抗lrp6抗体的制作方法

专利名称：抗lrp6抗体的制作方法
抗LRP6抗体对相关申请的交叉引用本申请要求2010年3月24日提交的美国临时申请No. 61/317，137和2010年10月20日提交的美国临时申请No. 61/394，836的权益，通过提及而将其完整公开内容收入本文。发明领域本发明涉及抗LRP6抗体及使用抗LRP6抗体治疗癌症或骨骼病症的方法。发明背景
与大多数其它形态发生素和生长因子信号传导途径相似，哺乳动物Wnt信号传导在发育和组织稳态期间被调动多次，这经由使用19种不同配体、10种受体和多种共同受体，包括 LRP5/6、Ror 1/2 和 Ryk 来进行(van Amerongen 和 Nusse, 2009)。另外，结合 Wnt(诸如SFRP1/2/3/4/5和WIF1)或LRP5/6 (包括DKK1/2/4和S0ST)的不同分泌性拮抗剂调控配体和受体之间的相互作用。这些膜和细胞外蛋白质及其多种同等型在表达水平和组合蛋白质相互作用方面提供差异调节。大多数fct同等型表现出能够结合共同受体LRP5/6，而LRP5/6的参与细化了规范的或β -联蛋白依赖性的Wnt信号传导。Wnt将LRP5/6和FZD异二聚化以介导LRP5/6胞内域磷酸化和轴蛋白结合(Tamai等,2000 ；Semenov等,2001 ；Tamai等，2004)。DVL通过直接结合轴蛋白和FZD 二者被带入复合物中，而DVL寡聚化很可能扩大膜的胞质面上的这些蛋白质复合物，隔绝GSK3并抑制其磷酸化和β -联蛋白脱稳定化(Mi 等，2006 ；Bilic 等，2007 ；Schwarz-Romond 等，2007 ；Cselenyi 等，2008 ；Piao 等，2008 ;WilliamsonZeng 等，2008 ;Wu 等，2009)。极大数目的展示可观的一级序列分歧，介导哺乳动物规范Wnt信号传导的配体同等型与高度同源的共同受体对形成对比。LRP6和LRP5胞外域主要由四个同源区组成，从N端到C端称作El到E4，每个含有一个YWTD型β -螺旋桨和EGF样域(Jeon等，2001 )。LRP6和LRP5中相似位置处的每个重复是高度保守的，而同一蛋白内的不同重复是相当更加趋异的。有趣地，Bourhis等(2010)证明了 Wnt9b在体外专门在Ε1-Ε2区内结合,而Wnt3a只结合含有E3-E4的片段，提示每个重复或两个相邻重复的组合结合Wnt同等型的不同子集。这种安排可适应fct蛋白的多样性，而且可能还容许LRP5/6拮抗性配体对它们的差异调节。在其胞外区分别含有重复的EGF样和Ig域的Notch和VEGF受体中，多种配体同等型的结合定位于一个或两个重复的同一区，尽管其它重复的存在能增强结合(Rebay等，1991 ;Davis_Smyth 等，1996 ;Cunningham 等，1997)。对于受体酪氨酸激酶，配体诱导的二聚化启动对激酶活性和信号传导的刺激。虽然配体诱导的受体-共同受体异二聚化是规范fct信号传导所必需的，但是LRP5/6或FZD同二聚化的作用尚未清楚限定。不同重组LRP6蛋白的被迫二聚化能激活或抑制Wnt信号传导。β-联蛋白依赖性Wnt信号传导由Wnt同等型结合受体FZD和共同受体LRP5/6 二者启动，它们然后在胞质膜面装配多聚体复合物以募集和灭活激酶