列，其中第一种异源核酸序列与第一个启动子有效连接，且其中第二、第三和第四异源核酸序列分别与第二个、第三个和第四个启动子有效连接。在一些实施方案中，LDH是LDHa，其中第一种I3DHK是I3DHKl，其中第二种I3DHK是Η)ΗΚ2，且第三种I3DHK是TOHK3。在一些实施方案中，培养的细胞包含编码LDH特异性的siRNA的第一种异源核酸序列和编码三种对于第一、第二和第三种I3DHK特异性的不同siRNA的第二、第三和第四种异源核酸序列，其中第一种异源核酸序列与第一个启动子有效连接，且其中第二、第三和第四种异源核酸序列分别与第二、第三和第四个启动子有效连接。在一些实施方案中，LDH是LDHa，其中第一种I3DHK是I3DHKl，其中第二种I3DHK是Η)ΗΚ2，且其中第三种I3DHK是TOHK3。在一些实施方案中，培养的细胞生产异源多肽。在一些实施方案中，异源多肽是抗体。在一些实施方案中，培养的细胞的乳酸合成速率低于乳酸消耗速率。在一些实施方案中，平均乳酸生产速率少于约负O. 02mg/106细胞/天。在一些实施方案中，含有LDH和TOHK特异性的siRNA的培养细胞具有少于约300m0sm的重量摩尔渗透压浓度。在一些实施方案中，培养的细胞较之没有包含I3DHK和LDH的异源核酸序列的培养的细胞具有高至少约75%的比生产力。在一些实施方案中，培养的细胞较之没有LDH和TOHK特异性的siRNA的培养的细胞具有高至少约75%的比生产力(Qp)。在一些实施方案中，培养的细胞较之没有包含I3DHK和LDH的异源核酸序列的培养的细胞具有高约10%至约800%的多肽生产力(例如，g/L的抗体生产力或效价)。在一些实施方案中，培养的细胞较之没有包含I3DHK和LDH的异源核酸序列的培养的细胞具有高约55%的多肽生产力。在一些实施方案中培养的细胞较之没有包含TOHK和LDH的异源核酸序列的培养的细胞具有高至少约68%的多肽生产力。在一些实施方案中，培养的细胞较之没有I3DHK和LDH特异性的siRNA的培养的细胞具有高约10%至约800%的多肽生产力。在一些实施方案中，培养的细胞较之没有I3DHK和LDH特异性的SiRNA的培养的细胞具有高约55%的多肽生产力。在一些实施方案中，培养的细胞较之没有I3DHK和LDH特异性的siRNA的培养的细胞具有高至少约68%的多肽生产力。在一些实施方案中，培养的细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，培养的细胞是非哺乳动物细胞。在另一个方面，本发明提供了沉默或下调培养细胞中的LDH和TOHK转录的方法，所述方法包括向细胞中导入载体，所述载体包含编码LDH特异性的siRNA的第一种异源核酸序列和编码I3DHK特异性的siRNA的第二种异源核酸序列，其中第一种异源核酸序列与第一个启动子有效连接，且其中第二种异源核酸序列与第二个启动子有效连接，其中表达siRNA,从而沉默或下调LDH和TOHK的基因转录。在另一个方面，本发明提供了制备在培养中表现出减少的乳酸生产的细胞的方 法，所述方法包括向细胞中导入载体，所述载体包含编码LDH特异性的siRNA的第一种异源核酸序列和编码I3DHK特异性的siRNA的第二种异源核酸序列，其中第一种异源核酸序列与第一个启动子有效连接，且其中第二种异源核酸序列与第二个启动子有效连接。在另一个方面，本发明提供了载体，所述载体包含编码乳酸脱氢酶(LDH)特异性的小干扰RNA(siRNA)的第一种异源核酸序列和编码丙酮酸脱氢酶激酶(I3DHK)特异性的siRNA的第二种异源核酸序列，其中第一种异源核酸序列与第一个启动子有效连接，且其中第二异源核酸序列与第二启动子有效连接。
附图
简介图I 显示了靶向 LDHa/PDHKl、2、3 的 siRNA 构建体。将靶向 LDHa、PDHKl、PDHK2 和PDHK3的siRNA克隆到单个pSilencer3. I潮霉素载体中。LDHa的靶向序列处于U6启动子调控下，而Η)ΗΚ1、2和3的siRNA则处于Hl启动子调控下。图2显示了选定的12个siRNA克隆中的LDHa、PDHKK2和3的mRNA相对表达水平(显示为浅灰色)。将LDHa和TOHK的表达水平归一化至持家基因b_微球蛋白。来自12个模拟克隆的平均mRNA表达水平则显示为深灰色。图3显示了在补料-分批摇瓶评价中的乳酸谱、平均乳酸生产速率和第14天的pH值。在14天的摇瓶评价过程中，使用Nova分析仪测量第3、7、10和14天的乳酸浓度。3A)模拟物(深灰色)和siRNA(浅灰色)克隆的乳酸谱；3B)在第3和14天之间的平均乳酸生产速率(mg/106细胞/天)；和3C)第14天的pH值。实施3次补料-分批摇瓶实验，显示来自实验I的数据。图4显示了在补料-分批摇瓶评价中的效价、比生产力(Qp)和细胞生长谱。4A)g/L第14天的效价(生产力)；4B)pg/细胞/天的比生产力；和4C)通过活细胞计数积分(IVCC)测量细胞生长，按I亿个细胞/天/升。模拟克隆是深灰色，siRNA克隆是浅灰色。图5显示了在2L生物反应器评价中的乳酸曲谱、平均乳酸生产速率和重量摩尔渗透压浓度谱。5A)乳酸谱；5B)平均乳酸生产速率；和5C)重量摩尔渗透压浓度谱。图6显示了含有siRNA的培养的细胞、模拟物或亲代克隆在2L生物反应器评测中的生产力谱。发明详述本发明提供了用于在培养的细胞中降低乳酸生产和增加多肽生产的方法和组合物。本发明人发现在表达多肽(例如，抗体)的培养的细胞中，通过被称为RNA干扰(RNAi)的过程，经过siRNA同时下调LDH和Η)ΗΚ，减少了乳酸水平、乳酸生产速率和细胞重量摩尔渗透压浓度，并增加了比多肽生产力(例如，比生产力)和多肽生产(例如，生产力)。此夕卜，这些具有下调的LDH和TOHK的培养的细胞没有表现出对细胞生长、细胞活力和生产的多肽的负面影响。因此，在不受理论约束的条件下，通过敲低LDH的表达减少丙酮酸-乳酸转化，并通过敲低一种或多种TOHK的表达促进丙酮酸进入三羧酸循环(TCA或Krebs循环)，可对乳酸降低并为细胞提供更多的能量和代谢中间物产生协同效应。这些效应反过来导致在培养的细胞中增加的多肽(例如，抗体)生产。因此，在本发明的一个方面，提供了在培养的细胞中降低乳酸生产的方法，所述方法包括培养表达a) LDH特异性的siRNA和b) PDHK特异性的siRNA的细胞。 在另一个方面，提供了培养的细胞，包含a) LDH特异性的siRNA和b)TOHK特异性的 siRNA。在另一个方面，本发明提供了降低培养的细胞中乳酸生产的方法，所述方法包括培养这样的细胞，所述细胞包含编码LDH特异性的siRNA的第一种异源核酸序列和编码TOHK特异性的siRNA的第二种异源核酸序列，其中第一种异源核酸序列与第一个启动子有效连接，而第二种异源核酸序列与第二个启动子有效连接。在另一个方面，本发明提供了培养的细胞，其包含编码LDH特异性的第一种siRNA的第一种异源核酸序列和编码I3DHK特异性的第二种siRNA的第二种异源核酸序列，其中第一种异源核酸序列与第一个启动子有效连接，而第二种异源核酸序列与第二个启动子有效连接。除非另外指出，否则本发明的实践使用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，上述技术都在本领域技术内。文献中已充分解释了此类技术，例如MolecularCloning :A Laboratory Manual,第2版(Sambrook 等 Α 1989)Cold SpringHarbor Press ；01igonucleotide Synthesis(Μ.J. Gait 编著，1984) ；Methodsin Molecular Biology, Humana Press ；Cell Biology ALaboratoryNotebook (J. E. Cellis 编著，1998) Academic Press ；Animal Cell Culture (R.
I.Freshney 编著，1987) ；Introduction to Cell and Tissue Culture(J. P. Mather 和P. E. Roberts,1998)Plenum Press ；Cell and Tissue Culture LaboratoryProcedures(A.Doyle, J. B. Griffiths 和 D. G. Newell 编著，1993-1998)J. Wiley 和 Sons ；Methods inEnzymology(Academic Press, Inc.) ；Handbookof Experimental Immunology(D. M. Weir和 C. C. Blackwell 编著)；GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells(J. M. Miller和 M. P. Calos 编著，1987) ；Current Protocols in Molecular Biology(F. M. Ausubel等人编著，1987) ；PCR The Polymerase Chain Reaction, (Mullis 等人编著，1994)；Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan 等人编著，1991) ；ShortProtocols inMolecular Biology(Wiley 和 Sons,1999) ；Immunobiology(C. A. Janeway 和 P. Travers,1997) ；Antibodies(P. Finch, 1997) ；Antibodies apractical approach(D. Catty.编著，IRL Press,1988-1989) ；Monoclonalantibodies a practical approach(P.Shepherd 和 C.Dean 编著，OxfordUniversity Press,2000) ；Using antibodies alaboratory manual(E. Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；TheAntibodies (M. Zanetti 和 J. D. Capra 编著，Harwood Academic Publishers, 1995)。定义如本文中使用的，术语“培养中的细胞”或“培养的细胞”指在溶液(例如，细胞培养基)中的两个或多个细胞，允许所述细胞进行一次或多次细胞分裂。术语“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换的使用，指任何长度的核苷酸聚合物，并包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基，和/或其类似物，或者任何可以通过DNA或RNA聚合酶整合到聚合物中的底物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸及其类似物。如果存在，可以在聚合物装配之前或 之后进行对核苷酸结构的修饰。可以通过非核苷酸组分中断核苷酸序列。可以在聚合后进一步修饰多核苷酸，例如通过与标记组分缀合。其他类型的修饰包括例如，“帽”，用类似物替换一个或多个天然存在的核苷酸；核苷酸间修饰，例如，具有不带电荷的连接(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯，等)和带电荷的连接(例如，磷硫酰、二硫代磷酸酯等)的修饰；含有悬垂的部分的修饰，例如蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)；具有插入剂的(例如，吖啶、补骨脂素等)修饰；含有螯合剂的(例如，金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)修饰；含有烷化剂的修饰；具有修饰的连接的(例如，α-异头核酸等)修饰；以及未修饰形式的多核苷酸。此外，糖中通常存在的羟基可以被例如膦酸基、磷酸基取代；被标准保护基团保护；或被活化以制备与额外的核苷酸的额外的连接，或者可与固体支持物缀合。5’和3’端OH可以被磷酸化，或者被氨基或从I至20个碳原子的有机加帽基团部分取代。其他羟基也可以衍生为标准保护基团。多核苷酸还可以含有本领域普遍已知的核糖或脱氧核糖的类似物形式，包括例如，2’-0_甲基-、2’-0-烯丙基、2’ -氟-或2’ -叠氮-核糖、碳环糖类似物、ct -异头糖、差向异构糖如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、非环类似物和非碱基核苷酸类似物如甲基核糖核苷。一个或多个磷酸二酯键可以被备选的连接基团取代。这些备选的连接基团包括但不限于磷酸被 P (O)S ( “硫代(thioate)”)、P(S)S( “二硫代(dithioate) ”)、(0) NR2 ( “酰胺”)、P(0)R、P(0)0R’、C0*CH2( “formacetal”)取代的实施方案，其中每个R或R’独立地是H或取代或未取代的烷基(1-20C)，任选地含有醚(-0-)键、芳基、链烯基、环烷基、环烯基或araldyl。多核苷酸中所有的连接不必都相同。上述描述用于本文提及的所有多核苷酸，包括 RNA 和 DNA。术语“RNA干扰(RNAi) ”指通过siRNA介导或起始的序列特异性、转录性基因沉默(例如，转录后基因沉默)的方法。在不受理论约束的情况下，在RNAi的过程中，在实践本发明的方法时，siRNA可以诱导靶mRNA的降解和伴随的序列特异性的LDH和一种或多种PDHK的基因表达抑制。术语“异源核酸”或“异源多肽”指其序列与在相同宿主细胞中天然发现的另一种核酸或多肽的序列不同的核酸或多肽。术语“小干扰RNA”、“短干扰RNA”或“siRNA”指核苷酸的RNA 二聚体，或在一些备选的方面，靶向目标核酸(例如LDH或TOHK)的RNA单分子。siRNA包含通过标准Watson-Crick碱基配对相互作用复性的在一起的有义RNA链和互补的反义RNA链。siRNA可以直接转染或在培养的细胞内生产。在一种变化中，有义RNA链和互补的反义RNA链通过间隔子连接，导致名为短发夹RNA(shRNA)的茎环或发夹结构的表达。然后，发夹被内切核酸酶(例如，切酶)切割，生成siRNA。在另一种变化中，shRNA是由两个茎环结构构成的双功能shRNA，一个茎环结构包括指导RNA 二聚体通过切割依赖性RISC (RNA诱导的沉默复合体)装载进行mRNA降解的完全匹配的序列，第二个茎环结构包括通过经由切割非依赖性RISC装载的mRNA螯合来抑制mRNA翻译的不匹配链。如本文中使用的，LDH或I3DHK “特异性”的siRNA指靶向目标核酸(例如，LDH或PDHK)且siRNA的二聚体部分的核苷酸序列与被靶向的基因(例如，LDH或TOHK)的核苷酸序列互补的siRNA。如本文中使用的，“有效连接的”在本文中指在两个或多个核酸(例如DNA)区段之 间的功能关系。通常地，其指转录调控序列与转录序列的功能关系。例如，如果启动子在恰当的宿主细胞或其他表达系统中刺激或调节编码序列转录，则启动子与编码序列(例如本发明的核酸)有效连接。一般而言，与转录序列有效连接的启动子转录调控序列是与转录序列物理连续的，即，是顺式作用的。然而，一些转录调控序列(例如，增强子)不需要与其增强转录的编码序列是物理连续的或位于其紧密相邻处。如本文中所用，术语“启动子”包括能够在培养的细胞(例如，哺乳动物细胞)中驱动编码序列转录的所有序列。因此，用于本发明的构建体中的启动子包括参与调控或调节基因(例如，LDH或TOHK)转录定时和/或速率的顺式作用的转录控制元件和调控序列。例如，启动子可以是顺式作用的转录控制元件，包括参与转录调控的增强子、启动子、转录终止子、复制起点、染色体整合序列、5'和3’非翻译区或内含子序列。这些顺式作用序列通常与蛋白质或其他生物分子相互作用来进行(开/关、调控、调节等)转录。“组成型”启动子是在大部分环境条件和发育或细胞分化的状态下持续驱动表达的启动子。“可诱导型”或“可调控型”启动子在环境条件或发育条件的影响下指导本发明核酸的表达。可通过可诱导型启动子影响转录的环境条件的实例包括厌氧条件、升高的温度、干旱或光的存在。如本文中使用的，“载体”意指能够在宿主细胞在递送，优选地表达一种或多种目标基因或序列(例如，LDHa或TOHK)的构建体。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸露的DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子凝聚剂缔合的DNA或RNA表达载体、包裹在脂质体中的DNA或RNA表达载体，和某些真核细胞，例如生产细胞。合适的载体是与所使用的宿主细胞相容的载体。合适的载体可以源自例如细菌、病毒(例如噬菌体T7或M-13来源的噬菌体)、粘粒、酵母或植物。获得和使用此类载体的流程是本领域技术人员已知的(参见例如，Sambrook 等人，Molecular Cloning A Laboratory Manual,第 2版，ColdSpring Harbor, 1989)。如本文中使用的，以mg/细胞/天将平均乳酸生产速率计算为乳酸合成速率减去乳酸消耗速率。如本文中使用的，“比生产力”或“Qp”指按pg/细胞/天的比蛋白质(例如抗体)生产速率。比生产力计算为蛋白质效价(pg/细胞/天)/IVCC(计算活细胞计数积分；细胞
/天)°术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换的使用，指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是线性的或分支的，可以包含修饰的氨基酸，并可以被非氨基酸中断。术语还涵盖了被天然修饰的或干涉的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他的操作或修饰，例如与标记组分缀合。定义还包括例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)的多肽，以及本领域已知的其他修饰。术语“抗体”使用最广泛的含义，具体覆盖了单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段。“抗体片段”包含全长抗体的部分，一般是其抗原结合部分或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；单链抗体分子；双抗体；线性抗体；和从抗体片段形成的多特异性抗体。术语“单克隆抗体”在本文中指从基本均质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能以少量存在的天然发生的突变外，包含群体的单个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制品相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”表 示从基本均质的抗体群体获得的抗体的特征，而不视为需要通过任何特定方法生产抗体。例如，可通过Kohler等人，Nature 256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法，或者通过重组DNA方法(参见例如美国专利号4，816，567)制备根据本发明使用的单克隆抗体。还可以使用例如 Clackson 等人，Nature352 :624-628 (1991)和 Marks 等人，J. Mol. Biol. 222 581-597 (1991)中描述的技术，从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。本文的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的部分与源自特别物种或属于特别抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与源自另一种物种或属于另一种抗体类或亚类的抗体以及此类抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们表现出所需的生物学活性(美国专利号4，816，567 JPMorrison等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851-6855 (1984))。术语“高变区”在本文中指负责抗原结合抗体的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即，轻链可变结构域的残基24-34 (LI)、50-56 (L2)和89-97 (L3)，和重链可变结构域的残基 31-35 (HI)、50-65(H2)和 95-102 (H3) ；Kabat 等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest,第 5版，Public Health Service,National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))和 / 或来自“高变环”的残基(即，轻链可变结构域的残基26-32 (LI)、50-52(L2)和91-96 (L3)，和重链可变结构域的残基26-32 (HI)、53-55(H2)和 96-101 (H3) ;Chothia和 Lesk J. Mol. Biol. 196 :901-917 (1987))。“框架区”或“FR”残基是除本文定义的高变区残基外的可变结构域残基。非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。人源化抗体的绝大部分是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的高变区残基被具有所需特异性、亲和力和能力的来自非人物种(例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类)(供体抗体)的高变区残基取代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基取代。此外，人源化的抗体可包含未见于受体抗体和供体抗体中的残基。进行这些修饰以进一步精制抗体性能。一般而言，人源化抗体基本包含全部的至少一个，通常两个可变结构域，其中所有的或基本所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，而所有的或基本所有的FR区是人免疫球蛋白的序列。人源化抗体任选地还包含免疫球蛋白恒定区(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。其他细节参见Jones等人，Nature 321 :522-525(1986) ；Riechmann 等人，Nature 332 :323-329(1988)；和 Presta,Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596(1992)。如本文中使用的，术语“免疫粘附素”指结合异源“粘附素”蛋白(例如，受体、配体或酶)的“结合结构域”的抗体样分子，具有免疫球蛋白恒定结构域的效应子功能。在结构上，免疫粘附素包含除抗体的抗原识别和结合位点(抗原结合位点)以外的(即，异源的)、具有理想结合特异性的粘附素氨基酸序列和免疫球蛋白恒定结构域序列的融合体。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定结构域序列优选地源自Yl、Y2或Y4重链，因为，包含这些区域的免疫粘附素可以被蛋白A层析纯化(Lindmark等人，J. Immunol. Meth. 62 :1-13(1983))。术语“配体结合结构域”在本文中指任何天然的细胞表面受体，或其至少保留了相应天然受体的定性配体结合的任何区域或衍生物。在特定的实施方案中，受体来自具有胞外结构域的细胞表面多肽，所述受体与免疫球蛋白超家族的成员是同源的。其他不是免疫球蛋白超家族成员，但仍涵盖在该定义内的受体是细胞因子受体，特别是具有酪氨酸激酶 活性的受体(受体酪氨酸激酶)、血细胞生成素和神经生长因子受体超家族的成员，和细胞粘附素分子，例如，(E-、L-和P-)选择素。术语“受体结合结构域”用于指受体的任何天然配体，包括细胞粘附素分子，或至少保留了相应天然配体的定性受体结合能力的此类天然配体的任何区域或衍生物。其中，该定义具体包括来自上述受体的配体的结合序列。“抗体-免疫粘附素嵌合物”包含这样的分子，所述分子结合至少抗体的至少一个结合结构域(如本文定义的)和至少一个免疫粘附素(如本申请中定义的)。示例性的抗体-免疫粘附素嵌合物是双特异性的⑶4-IgG嵌合物，描述在Berg等人，PNAS (USA) 88 4723-4727(1991)和 Chamow 等人，J. Immunol. 153 :4268(1994)中。术语“重量摩尔渗透压浓度”指溶解在I升溶液中的溶质颗粒的数量。可以添加到培养基中从而增加其重量摩尔渗透压浓度的溶质包括蛋白质、肽、氨基酸、非代谢的聚合物、维生素、离子、盐(例如钠盐或钾盐)、糖、代谢物、有机酸、脂类等。当用于本文中时，缩写“mOsm”意指“毫摩尔渗透压/升H20”。如本文中使用的，“宿主细胞”包括单个细胞、培养的细胞或细胞培养物，其可以是或者已经是用于掺入多核苷酸插入物来生产多肽的载体或siRNA的受体。宿主细胞包括单个培养的细胞的后代，并且由于天然的、偶然的或人为的突变，后代不必与原始的亲代细胞完全相同(形态学或基因组DNA互补)。除非另外明确指出，则本文中使用的术语单数形式“a”、“a”等指一个或多个。在本文中，提及“约”某值或参数包括(和描述了)针对所述值或参数的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括描述了 “X”。数值范围包括了定义范围的数。应理解，当本文使用词语“包含”描述实施方式时，也提供了以“由......组成”和
/或“基本由......组成”描述的其他类似的实施方式。当本发明的方面或实施方式以Markush组或其他备选组进行描述时，本发明不仅涵盖了作为整体列举的整个组，也涵盖了单个组和主要组的所有可能亚组的每个成员，以及缺少一个或多个组成员的主要组。本发明在要求保护的发明中还设想了明确排除一个或多个任意组成员。降低乳酸生产的方法本文中的方法涉及培养表达LDH和至少一种或多种I3DHK特异性的siRNA的细胞以经由RNA干扰(RNAi)降低乳酸生产。在一个方面，方法包括培养表达a) LDH特异性的siRNA和b)H)HK特异性的siRNA的细胞。在一些实施方案中，培养的细胞进一步表达对第二种I3DHK特异性的siRNA。在一些实施方案中，培养的细胞进一步表达对第三种I3DHK特异性的siRNA。在一些实施方案中，培养的细胞进一步表达对第四种I3DHK特异性的siRNA。在另一个方面，方法包含编码LDH特异性的siRNA的第一种异源核酸序列和编码roHK特异性的第二种异源核酸序列，其中第一种异源核酸序列与第一个启动子有效连接，且其中第二种异源核酸序列与第二个启动子有效连接。在另一个方面，提供了沉默或下调培养的细胞中的LDH和TOHK转录的方法，所述·方法包括向细胞中导入载体，所述载体包含编码LDH特异性的siRNA的第一种异源核酸序列和编码TOHK特异性的siRNA的第二种异源核酸序列，其中第一种异源核酸序列与第一个启动子有效连接，且其中第二种异源核酸序列与第二个启动子有效连接，其中表达siRNA，从而沉默或下调LDH和TOHK的基因转录。在一些实施方案中，培养的细胞进一步包含编码第二种I3DHK特异性的siRNA的第三种异源核酸序列，且其中第三种异源核酸序列与第三个启动子有效连接。在一些实施方案中，培养的细胞进一步包含编码第三种I3DHK特异性的siRNA的第四种异源核酸序列，且其中第四种异源核酸序列与第四个启动子有效连接。在一些实施方案中，培养的细胞进一步包括编码第四种roHK特异性的SiRNA的第五种异源核酸序列，且其中第五种异源核酸序列与第五个启动子有效连接。在一些实施方案中，LDH是LDHa、LDHb或LDHc。在一些实施方案中，I3DHK选自PDHKl、PDHK2、PDHK3 和 PDHK4。在一些实施方案中，PDHK 选自 PDHKl、PDHK2 和 PDHK3。在一些实施方案中，PDHK选自Η)ΗΚ2、Η)ΗΚ3和TOHK4。在一些实施方案中，PDHK选自TOHKl、PDHK3和TOHK4。在一些实施方案中，PDHK选自TOHKl和TOHK2。在一些实施方案中，PDHK选自I3DHKl和TOHK3。在一些实施方案中，PDHK选自TOHK2和TOHK3。在一些实施方案中，PDHK选自PDHK2和PDHK4。在一些实施方案中，PDHK选自PDHK3和PDHK4。在一些实施方案中，方法包括培养表达a)LDHa特异性的siRNA和b)分别对PDHKU PDHK2和TOHK3特异性的siRNA的细胞。在一些实施方案中，方法包括培养表达a)LDHb特异性的siRNA和b)分别对Η)ΗΚ1、Η)ΗΚ2和TOHK3特异性的siRNA的细胞。在一些实施方案中，方法包括培养表达a) LDHc特异性的siRNA和b)分别对TOHKl JDHK2和TOHK3特异性的siRNA的细胞。在一些实施方案中，方法包括培养表达a)对LDHa、LDHb或LDHc特异性的siRNA和b)对两种I3DHK特异性的SiRNA的细胞，其中I3DHK选自TOHKl、TOHK2、PDHK3和Η)ΗΚ4。例如，方法包括培养表达a) LDHa特异性的siRNA和b)分别对TOHKl和TOHK2特异性的siRNA的细胞。在一些实施方案中，较之没有LDH和TOHK特异性的siRNA的培养的细胞，在表达a)LDH特异性的siRNA和b)H)HK特异性的siRNA的培养的细胞中，LDH的mRNA表达水平降低至少约75%，而TOHK的mRNA表达水平降低至少约25%。在一些实施方案中，LDH是LDHa、LDHb或LDHc，并且LDH的mRNA表达水平降低至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90 %或至少约95 %。在一些实施方案中，PDHK是PDHKl、PDHK2或PDHK3，而PDHK的mRNA表达水平降低至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50 %、至少约55 %、至少约60 %、至少约65 %、至少约70 %、至少约75 %、至少约80 %、至少约85%、至少约90%或至少约95%。在一些实施方案中，较之没有LDHa、PDHKl、roHK2和TOHK3特异性的siRNA的培养的细胞，在表达a) LDHa特异性的siRNA和b) PDHKUPDHK2和TOHK3特异性的siRNA的培养的细胞中，LDHa的mRNA表达水平降低至少约90%，而I3DHKl、PDHK2和Η)ΗΚ3的mRNA表达水平分别降低至少约32%、83%和70%。在一些实施方案中，方法包含编码LDHa、LDHb或LDHc特异性的siRNA的第一种·异源核酸序列，编码I3DHKl特异性的siRNA的第二种异源核酸序列，编码对TOHK2特异性的siRNA的第三种异源核酸序列，编码对TOHK3特异性的siRNA的第四种异源核酸序列，其中第一种异源核酸序列与第一个启动子有效连接，且其中第二、第三和第四异源核酸序列与第二个启动子有效连接。在一些实施方案中，方法包含编码LDHa、LDHb或LDHc特异性的siRNA的第一种异源核酸序列，编码I3DHK特异性的siRNA的第二种异源核酸序列，和编码对TOHK特异性的siRNA的第三种异源核酸序列，其中第一种异源核酸序列与第一个启动子有效连接，其中第二和第三种异源核酸序列与第二个启动子有效连接，且其中TOHK选自TOHKl、Η)ΗΚ2、Η)ΗΚ3和 PDHK4。在一些实施方案中，较之没有包含LDH和TOHK的异源核酸序列的培养的细胞，在包含编码LDH特异性的siRNA的第一种异源核酸序列和编码I3DHK特异性的siRNA的第二种异源核酸序列的培养细胞中，LDH的mRNA表达水平降低至少约75%，而TOHK的mRNA表达水平降低至少约25%，其中第一种异源核酸序列与第一个启动子有效连接，而其中第二种异源核酸序列与第二个启动子有效连接。在一些实施方案中，LDH是LDHa、LDHb或LDHc，并且LDH的mRNA表达水平降低至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%或至少约95 %。在一些实施方案中，PDHK是PDHKl、PDHK2或PDHK3，并且PDHK的mRNA表达水平降低至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55 %、至少约60 %、至少约65 %、至少约70 %、至少约75 %、至少约80 %、至少约85 %、至少约90 %或至少约95 %。在一些实施方案中，较之没有LDHa、PDHKU PDHK2和TOHK3特异性的siRNA的培养的细胞，在包含编码LDHa特异性的siRNA的第一种异源核酸序列，编码I3DHKl特异性的siRNA的第二种异源核酸序列，编码TOHK2特异性的siRNA的第三种异源核酸序列，和编码PDHK3特异性的siRNA的第四种异源核酸序列，其中第一种异源核酸序列与第一个启动子有效连接，而其中第二、第三和第四种异源核酸序列与第二个启动子有效连接的培养的细胞中，LDHa的mRNA表达水平降低至少约90%，而TOHKl、PDHK2和TOHK3的mRNA表达水平分别降低至少约32%、83%和70%。本文描述的本发明中使用的siRNA可以从多种来源获得或制备，例如，在体外、离体或体内生产，如本文所述。在一些实施方案中，siRNA可以含有从约I至约200个核苷酸，从约5至约100个核苷酸，从约10至约50个核苷酸，从约15至约30个核苷酸，或从约19至约25个核苷酸。在一些实施方案中，siRNA的长度少于30个核苷酸。在一些实施方案中，siRNA的长度多于30个核苷酸。在一些实施方案中，siRNA长度可以是40、39、38、37、
36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、
11、10、9或更少的核苷酸。在一些实施方案中，可以通过化学合成，通过使用聚合酶体外转录，或通过内切核酸酶(例如，切酶)消化长双链RNA(dsRNA)生成siRNA。在一些实施方案中，siRNA可以完全或部分的包含合成核苷酸、天然碱基或修饰的碱基。在一些实施方案中，siRNA可以在胞外表达。siRNA可以由核酸序列编码，而核酸序列还可以包括一个或多个启动子。核酸序列还可以包括多聚腺苷酸信号。在一些实施方案中，RNA 二聚体和有义链和反义链可以由两个独立的启动子生产，并由培养的细胞复性。在一些实施方案中，还可以通过碱基对间隔子(例如，碱基对间隔子可包含单个或多个碱基对)或茎环连接RNA 二聚体的有义链和反义链以形成shRNA，并由单个启动子表达。在 一些实施方案中，shRNA可以是双功能shRNA。可以通过内切核酸酶(例如，切酶)切割发夹，以生成有效的siRNA分子。间隔子或茎环位于形成二聚体的有义链和反义链之间。茎环结构的长度可以变化。在一些实施方案中，茎环的长度是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14或15或更多个核苷酸。发夹结构还可以含有3'或5'突出端部分。在一些实施方案中，突出端是3'或5'突出端1、2、3、4或5个核苷酸长。通过siRNA、shRNA或双功能shRNA进行RNA介导的基因调控的组合物和方法描述在例如美国申请号20090215860，Rutz和 Scheffold, Arthritis Research & Therapy, 6 (2) :78-85(2004)和 Rao 等人，AdvancedDrugDelivery Reviews 61 :746-759 (2009)中。在一些实施方案中，用于本发明中的siRNA可以与靶序列具有完美的同源性，以生产靶特异性应答。在一些实施方案中，用于本发明中的siRNA与靶序列具有约99%、98%,97%,96%,95%,94%,92%,91 %,90%,88%,86%,84%,82%,80%,78%,76%,74%、72%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或5%同源性的任一项。在一个变化中，用于本发明中的siRNA可以在生理条件下与核酸靶序列杂交，例如，可以在细胞内(例如，在体内)与靶序列特异性杂交。在另一个变化中，siRNA靶向多于一个的靶序列、靶标志物或报告基因。可以在常规筛选条件下，例如细胞培养等，测试SiRNA在体内靶向靶核酸(例如，在生理条件下，在细胞内siRNA与靶序列特异性结合)所必需的序列同一性(同源性)的程度。在一些实施方案中，PDHKl的靶序列是 GCAGTTCCTGGACTTCGGA (SEQ ID NO 2)。在一些实施方案中，PDHK2的靶序列是CATTCAGTACTTCTTGGAC(SEQ ID NO :3)。在一些实施方案中，PDHK3 的靶序列是 TGTAGCTGATGTCGTGAAA (SEQ ID NO 4)。乳酸脱氢酶(LDH)将丙酮酸转化为乳酸。示例性的LDH(例如，LDHa、LDHb或LDHc)多肽和核酸的检录号包括但不限于DQ912661 (CH0细胞中的LDHa)、BC067223 (人LDHa)、BC084698(大鼠 LDHa)、BC094428 (小鼠 LDHa)、BC002362 (人LDHb)、NM_012595 (大鼠 LDHb)、NM_008492 (小鼠 LDHb)、BC090043 (人 LDHc)、NM_017266 (大鼠 LDHc)和 NM_013580 (小鼠LDHc)。通过测量在体外、在细胞提取物中或在体内多肽将丙酮酸转化为乳酸的能力，本领域技术人员已知的标准方法可用于确定LDH多肽是否具有LDH活性。
丙酮酸脱氢酶激酶(PDHK)抑制丙酮酸转化为こ酰-CoA。示例性的I3DHKl多肽和核酸的检录号包括但不限于L42450(人)、BC089783(大鼠)和NM_172665(小鼠)。示例性的Η)ΗΚ2多肽和核酸的检录号包括但不限于NM_002611 (人)、NM_030872 (大鼠)和NM_133667(小鼠)。示例性的Η)ΗΚ3多肽和核酸的检录号包括但不限于L42452 (人)、BC169078 (大鼠)和ΝΜ_145630 (小鼠)。示例性的Η)ΗΚ4多肽和核酸的检录号包括但不限于ΝΜ_002612(人)、ΝΜ_053551 (大鼠)和ΝΜ_013743 (小鼠)。通过在体外、在细胞提取物中或在体内測量多肽将丙酮酸转化为こ酰-CoA的能力，本领域技术人员已知的标准方法可用于确定I3DHK多肽是否具有TOHK活性。启动子是本领域普遍已知的。可以使用在宿主细胞中有功能的任何启动子，用于在宿主细胞中表达LDH和ー种或多种I3DHK特异性的siRNA。实际上，能够驱动这些siRNA的任何启动子都适合本发明，包括但不限于U6、HU CYCU HIS3、GALU GAL4、GALlO, ADHUPGK、PH05、GAPDH、T7、CMV、SV40和EFla。例如，在一些实施方案中，方法包含编码LDHa特 异性的siRNA的第一种异源核酸序列，编码I3DHKl特异性的siRNA的第二种异源核酸序列，编码TOHK2特异性的siRNA的第三种异源核酸序列，编码Η)ΗΚ3特异性的siRNA的第四种异源核酸序列，其中第一种异源核酸序列与第一个启动子U6有效连接，且其中第二、第三和第四种异源核酸序列与第二个启动子Hl有效连接。在一个变化中，编码siRNA的第一种异源核酸序列是LDHb特异性的。在另ー个变化中，编码siRNA的第一种异源核酸序列是LDHc特异性的。在另ー个方面，提供了制备在培养中表现出减少的乳酸生产的细胞的方法，所述方法包括向细胞中导入载体，所述载体包含编码LDH特异性的siRNA的第一种异源核酸序列和编码TOHK特异性的siRNA的第二种异源核酸序列，其中第一种异源核酸序列与第一个启动子有效连接，且其中第二种异源核酸序列与第二个启动子有效连接。可以通过多种程序将编码LDH特异性的siRNA的第一种异源核酸序列和编码I3DHK特异性的siRNA的第二种异源核酸序列插入到载体中。例如，在用恰当的限制性内切酶(例如，KasI、BamHI、HindIII或BhIII)消化插入片段和载体后，将LDH和I3DHK siRNA序列连接到载体中的理想的位置。在一些实施方案中，通过将LDHa siRNA序列插入到载体(例如，pSilencer 3. I-Hl hygro载体)的KasI位点中并在其紧邻(i_ediate)5’端加入U6启动子，分别将I3DHKl和TOHK2 siRNA序列插入到BamHI/Hindlll和HindIII位点中，并将PDHK3 siRNA序列插入到BgIII中并在Η)ΗΚ1、Η)ΗΚ2和TOHK3的紧邻5’端加入Hl启动子，构建含有LDHa和Η)ΗΚ1、Η)ΗΚ2和TOHK3特异性的siRNA序列的载体。然后，可以通过转染含有LDHa和TOHKl、PDHK2和H)HK3siRNA的载体，来生成表达减少的乳酸生产的培养的细胞。
组合物本发明还提供了通过本文描述的方法生产的培养的细胞。可以在体内、离体或体外实践本发明的组合物。在ー个方面，提供了表达a) LDH特异性的siRNA和b) TOHK特异性的siRNA的培养中的细胞。在一些实施方案中，培养的细胞进ー步表达第二种TOHK特异性的siRNA。在一些实施方案中，培养的细胞进ー步表达第三种I3DHK特异性的siRNA。在一些实施方案中，培养的细胞进ー步表达第四种I3DHK特异性的siRNA。在一些实施方案中，培养中的细胞表达a)LDHa特异性的siRNA和b)分别对PDHKUPDHK2和TOHK3特异性的siRNA。在一些实施方案中，培养中的细胞表达a) LDHb特异性的siRNA和b)分别对Η)ΗΚ1、Η)ΗΚ2和TOHK3特异性的siRNA。在一些实施方案中，培养中的细胞表达a) LDHc特异性的siRNA和b)分别对TOHKl、Η)ΗΚ2和TOHK3特异性的siRNA。在一些实施方案中，培养中的细胞表达a) LDHa特异性的siRNA和b)对两种TOHK特异性的siRNA，其中TOHK选自roHKl、PDHK2, PDHK3和TOHK4。在一些实施方案中，培养中的细胞表达a) LDHb特异性的siRNA和b)对两种TOHK特异性的siRNA，其中TOHK选自PDHKU PDHK2, PDHK3和TOHK4。在一些实施方案中，培养中的细胞表达a)LDHc特异性的siRNA 和 b)对两种 PDHK 特异性的 siRNA，其中 PDHK 选自 PDHK1、PDHK2、PDHK3 和 PDHK4。在另ー个方面，提供了培养中的细胞，其包含编码LDH特异性的siRNA的第一种异源核酸序列和编码TOHK特异性的siRNA的第二种异源核酸序列，其中第一种异源核酸序列与第一个启动子有效连接，且其中第二种异源核酸序列与第二个启动子有效连接。在一些实施方案中，细胞进一歩包含编码第二种I3DHK特异性的siRNA的第三种异源核酸序列，且其中第三在异源核酸序列与第三个启动子有效连接。在一些实施方案中，细胞进ー步包含编码第三种TOHK特异性的siRNA的第四种异源核酸序列，且其中第四种异源核酸序列与 第四个启动子有效连接。在一些实施方案中，细胞进一歩包含编码第四种I3DHK特异性的siRNA的第五种异源核酸序列，且其中第五异源核酸序列与第五个启动子有效连接。在一些实施方案中，培养中的细胞包含编码LDHa特异性的siRNA的第一种异源核酸序列，编码I3DHKl特异性的siRNA的第二种异源核酸序列，编码Η)ΗΚ2特异性的siRNA的第三种异源核酸序列，和编码TOHK3特异性的siRNA的第四异源核酸序列，其中第一种异源核酸序列与第一个启动子(例如，U6)有效连接，而其中第二、第三和第四种异源核酸序列与第二个启动子(例如，Hl)有效连接。在一个变化中，编码siRNA的第一种异源核酸序列是LDHb特异性的。在一个变化中，编码siRNA的第一种异源核酸序列是LDHb特异性的。在一些实施方案中，培养中的细胞包含编码LDHa特异性的siRNA的第一种异源核酸序列，编码I3DHK特异性的siRNA的第二种异源核酸序列，编码I3DHK特异性的siRNA的第三种异源核酸序列，其中I3DHK选自TOHKl、PDHK2, PDHK3和Η)ΗΚ4，其中第一种异源核酸序列与第一个启动子(例如，U6)有效连接，而其中第二和第三种异源核酸序列与第二个启动子(例如，Hl)有效连接。在一个变化中，编码siRNA的第一种异源核酸序列是LDHb特异性的。在一个变化中，编码siRNA的第一种异源核酸序列是LDHc特异性的。在一些实施方案中，细胞培养物包括至少约5、10、15、20、50、75、100、200、500、750,1, 000,5, 000,7, 500,10, 000,15, 000 或更多个细胞。在另ー个方面，提供了具有低于乳酸消耗速率的乳酸合成速率的培养物中的细胞。在一些实施方案中，培养中的细胞具有少于约负O. 2mg/106细胞/天、负O. lmg/106细胞/天、负O. 08mg/IO6细胞/天、负O. 06mg/IO6细胞/天、负O. 04mg/IO6细胞/天、负O. 02mg/106 细胞 / 天、负 O. 01mg/106 细胞 / 天、负 O. 008mg/106 细胞 / 天、负 O. 006mg/106 细胞/天、负O. 004mg/106细胞/天或负O. 002mg/106细胞/天的平均乳酸生产速率。在一些实施方案中，培养中的细胞包含编码LDHa特异性的siRNA的第一种异源核酸序列，编码I3DHKl特异性的siRNA的第二种异源核酸序列，编码Η)ΗΚ2特异性的siRNA的第三种异源核酸序列，和编码Η)ΗΚ3特异性的siRNA的第四种异源核酸序列，其中第一种异源核酸序列与第一个启动子(例如，U6)有效连接，而其中第二、第三和第四种异源核酸序列与第二个启动子(例如，Hl)有效连接，且其中培养中的细胞具有约负O. 02mg/106细胞/天的平均乳酸生产速率。在另ー个方面，提供了含有LDH和TOHK特异性的siRNA的培养中的细胞，所述细胞具有减少的重量摩尔渗透压浓度。在一些实施方案中，含有LDH和TOHK特异性的siRNA的培养中的细胞具有少于约 500m0sm、450m0sm、400m0sm 350m0sm> 300m0sm> 250m0sm>200m0sm或150m0sm中任ー项的重量摩尔渗透压浓度。在一些实施方案中，培养中的细胞包含编码LDHa特异性的siRNA的第一种异源核酸序列，编码I3DHKl特异性的siRNA的第二种异源核酸序列，编码Η)ΗΚ2特异性的siRNA的第三种异源核酸序列，和编码Η)ΗΚ3特异性的siRNA的第四种异源核酸序列，其中第一种异源核酸序列与第一个启动子(例如，U6)有效连接，而其中第二、第三和第四种异源核酸序列与第二个启动子(例如，Hl)有效连接，且其中培养中的细胞具有约300m0sm的重量摩尔 渗透压浓度。在另ー个方面，提供了具有增加的比生产カ(Qp)的培养中的细胞。在一些实施方案中，培养的细胞具有较之没有包含I3DHK和LDH的异源核酸序列的培养的细胞高至少约60%、高至少约65%、高至少约70%、高至少约75%、高至少约80%、高至少约85%、高至少约90%或高至少约95%的比生产カ。在一些实施方案中，培养的细胞具有较之没有包含TOHK和LDH的异源核酸序列的培养的细胞高约67 %、高约69 %、高约71 %、高约72 %、闻约73*%、闻约74*%、闻约75*%、闻约76*%、闻约77*%、闻约78*%、闻约79*%、闻约81%、闻约83 *%、闻约85 *%、闻约87 *%、闻约89 *%、闻约91 *%、闻约93 *%、闻约95 *%、闻约97 或闻约99%的比生产力。在一些实施方案中，培养中的细胞包含编码LDHa特异性的siRNA的第一种异源核酸序列，编码I3DHKl特异性的siRNA的第二种异源核酸序列，编码Η)ΗΚ2特异性的siRNA的第三种异源核酸序列，和编码Η)ΗΚ3特异性的siRNA的第四种异源核酸序列，其中第一种异源核酸序列与第一个启动子(例如，U6)有效连接，而其中第二、第三和第四种异源核酸序列与第二个启动子(例如，Hl)有效连接，且其中培养中的细胞具有约75%更高的比生产力。在另ー个方面，提供了通过本文中的方法生产的培养的细胞，所述细胞具有增加的多肽生产力(例如，抗体生产カ或效价，按g/L)。在一些实施方案中，培养的细胞具有较之没有包含I3DHK和LDH的异源核酸序列的培养细胞高至少约10%至约800%的多肽生产力。在一些实施方案中，培养的细胞具有较之没有包含I3DHK和LDH的异源核酸序列的培养细胞高约10%、高约15%、高约20%、高约25%、高约30%、高约35%、高约40%、高约45*%、闻约50*%、闻约55*%、闻约58*%、闻约60*%、闻约65*%、闻约70*%、闻约71*%、闻约75 *%、闻约80 *%、闻约85 *%、闻约90 *%、闻约95 *%、闻约100 *%、闻约125 *%、闻约150 *%、闻约200%、高约250%、高约300%、高约350%、高约400%、高约450%、高约500、高约550%、高约600%、高约650%、高约700%、高约750%或高约800%的多肽生产力。在一些实施方案中，培养的细胞具有较之没有包含I3DHK和LDH的异源核酸序列的培养的细胞高至少约55%、高至少约60%、高至少约65%、高至少约68%、高至少约70%、高至少约80%、高至少约85%或高至少约90%的多肽生产力。在一些实施方案中，培养中的细胞包含编码LDHa特异性的siRNA的第一种异源核酸序列，编码I3DHKl特异性的siRNA的第二种异源核酸序列，编码Η)ΗΚ2特异性的siRNA的第三种异源核酸序列，和编码Η)ΗΚ3特异性的siRNA的第四种异源核酸序列，其中第一种异源核酸序列与第一个启动子(例如，U6)有效连接，其中第二、第三和第四种异源核酸序列与第二个启动子(例如，Hl)有效连接，且其中培养的细胞具有较之没有包含I3DHKl、Η)ΗΚ2、PDHK3和LDHa的异源核酸序列的培养的细胞高至少约68%的抗体生产カ(例如，按g/L)。在一些实施方案中，培养的细胞具有较之没有I3DHK和LDH特异性的siRNA的培养细胞高至少约10%至约800%的多肽(在一些实施方案中，是抗体)生产力。在一些实施方案中，培养的细胞具有较之没有I3DHK和LDH特异性的siRNA的培养的细胞高约10%、高约15*%、闻约20*%、闻约25*%、闻约30*%、闻约35*%、闻约40*%、闻约45*%、闻约50*%、闻约55*%、闻约60*%、闻约65*%、闻约70*%、闻约75*%、闻约80*%、闻约85%、尚约90*%、闻约95%、高约100%、高约125%、高约150%、高约200%、高约250%、高约300%、高约350%、高约400 %、高约450 %、高约500、高约550 %、高约600 %、高约650 %、高约700 %、高约750%或高约800%的多肽生产力。在一些实施方案中，培养的细胞具有较之没有I3DHK和LDH特异性的siRNA的培养的细胞高至少约65%、高至少约68%、高至少约70%、高至少约·80%、高至少约85%或高至少约90%的多肽生产力。在一些实施方案中，抗体生产カ较之没有对DHK和LDH特异性的siRNA的培养的细胞高至少约68%。在另ー个方面，提供了载体，所述载体包含编码LDH特异性的siRNA的第一种异源核酸序列和编码I3DHK特异性的siRNA的第二种异源核酸序列，其中第一种异源核酸序列与第一个启动子有效连接，且其中第二种异源核酸序列与第二个启动子有效连接。在一些实施方案中，载体含有处于表达控制序列控制下的核酸。如本文中使用的，“表达控制序列”意指指导目标核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子，例如组成型或可诱导型启动子，或增强子。“可诱导型启动子”是在环境或发育调控下有活性的启动子。表达控制序列与待转录的核酸区段有效连接。在一些实施方案中，载体还包括終止序列。终止控制区还可以源自宿主细胞的各种天然的基因。在一些实施方案中，終止序列和启动子序列源自相同的来源。在另ー个实施方案中，終止序列是宿主细胞内源的。任选地，可包括終止位点。为了有效表达多肽，编码多肽的DNA通过起始密码子与选定的表达控制区有效连接，使表达导致恰当的信使RNA形成。在一些实施方案中，载体含有选择性标志物。术语“选择性标志物”指能够在宿主细胞中表达的核酸，从而允许容易地选择含有导入的核酸或载体的那些宿主细胞。可选择标志物的实例包括但不限于抗生素抗性核酸(例如，卡那霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素、庆大霉素、潮霉素、腐草霉素、博来霉素、新霉素或氯霉素)和/或赋予代谢优势的核酸，例如宿主细胞上营养优势。在一些实施方案中，选择性标志物是潮霉素核酸。
多肽使用本文描述的方法和培养的细胞生产的多肽或蛋白质包括但不限于抗体或免疫粘附素。生成此类分子的技术描述如下
■落入本发明范围内的抗体包括但不限于抗CD20抗体，例如嵌合的抗CD20 “C2B8”，如美国专利号5，736，137 ( RITUXAN );抗VEGF抗体，包括人源化和/或亲和カ成熟的抗VEGF抗体，例如人源化抗VEGF抗体huA4. 6. I AVASTIN (Kim等人，Growth Factors，7 :53-64(1992)，国际公开号 TO 96/30046 和 TO 98/45331，公开于1998年10月15日)和V3LA ；抗MUC16抗体；抗CD4抗体，例如cM_7412抗体(Choy等人，Arthritis Rheum. 39(1) :52-56(1996))和 Ibalizumab (TNX355)抗体；抗 MET 抗体，例如单臂抗C-Met抗体；抗HER2抗体曲妥珠单抗(HERCEPT1N ) (Carter等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 :4285-4289 (1992)，美国专利号 5，725，856)和人源化2C4 (WOO 1/00245, Adams等人);2H7抗体的嵌合或人源化变体，如美国专利号5，721，108B1或托西莫单抗(BEXXAR );抗 IL-8 抗体(St John 等人，Chest，103 :932(1993)，和国际公开号WO 95/23865);抗前列腺干细胞抗原(PSCA)抗体(W001/40309);抗0)40抗体，包括S2C6及其人源化变体(W000/75348);抗0)1抗体(美国专利号5，622，700，W0 98/23761，Steppe 等人，Transplant Intl. 4 3~7 (1991),和 Hourmant 等人，Transplantation 58 377-380 (1994))；抗CD18 (美国专利号5，622，700，公开于1997年4月22日，或如WO97/26912，公开于1997年7月31日)；抗IgE抗体(包括E25、E26和E27 ;美国专利号5，714，338，公开于1998年2月3日，或美国专利号5，091，313，公开于1992年2月25 日，TO93/04173，公开于1993年3月4日，或国际申请号PCT/US98/13410，提交于1998年6 月 30 日，美国专利号 5,714,338，Presta 等人，J. Immunol. 151 :2623-2632 (1993)，和国际公开号WO 95/19181);抗Apo-2受体抗体(W0 98/51793，公开于1998年11月19 日)；抗 TNF-α 抗体，包括 CA2 (丨U；MICADE )、0^571 和 MAK_195(參见美国专利号5，672，347，公开于1997年9月30日；Lorenz等人，J. Immunol. 156⑷1646-1653(1996);和 Dhainaut 等人，Crit. Care Med. 23 (9) :1461-1469(1995));抗组织因子(TF)抗体(欧洲专利号O 420 937B1，于1994年11月9日授权)；抗人α4β7整联蛋白抗体(W0 98/06248，公开于1998年2月19日)；抗表皮生长因子受体(EGFR)抗体(例如，嵌合的或人源化225抗体，如WO 96/40210，公开于1996年12月19日)；抗
0)3抗体，例如003(美国专利号4，515，893，公开于1985年5月7日);抗CD25或抗Tac抗体，例如 CHI-621 ( SIMULECT 和ΖΕΝΑΡΑΧ (參见美国专利号 5，693，762,公开于 1997 年 12 月 2 日)；抗 CD52 抗体，例如 CAMPATH-1H (Riechmann 等人，Nature332 :323-337(1988));抗Fe受体抗体，例如针对Fcy RI的M22抗体，如Graziano等人，J. Immunol. 155(10) :4996-5002(1995);抗癌胚抗原(CEA)抗体，例如 hMN-14(Sharkey等人，Cancer Res. 55 (23Suppl) 5935s-5945s (1995);针对乳腺表皮细胞的抗体，包括 huBrE-3、hu-Mc 3 和 CHL6(Ceriani 等人，Cancer Res.55(23) :5852s_5856s (1995)；和 Richman 等人,Cancer Res. 55 (23Supp) :5916s_5920s (1995));结合结肠癌细胞的抗体，例如 C242 (Litton 等人，Eur J Immunol. 26 (I) 1-9 (1996))；抗 CD38 抗体，例如 AT13/5(Ellis 等人，J. Immunol. 155(2) :925-937(1995));抗0)33 抗体，例如 Hu M195 (Jurcic等人，Cancer Res 55(23Suppl) 5908s-5910s (1995)和 CMA-676 或 CDP771 ；抗 CD22 抗体，例如 LL2 或 LymphoCide (Juweid 等人，CancerRes 55 (23Suppl) :5899s_5907s (1995))；抗EpCAM抗体，例如17-1A ( PANOREX );抗GpIIb/IIIa抗体，例如阿昔单抗或c7E3 Fab ( REOPRO );抗 RSV 抗体，例如 MEDト493 ( SYNAGIS );抗 CMV 抗体，例如PROTOVIR ;抗HIV抗体，例如PR0542 ;抗肝炎抗体，例如抗H印B抗体OSTAVIR ;抗CA 125抗体，例如OvaRex ;抗独特型⑶3表位抗体BEC2 ;抗α ν β 3抗体，包括VITAXIN ;抗人肾细胞癌抗体，例如ch-G250 ；ING-I ;抗人17-1A抗体(3622W94)；抗人结肠直肠肿瘤抗体(A33);针对GD3神经节苷脂的抗人黑素瘤抗体R24;抗人鳞状细胞癌(SF-25);和抗人白细胞抗原(HLA)抗体，例如Smart IDlO和抗HLA DR抗体Oncolym(Lym-I)。除上述具体指出的抗体外，熟练的技术人员可以例如，使用下述技术生成针对目标抗原的抗体。
(i)抗原选择和制备本文中的抗体是针对目标抗原的。优选地，抗原是生物学重要的多肽，并且向患疾病或病症的哺乳动物施用抗体可以在所述哺乳动物中导致治疗益处。然而，还考虑针对非多肽抗原的抗体(例如，肿瘤相关性糖脂抗原；參见美国专利号5，091，178)。当抗原是多肽时，其可以是跨膜分子(例如，受体)或配体，例如生长因子。示例性的抗原包括在下文章·节(3)中描述的蛋白质。本发明涵盖的抗体的示例性的分子靶包括CD蛋白，例如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22 和 CD34 ；ErbB 受体家族的成员，例如 EGFR、HER2、HER3 或 HER4 受体；细胞粘附分子，例如 LFA-l、Macl、pl 50，95、VLA-4、ICAM-I、VCAM 和 α ν/β 3 整联蛋白，包括其α或β亚基(例如，抗⑶11a、抗⑶18或抗⑶Ilb抗体);生长因子，例如VEGF ;IgE ;血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA_4 ;蛋白C或本文提及的任何其他抗原。可以使用可溶性抗原或其片段，任选地与其他分子缀合的，作为生成抗体的免疫原。对于跨膜分子，例如受体，其片段(例如，受体的胞外结构域)可以用作免疫原。备选地，可以使用表达跨膜分子的细胞作为免疫原。此类细胞可以源自天然来源(例如，癌细胞系)或可以是通过重组技术转化以表达跨膜分子的细胞。可用于制备抗体的其他抗原及其形式对本领域技术人员是显而易见的 ( )多克隆抗体优选通过多次皮下(SC)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂，在动物中培养多克隆抗体。可以使用双功能剂或衍生剂(例如，马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酷(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊ニ醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N = C = NR，其中R和R1是不同的烷基)将抗原与在待免疫物种中免疫原性的蛋白质缀合，例如钥孔虫血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。通过例如组合100 μ g或5 μ g蛋白质或缀合物(分别对于兔或小鼠)与3体积的弗氏完全佐剂，并在多个位点皮内注射溶，用抗原、免疫源性缀合物或衍生物免疫动物。一个月后，用弗氏完全佐剂中的1/5至{級分(1/10)}原始抗原或缀合物的量通过多个位点皮下注射来强化动物。7至14天后，给动物放血，測定血清的抗体效价。强化动物直到效价平台。优选地，用相同抗原的缀合物，但是缀合于不同蛋白质和/或通过不同交联剂强化动物。还可以在重组细胞培养物中制备缀合物作为蛋白质融合体。此外，还适合使用凝聚剂(例如明矾)来增强免疫应答。
(iii)单克隆抗体可以使用Kohler等人，Nature, 256 :495 (1975)中首次描述的杂交瘤方法或者可通过重组DNA方法(美国专利号4，816，567)制备单克隆抗体。
在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其他恰当的宿主动物，例如仓鼠或猕猴，以触发生产或能够生产特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。备选地，可以在体外免疫淋巴细胞。然后，使用合适的融合剂(例如，聚こニ醇)将淋巴细胞与骨髄瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding, Monoclonal Antibodies !Principles and Practice,第59-103 页(Academic Press,1986))。在合适的培养基中接种并生长如此制备的杂交瘤细胞，所述培养基优选地含有一种或多种抑制未融合的、亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，所述物质阻止HGPRT-缺陷细胞的生长。优选的骨髓瘤细胞是可有效融合、支持所选择的抗体生产细胞稳定的高水平的抗体生产，并对培养基(例如HAT培养基)敏感的细胞。其中，优选的骨髓瘤细胞系是小鼠骨髓瘤系，例如源自M0PC-21和MPC-Il小鼠肿瘤的细胞系，可获得自Salk InstituteCell DistributionCenter, San Diego，Calif. USA，和 SP-2 或 X63_Ag8_653 细胞，可获得自美国典型培养物收藏中心(American Type Culture Collection, Rockville, Md.美 国)。还已经描述了人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髄瘤细胞系用于生产人单克隆抗体(Kozbor, J.Immunol. , 133 :3001(1984) ；Brodeur 等人，Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications,弟-5ト63 页(Marcel Dekker, Inc. , New York, 1987))。測定生长了杂交瘤细胞的培养基中针对抗原的单克隆抗体生产。优选地，通过免疫沉淀或体外结合測定，例如放射性免疫測定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)，确定由杂交瘤细胞生产的单克隆抗体的结合特异性。在鉴别了生产具有所需特异性、亲和カ和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可以通过有限稀释方法亚克隆并通过标准方法生长克隆(Goding, Monoclonal Antibodies Principles and Practice,第 59-103 页(Academic Press, 1986))。用于该目的合适的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，可以在体内作为动物内的腹水肿瘤来生长杂交瘤细胞。通过常规的免疫球蛋白纯化方法(例如，蛋白A-琼脂糖、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析)，从培养基、腹水液或血清中恰当地分离由亚克隆分泌的单克隆抗体。优选使用本文所述的使用PH梯度的蛋白A亲和层析方法。使用常规方法(例如，通过使用能够特异性结合编码单克隆抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序编码单克隆抗体的DNA。杂交瘤细胞作为此类DNA的优选来源。一旦分离，则可以将DNA置于表达载体中，然后将所述载体转染到不生产免疫球蛋白的宿主细胞中，例如E. coli细胞、猿猴COS细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以获得单克隆抗体在重组宿主细胞中的合成。还可以修饰DNA，通过例如用人重链和轻链恒定结构域的编码序列替换同源的小鼠序列(美国专利号 4, 816, 567 ；Morrison,等人，Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81 6851 (1984))，或通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列与免疫球蛋白编码序列共价连接。通常用此类非免疫球蛋白多肽替换抗体的恒定结构域，或者替换抗体的ー个抗原结合位点的可变结构域，以创造嵌合的ニ价抗体，所述ニ价抗体包含对抗原具有特异性的ー个抗原结合位点，和对不同抗原具有特异性的另ー个抗原结合位点。可以从使用McCafferty等人，Nature, 348 :552-554 (1990)所述技术生成的抗体曬菌体文库中分离单克隆抗体。Clackson等人，Nature, 352 :624-628(1991)和Marks等人，J. Mol. Biol. ,222 :581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。之后的出版物描述了通过链改组(Marks等人，Bio/Technology, 10 :779-783(1992))生产高亲和力(nM范围)人抗体，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse 等人，Nuc. Acids. Res. ,21 :2265-2266 (1993))。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统杂交瘤技术的可行备选方案。
(iv)人源化抗体和人抗体人源化抗体具有一个或多个导入其中的来自非人来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其通常来自“输入”可变结构域。可以基本按 Winter 及其同事(Jones 等人，Nature, 321 :522-525(1986) ;Riechmann 等人，Nature, 332 323-327(1988) ;Verhoeyen 等人，Science，239 :1534-1536 (1988))的方法，通过用啮齿动物CDR或CDR序列替换相应的人抗体序列实施人源化。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4，816，567)，其中基本上少于完整的人可变结构域被来自非人物种的相应序列替换。在实践中，人源化抗体通常是人的抗体，其中ー些⑶R残基和可能ー些FR残基被来自啮齿动物抗体的类似位点的残基替换。对用于制备人源化抗体的人轻链和重链可变结构域的选择，对于降低抗原性是非常重要的。根据所谓的“最适”方法，针对已知的人可变结构域序列的完整文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域序列。然后，接受与啮齿动物的序列最接近的人序列作为人源化抗体的人FR (Sims等人，J. Immunol. ,151 :2296(1993))。另ー种方法使用源自具有特别亚组的轻链或重链的所有人抗体的共有序列的特别框架。同一框架可用于若干不同的人源化抗体(Carter 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 :4285 (1992) ；Presta 等人，J. Tmmnol. , 151 2623(1993))。更重要的是，被人源化的抗体保持对抗原的高亲和カ和其他有利的生物学性质。为了达到此目的，根据优选的方法，通过使用亲代和人源化序列的三维模型来分析亲代序列和多种概念性的人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的并且为本领域技术人员所熟知。说明并且展示所选择的候选免疫球蛋白的序列的可能的三维构象结构的计算机程序是可获得的。检查这些展示物允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方法，能够选择并且从受体和输入序列组合FR残基使得实现所需要的抗体特征，例如对靶抗原的增强的亲和力。通常而言，CDR残基直接并且最基本地涉及对抗原结合的影响。备选地，现在能够生产这样的转基因动物(例如，小鼠)，在免疫后，所述转基因动物能够在缺少内源性免疫球蛋白生产的条件下，生产完全的人抗体库。例如，已描述了在嵌合的和种系突变型小鼠中纯合缺失抗体重链连接区(JH)基因，导致完全抑制内源性抗体生产。在此类种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致抗原攻击时的人抗体生产。參见例如，Jakobovits 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90 :2551(1993) ；Jakobovits等人，Nature, 362 :255-258 (1993) ;Bruggermann 等人，Year in Tmmunο. ,7 :33(1993);和Duchosal等人，Nature 355:258(1992)。人抗体还可以源自卩遼菌体展不文库(Hoogenboom等人，J. Mol. Biol.，227 :381 (1991) ；Marks 等人，J. Mol. Biol.，222 :581-597 (1991)；Vaughan 等人，Nature Biotech 14:309(1996))。
(v)抗体片段已开发了多种技术用于生产抗体片段。传统上，这些片段是通过完整抗体的蛋白水解消化衍生的(參见例如，Morimoto 等人，Journalof Biochemical and BiophysicalMethods 24:107-117(1992)和 fcennan 等人，Science，229 :81(1985))。然而，可以通过重组宿主细胞直接生产这些片段。例如，可以从上述抗体噬菌体文库分离抗体片段。备选地，可以从E. coli中直接回收Fab’ -SH片段,并化学偶联以形成F(ab’ )2片段(Carter等人，Bio/Technology 10 163-167 (1992)) 0根据另ー种方法，可以从重组宿主细胞培养物中直接分离F(ab’)2片段。还可以分离单链Fv片段(scFv)。參见WO 93/16185。用于生产抗体片段的其他技术对熟练的技术人员是显而易见的。
(vi)多特异性抗体多特异性抗体具有至少两种不同抗原的结合特异性。尽管此类分子通常仅结合两种抗原(即，双特异性抗体，BsAbs)，当在本文中使用时，具有额外特异性的抗体(例如三特异性抗体)也涵盖在该表达方式中。用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生产基于两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条链具有不同的特异性(Millstein等人，Nature, 305 :537-539 (1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadromas))生产10种不同抗体分子的潜在混合物,其中仅ー种具有正确的双特异性结构。纯化正确的分子(通常通过亲和层析步骤进行)是非常麻烦的，且产量低。类似的方法公开在 WO 93/08829 和 Traunecker 等人，EMBO J.，10 :3655-3659 (1991)中。根据W096/27011描述的另ー种方法，可以改造在抗体分子对之间的界面，以将从重组细胞培养物中回收的异ニ聚体百分比最大化。优选的界面至少包含抗体恒定结构域的Ch3结构域的一部分。在该方法中，来自第一个抗体分子的界面的一条或多条小氨基酸侧链被较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)取代。通过用较小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链，在第二个抗体分子的界面上创造与大侧链相同或相似尺寸的补偿性“空腔”。这提供了増加异ニ聚体的产量超过其他不想要的终产物(例如同ニ聚体)的机制。双特异性抗体包括交联的或“异源缀合的”抗体。例如，异源缀合物中的ー个抗体可以与抗生物素蛋白偶联，另ー个与生物素偶联。已经建议此类抗体例如用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利号4，676，980)和用于治疗HIV感染(W0 91/00360、WO92/200373和EP03089)。可以使用任何方便的交联方法制备异源缀合抗体。合适的交联剂是本领域普遍已知的，并公开在美国专利号4，676，980中，同时还有多种交联技木。文献中还已描述了用于从抗体片段生成双特异性抗体的技木。例如，可以使用化学连接制备双特异性抗体。Brennan等人,Science, 229 :81(1985)描述了这样的方法,其中蛋白水解切割完整的抗体，以生成F(ab’ )2片段。在存在ニ巯基化物络合剂亚砷酸钠的条件下，这些片段被还原以稳定临近的ニ巯基并阻止形成分子间ニ硫键。然后，将生成的Fab’片段转化为硫代亚硝基苯甲酸(thionitrobenzoate) (TNB)衍生物。之后，通过用巯基こ胺还原，将Fab’ -TNB衍生物中的ー种再转化为Fab’ -巯基，并与等摩尔量的其他Fab’ -TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。所生产的双特异性抗体可用作选择性固定酶的试剂。目前的进展协助了从E.coli中直接回收Fab’-SH片段，所述片段可以化学偶联形成双特异性抗体。Shalaby等人，J. Exp. Med.，175 =217-225(1992)描述了完全人源化的双特异性抗体F(ab’)2分子的生产。每个Fab’片段分别从E. coli分泌并在体外受定向的化学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达ErbB2受体的细胞和正常的人T细胞，以及引发针对人乳腺肿瘤靶的人细胞毒性淋巴细胞的裂解活性。还已经描述了用于从重组细胞培养物中直接制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生产双特异性抗体。Kostelny等人，J. Immunol.,148(5) :1547-1553(1992)。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两个不同抗体的Fab’部分连接。抗体同源ニ聚体在铰链区被还原以形成単体，然后被再氧化以形成抗体异源ニ聚体。该方法还可以用于生产抗体同源ニ聚体。由Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90 :6444-6448(1993)描述的“双抗体”技术提供了用于制备双特异性抗体片段的备选机制。片段包含通过接头与轻链可变结构域(\)连接的重链可变结构域(Vh)，所述接头太短而不允许在同一条链的两个结构域之间配对。因此，一个片段 的Vh和\结构域被迫与另ー个片段的互补\和Vh结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv (sFv) ニ聚体，制备双特异性抗体片段的另ー种策略。參见Gruber 等人，J. Immunol. , 152 :5368 (1994)。备选地，如 Zapata 等人，Protein Eng. 8 (10)1057-1062(1995)中所述，抗体可以是“线性抗体”。简而言之，这些抗体包含形成抗原结合区对的串联Fd区段对(Vh-ChI-Vi^PVJc线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。考虑具有多于ニ价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt等人,J. Immunol147 =60(1991)。
免疫粘附素最简单和最直接的免疫粘附素设计组合了粘附素的结合结构域(例如，受体的胞外结构域(ECD))和免疫球蛋白重链的铰链和Fe区。通常，当制备本发明的免疫粘附素吋，编码粘附素的结合结构域的核酸可在C端与编码免疫球蛋白恒定结构域序列的N端的核酸融合，然而，N端融合体也是可行的。通常，在此类融合体中，编码的嵌合多肽将至少保留免疫球蛋白重链恒定区的功能活性的铰链、Ch2和Ch3结构域。还可以在恒定结构域Fe部分的C端或紧靠重链的ChI的N端或轻链的相应区域制备融合体。制备融合体的精确位点不是关键的；特别的位点是普遍已知的并可选择，以优化免疫粘附素的生物学活性、分泌或结合特征。在一些实施方案中粘附素序列与免疫球蛋白GJIg G1)的Fe结构域N端融合。可以将整个重链恒定区与粘附素序列融合。然而，优选地，融合体中使用了在恰好化学定义了IgG Fe的木瓜蛋白酶切割位点(即，残基216，取重链恒定区的第一残基为114)上游的铰链区中开始的序列，或其他免疫球蛋白的类似位点。在一些实施方案中，粘附素氨基酸序列与IgG重链的(a)铰链区和/或Ch2和Ch3，或(b) ChI、铰链、CH2和CH3结构域融合。对于双特异性免疫粘附素，免疫粘附素被装配为多聚体，特别是异源ニ聚体或异源四聚体。一般而言，这些装配的免疫球蛋白可具有已知的単位结构。基础的四条链结构单位是IgG、IgD和IgE存在的形式。四条链单位在较高分子量免疫球蛋白中重复；IgM —般作为由ニ硫键聚拢在一起的四个基本単位的五聚体存在。IgA球蛋白，以及偶尔的IgG球蛋白也可以多聚体形式存在于血清中。在多聚体的情况下，四个单位的每ー个可以是相同或不同的。本文范围内的多种示例性装配的免疫粘附素如下图示意
(a)ACl-ACl ；
(b)ACh- (ACh, ACl-ACh, ACl-VhCh,或 VlCl-ACh)；
(c)ACl-ACh- (ACl-ACh, ACl-VhCh, VlCl-ACh,或 VlCl-VhCh)
(d)ACl-VhCh- (ACh，或 ACl-VhCh 或 VlCl-ACh)； (e)VlCl-ACh- (ACl-VhCh,或 VlCl-ACh);和
(f)(A-Y)n-(VlCl-VhCh)2,
其中，每个A代表相同或不同的粘附素氨基酸序列；
Vl是免疫球蛋白轻链可变结构域；
Vh是免疫球蛋白重链可变结构域；
Cl是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
Ch是免疫球蛋白重链恒定结构域；
N是大于I的整数；
Y表示共价交联剂的残基。为了简洁，上述结构仅显示了关键的特征；未标示出免疫球蛋白的连接(J)或其他结构域，也没有显示ニ硫键。然而，当要求此类结构域的结合活性吋，应该构建使其存在于在免疫球蛋白中占据的常见位置上。备选地，粘附素序列可以插入到免疫球蛋白重链和轻链序列之间，从而获得包含嵌合重链的免疫球蛋白。在该实施方案中，粘附素序列与免疫球蛋白每条臂的免疫球蛋白重链的3’端融合，或者在铰链和Ch2结构域之间，或者在Ch2和Ch3结构域之间融合。Hoogenboom 等人，Mol. Immunol. 28 1027-1037 (1991)报道了相似的构建体。虽然免疫球蛋白轻链不需要存在于本发明的免疫粘附素中，但可存在免疫球蛋白轻链，与粘附素-免疫球蛋白重链融合多肽共价缔合，或与粘附素直接融合。在前ー种情况下，编码免疫球蛋白轻链的DNA通常与编码粘附素-免疫球蛋白重链融合蛋白的DNA共表达。分泌时，杂合的重链和轻链将共价缔合，以提供包含2个ニ硫键连接的免疫球蛋白重链-轻链对的免疫球蛋白样结构。适合制备此类结构的方法例如公开在1989年3月28日公布的美国专利号4，816，567中。可以通过框内融合编码粘附素部分的cDNA序列与免疫球蛋白cDNA序列，最方便地构建免疫粘附素。然而，还可以采用与基因组免疫球蛋白片段的融合(參见例如，ArufTo等人，Cell 61 :1303-1313(1990);和 Stamenkovic 等人，Cell 66:1133-1144(1991))。后一种类型的融合需要存在用于表达的Ig调控序列。可以基于源自脾或外周血淋巴细胞的cDNA文库的公开的序列，通过杂交或通过聚合酶链式反应(PCR)技术，分离编码IgG重链恒定区的cDNA。将编码“粘附素”和免疫粘附素的免疫球蛋白部分的cDNA串联插入到在选定的宿主细胞中指导有效表达的质粒载体中。
多肽的表达使用本文描述的方法来生产的多肽(例如，抗体)一般是使用重组技术生产的。用于在本文中的载体中克隆或表达siRNA的合适宿主细胞是原核细胞、酵母或高等真核细胞。用于该目的的合适的原核细胞包括真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如，肠杆菌科(Enterobacteriaceae),如埃希氏菌属(Escherichia),例如大肠杆菌、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella),例如鼠伤害沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、沙雷氏菌属(Serratia),例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans),和志贺氏菌属(Shigella)，以及杆菌属(Bacilli)，如枯草芽孢杆菌(B. subtilis)和地衣芽孢杆菌(B. Iicheniformis)(例如，在1989年4月12日公开的DD 266, 710中公开的地衣芽孢杆菌)，假单胞菌属(Pseudomonas)如，绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和链霉菌属(Streptomyces)。这些实例是示例性的而非限制性的。除原核细胞外，真核微生物(例如丝状真菌或酵母)也是多肽编码载体的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或普通的烘焙酵母，是最普遍使用的低等真核宿主微生物。然而，多种其他属、种和菌株也是通常可获得的并在本文中有用的，例如粟酒裂埴酵母(Schizosaccharomyces pombe);克鲁维酵母(Kluyveromyces)宿主，例如乳酸克鲁维酵母(K. Iactis)、脆壁克鲁维酵母 (K. fragilis(ATCC12, 424))、保加利亚克鲁维酵母(K. bulgaricus (ATCC 16，045))、威克克鲁维酵母(K. wickeramii (ATCC 24，178))、瓦尔提克鲁维酵母(K. waltii (ATCC56, 500))、果蚬克鲁维酵母(K. dro soph i larum (ATCC 36, 906))、耐热克鲁维酵母(K. thermotolerans)和马克思克鲁维酵母(K. marxianus);耶氏酵母属(yarrowia(EP402, 226));巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris (EP183, 070));念珠菌属(Candida);至氏木霉(Trichoderma reesia(EP244, 234));粗糖脉抱霉(Neurospora crassa);施旺氏酵母属(Schwanniomyces),例如西方施旺氏酵母(Schwanniomyces occidentalis);和丝状真菌，例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主,例如构巢曲霉(A. nidulans)和黑曲霉(A. niger)。用于表达糖基化多肽的合适的培养细胞源自多细胞生物。无脊椎生物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了多种杆状病毒株和变体和来自宿主(例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedesalbopictus)(蚊子)、黑腹果妮(Drosophila melanogaster)(果妮)和家香(Bombyxmori))的相应的受納昆虫宿主细胞。多种用于转染的病毒株是可公开获得的，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica) NPV的L-I变体和家香NPV的Bm_5株,并且此类病毒可根据本发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地贪夜蛾细胞。还可以使用棉花、玉米、土豆、大豆、牵牛花、西红柿和烟草的植物细胞培养物作为宿主。然而,对脊椎动物细胞具有最大的兴趣,在培养(组织培养)中增殖脊椎动物细胞已成为常规的方法。哺乳动物细胞系的实例包括但不限于用SV40转化的猴肾CVl细胞(COS-7，ATCC CRL 1651);人胚肾细胞(293或在悬浮培养中生长的亚克隆293细胞，Graham 等人，J. GenVirol. 36 :59(1977));幼年仓鼠肾细胞(BHK, ATCC CCL 10);中华仓鼠卵巢细胞/DHFR(CHO，Urlaub 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 :4216(1980));小鼠支持细胞(TM4, Mather, Biol. R印rod. 23 :243-251 (1980));猴肾细胞(CVl ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCCCRL-1587);人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2);犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL 34);布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442);人肺细胞(Wl38,ATCCCCL 75);人肝细胞(Hep G2，HB 8065);小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51) ;TRI 细胞(Mather 等人，AnnalsN. Y. Acad. Sci. 383 :44-68(1982)) ；MRC 5 细胞；FS4 细胞；和人肝细胞瘤细胞OfeP G2)。用上述用于多肽生产的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在经过修饰适合诱导启动子的常规营养基质中培养，选择转化体或扩增编码所需序列的基因。可在多种培养基中培养用于生产本发明方法使用的多肽的宿主细胞。可商购的培养基，例如 Ham’ s FlO (Sigma)、最少必需培养基(Minimal Essential Medium) ((MEM)、(Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)和Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium((DMEM)、(Sigma)或G1BCO Dulbecco' s Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Invitrogen)适合培养宿主细胞。此外,可以使用Ham等人,Meth. Εηζ· 58 :44(1979) ;Barnes等人,Anal.Biochem. 102 :255 (1980);美国专利号 4，767，704 ;4，657，866 ;4，927，762 ;4，560，655 ；或5，122，469 ；W0 90/03430 ；W0 87/00195 ;或美国专利号Re. 30，985中描述的任何培养基作为宿主细胞的培养基。还可以使用其他定义的或合成的生长培养基，用于培养特定类型宿 主细胞的恰当培养基是分子和细胞生物学领域技术人员已知的。需要时，任何这类培养基都可补充激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷酸和胸腺嘧啶)、抗生素(例如GENTAMYCIN 、潮霉素)、微量元素(定义为通常以终浓度在微摩尔范围内存在的无机化合物)，和葡萄糖或等价的能源。还可以包括恰当浓度的本领域技术人员已知的任何其他必需的添加剤。培养条件(例如温度、PH等)是之前选择的宿主细胞用于表达时使用的，对普通技术人员是显而易见的。可以使用标准的细胞培养条件培养细胞。在恰当的温度、气体混合物和pH(例如约20°C至约37°C，约6%至约84% CO2和约5至约9之间的pH)生长维持细胞。在ー些实施方案中，细胞在37°C下，在恰当的细胞培养基中生长第一个48小时，再转移到33°生长接下来的12天。基于宿主细胞的需求，可以在有氧或缺氧条件下实施反应。在一些实施方案中，使用任何已知的发酵模式生长细胞，包括但不限于分批、补料-分批或连续的方法。当使用重组技术时，可以在细胞内、周质空间中生产多肽，或直接分泌到培养基中。如果在细胞内生产多肽，第一步是例如通过离心或超滤去除微粒碎片，可以是宿主细胞或裂解的细胞(例如由均质化产生的)。当多肽分泌到培养基中时，一般首先使用可商购的蛋白质浓缩滤器(例如Amicon或MiIlipore Pellicon超滤单位)，浓缩来自此类表达系统的上清液。
试剂盒本发明还提供了包含组合物和含有对本发明方法的说明的使用说明书的试剂盒。试剂盒可以包含培养的细胞、siRNA、靶序列、转染试剂、本发明方法的说明书或其任意的组
ム
ロ ο提供下列实例供示例，而不是限制本发明。
实施例应理解，本文描述的实例和实施方案仅用于说明的目的，它的多种修饰和改变对本领域技术人员是提示性的，并包括在本申请的主g和范围内。实施例I :敲低roHKl、roHK2、roHK3和LDHa降低了乳酸生产并且增加抗体效价/生产
力
材料和方法
构律靶向LDHa/PDHKl、2、3的载体如Kim和 Lee 等人，Appl. Microbiol. Biotechnol. 74(I) 152-159 (2007)所述，选择 LDHa 的靶向序列，并且 LDHa siRNA 序列是 CTCGATTCCGTTATCTGAT(SEQ ID NO 1) 为了设计I3DHK的siRNA-靶向序列，通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，用位于TOHK的高度保守区内的引物，克隆CHO Η)ΗΚ1、2和3的部分cDNA序列。根据Elbashier等人(Methods26 :199-213(2002))描述的方法，使用部分克隆的序列用于siRNA序列设计。
PDHKl 靶向(siRNA)序列GCAGTTCCTGGACTTCGGA(SEQID NO 2)·
PDHK2 靶向(siRNA)序列CATTCAGTACTTCTTGGAC (SEQ IDNO:3)
PDHK3 靶向(siRNA)序列TGTAGCTGATGTCGTGAAA(SEQID NO 4)使用pSilencer 3. I-Hl hygro 载体(Cat#· AM5766,AppliedBiosystems/Ambion,Austin, TX)，构建含有LDHa和TOHK靶向序列的单构建体。将LDHa siRNA插入到pSilencer3. I的KasI位点，在紧邻其5’端处添加pSilencer 2. I的U6启动子。将PDHKl和2 siRNA的siRNA序列分别插入至Ij BamHI/Hindlll和HindIII位点。向PDHK2 siRNA的3，侧导入BgIII位点，并用于插入H)HK3 siRNA。阴性对照使用含有乱序的siRNA序列的pSilencer
3.I载体。
细胞培养在37°C和5% CO2，在专利所有的基于DMEM/F12培养基摇瓶中培养ニ氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型CHO细胞。每3至4天将细胞传代。
培育稳定的siRNA细胞系(siRNA克降)根据生产商(Invitrogen,Carlsbad, CA)的推荐，使用 Lipofectamine 2000CD (Cat#12566-014，Invitrogen, Carlsbad, CA)，转染耐受 25nM 氨甲蝶呤(MTX)并表达重组单克隆抗体的CHO细胞系。离心转染的细胞，并接种到含有25nM MTX和400ug/ml潮霉素(Cat#10687010, Invitrogen, Carlsbad, CA)的基于 DMEM/F-12 的选择性(不含甘氨酸、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷)培养基中。将重新悬浮的细胞种植到96孔板中以生成单个克隆。siRNA克隆源自含有LDHa和TOHK基因靶向序列的siRNA质粒转染，而模拟克隆源自含有由生产商设计的、与已知基因没有任何可察觉的同源性的打乱序列(scramble sequence)的模拟质粒(Cat#AM5766, Applied Biosystems/Ambion, Austin, TX)转染。
定量实时PCR(aRT-PCR或Taaman)分析使用RNeasy 96试剂盒(Cat#74181, Qiagen)分离来自单个克隆的总RNA,并用DNase消化(Cat#79254, RNase free DNase set, Qiagen)处理，以去除可能存在于分离的RNA样品中的剩余DNA。根据生产商(Cat#4309169, Applied Biosystems)的说明，使用通用qRT-PCR预混合液(master mix)实施Taqman,并将F1DHK和LDHa的表达水平对持家基因β_微球蛋白进行归一化。用于Taqman分析的引物和探针序列如下
PDHKl 正向引物GCCCATCTCATCGAAAACA(SEQ ID NO 5)
PDHKl 反向引物AGCCATCTTTAATGACTTCGACTAC (SEQ IDNO 6)PDHKl 探针TCGCAGTTTGGATTTATGCTTCCAATG(SEQ IDNO :7)
PDHK2 正向引物GATCTGTCCATCAAAATGAGTGA(SEQ IDNO 8)
PDHK2 反向引物TGTGGAGTACATGTAGCTGAAGAG(SEQ IDNO 9)
PDHK2 探针CTCTCAATCTTCCTCAAGGGGACACC(SEQ IDNO :10)
PDHK3 正向引物CAGCCTGGAGCCTACAAGA(SEQ ID NO :11)
PDHK3 反向引物GGCATACAGTCGAGAAATTGG(SEQ IDNO :12)
PDHK3 探针AAGCCATAACCAAATCCAGCCAAGG (SEQ IDNO :13)
LDHa 正向引物GCCGAGAGCATAATGAAGAA(SEQ ID NO :14)
LDHa 反向引物CCATAGAGACCCTTAATCATGGTA (SEQ IDNO : 15)
LDHa 探针CTTAGGCGGGTGCATCCCATTT (SEQ ID NO :16)β-微球蛋白正向引物TCCTCTCAGTGGTCT GCT TGG (SEQ IDNO : 17)β -微球蛋白反向引物TGGCGTGTGTAGACTTGCACTT (SEQ IDNO 18)β-微球蛋白探针TGCCATCCAGCGTCCCCCA(SEQ ID NO :19)
补料-分批摇瓶克隆评估将12个siRNA克隆和12个模拟克隆接种到专利所有的生产培养基中，在pH 7. 15下，实施14天的补料-分批培养方法，在第3天进行一次大丸剂(bolus)补料，并在第2天将温度从37 °C变为33で。使用Vi ce 11 (Beckman Coulter)，通过台盼蓝染料排除，监控细胞活力和活细胞计数。使用Nova Bioprofiile分析仪(Nova biomedical),在第3、7、10和14天測量乳酸浓度。基于全培养物体积中构建的乳酸质量平衡等式
权利要求
1.用于降低培养的细胞中乳酸生产的方法，所述方法包括培养细胞，所述细胞包含编码乳酸脱氢酶(LDH)特异性的小干扰RNA(SiRNA)的第一种异源核酸序列和编码丙酮酸脱氢酶激酶O3DHK)特异性的siRNA的第二种异源核酸序列，其中第一种异源核酸序列与第一个启动子有效连接，并且其中第二种异源核酸序列与第二个启动子有效连接。
2.权利要求I的方法，其中LDH是LDHa。
3.权利要求I的方法，其中培养的细胞进一步包含编码第二种I3DHK特异性的siRNA的第三种异源核酸序列，且其中第三种异源核酸序列与第三个启动子有效连接。
4.权利要求3的方法，其中培养的细胞进一步包含编码第三种TOHK特异性的siRNA的第四种异源核酸序列，且其中第四种异源核酸序列与第四个启动子有效连接。
5.权利要求4的方法，其中培养的细胞进一步包含编码第四种TOHK特异性的siRNA的第五种异源核酸序列，且其中第五种异源核酸序列与第五个启动子有效连接。
6.权利要求I、3、4和5中任一项的方法，其中PDHK选自PDHKI、PDHK2、PDHK3和PDHK4。
7.权利要求1、3和4中任一项的方法，其中I3DHK选自Η)ΗΚ1、Η)ΗΚ2和TOHK3。
8.权利要求I或3的方法，其中PDHK选自PDHKl和PDHK2。
9.权利要求I或3的方法，其中PDHK选自PDHKl和PDHK3。
10.权利要求I或3的方法，其中PDHK选自PDHK2和PDHK3。
11.权利要求4的方法，其中LDH是LDHa，其中第一种TOHK是TOHKl，其中第二种TOHK是TOHK2，且其中第三种TOHK是TOHK3。
12.权利要求1、3、4和5中任一项的方法，其中培养的细胞生产异源多肽。
13.权利要求12的方法，其中异源多肽是抗体。
14.权利要求4的方法，其中培养的细胞的平均乳酸生产速率少于约负O.02mg/106细胞/天。
15.权利要求4的方法，其中培养的细胞较之没有包含TOHK和LDH的异源核酸序列的培养的细胞具有高至少约75%的比生产力。
16.权利要求4的方法，其中培养的细胞具有少于约300m0sm的重量摩尔渗透压浓度。
17.权利要求4的方法，其中培养的细胞较之没有包含TOHK和LDH的异源核酸序列的培养的细胞具有高至少约68%的多肽生产力。
18.权利要求12或13的方法，其中培养的细胞是哺乳动物细胞。
19.沉默或下调培养的细胞中的乳酸脱氢酶(LDH)和丙酮酸脱氢酶激酶(TOHK)转录的方法，所述方法包括 向细胞中导入载体，所述载体包含编码LDH特异性的小干扰RNA (siRNA)的第一种异源核酸序列和编码I3DHK特异性的siRNA的第二种异源核酸序列，其中第一种异源核酸序列与第一个启动子有效连接，且其中第二种异源核酸序列与第二个启动子有效连接，其中表达siRNA，从而沉默或下调LDH和TOHK的基因转录。
20.制备在培养中表现出减少的乳酸生产的细胞的方法，所述方法包括向细胞中导入载体，所述载体包含编码LDH特异性的小干扰RNA(SiRNA)的第一种异源核酸序列和编码TOHK特异性的siRNA的第二种异源核酸序列，其中第一种异源核酸序列与第一个启动子有效连接，且其中第二种异源核酸序列与第二个启动子有效连接。
21.培养中的细胞，所述细胞具有少于约负O.02mg/106细胞/天的平均乳酸生产速率。
22.培养中的细胞，所述细胞较之没有包含一种或多种TOHK和LDH的一种或多种异源核酸序列的培养的细胞具有高至少约75 %的比生产力。
23.培养中的细胞，所述细胞具有少于约300m0sm的重量摩尔渗透压浓度。
24.培养中的细胞，所述细胞包含编码乳酸脱氢酶(LDH)特异性的小干扰RNA(SiRNA)的第一种异源核酸序列和编码丙酮酸脱氢酶激酶(TOHK)特异性的siRNA的第二种异源核酸序列，其中第一种异源核酸序列与第一个启动子有效连接，且其中第二种异源核酸序列与第二个启动子有效连接。
25.权利要求24的细胞，其中细胞进一步包含编码第二种TOHK特异性的siRNA的第三种异源核酸序列，且其中第三种异源核酸序列与第三个启动子有效连接。
26.权利要求25的细胞，其中细胞进一步包含编码第三种TOHK特异性的siRNA的第四种异源核酸序列，且其中第四种异源核酸序列与第四个启动子有效连接。
27.权利要求26的细胞，其中细胞进一步包含编码第四种TOHK特异性的siRNA的第五种异源核酸序列，且其中第五种异源核酸序列与第五个启动子有效连接。
28.权利要求24、25、26和27中任一项的细胞，其中I3DHK选自Η)ΗΚ1、Η)ΗΚ2、Η)ΗΚ3和PDHK4。
29.权利要求24、25和26中任一项的细胞，其中I3DHK选自Η)ΗΚ1、Η)ΗΚ2和TOHK3。
30.权利要求24或25的细胞，其中I3DHK选自I3DHKl和Η)ΗΚ2。
31.权利要求24或25的细胞，其中I3DHK选自I3DHKl和Η)ΗΚ3。
32.权利要求24或25的细胞，其中I3DHK选自Η)ΗΚ2和Η)ΗΚ3。
33.权利要求26的细胞，其中LDH是LDHa，其中第一种TOHK是TOHKl，其中第二种TOHK是TOHK2，且其中第三种TOHK是TOHK3。
34.权利要求24的细胞，其中细胞生产异源多肽。
35.权利要求34的细胞，其中异源多肽是抗体。
36.权利要求26的细胞，其中细胞具有少于约负O.02mg/106细胞/天的平均乳酸生产速率。
37.权利要求26的细胞，其中细胞较之没有包含LDH和TOHK的异源核酸序列的培养的细胞具有高至少约75%的比生产力。
38.权利要求26的细胞，其中细胞具有少于约300m0sm的重量摩尔渗透压浓度。
39.权利要求26的细胞，其中细胞较之没有包含LDH和TOHK的异源核酸序列的培养的细胞具有高至少约68%的多肽生产力。
40.权利要求34或35的细胞，其中细胞是哺乳动物细胞。
41.包含编码乳酸脱氢酶(LDH)特异性的小干扰RNA(siRNA)的第一种异源核酸序列和编码丙酮酸脱氢酶激酶(TOHK)特异性的siRNA的第二种异源核酸序列的载体，其中第一种异源核酸序列与第一个启动子有效连接，且其中第二种异源核酸序列与第二个启动子有效连接。
42.在培养的细胞中降低乳酸生产的方法，所述方法包括培养细胞，所述细胞表达a)乳酸脱氢酶(LDH)特异性的小干扰RNA(SiRNA)和b)丙酮酸脱氢酶激酶(I3DHK)特异性的SiRNA0
43.权利要求42的方法，其中培养的细胞进一步表达第二种TOHK特异性的siRNA。
44.权利要求43的方法，其中培养的细胞进一步表达第三种TOHK特异性的siRNA。
45.权利要求43的方法，其中培养的细胞进一步表达第四种TOHK特异性的siRNA。
46.权利要求44的方法，其中培养的细胞较之没有LDH和TOHK特异性的siRNA的培养的细胞具有高至少约68%的多肽生产力。
全文摘要
本发明提供了用于降低培养的细胞中乳酸生产和增加多肽生产的方法和组合物。在一个方面，本发明提供了这样的方法，所述方法包括培养表达a)乳酸脱氢酶(LDH)特异性的小干扰RNA(siRNA)和b)丙酮酸脱氢酶激酶(PDHK)特异性的siRNA的细胞。在另一个方面，本发明提供了培养包含LDH特异性的siRNA和PDHK特异性的siRNA的细胞或载体。
文档编号C07H21/04GK102985437SQ201180026517
公开日2013年3月20日 申请日期2011年5月26日 优先权日2010年5月28日
发明者M·周, B·R·斯奈德克尔, C·K·D·恩格, A·沈 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司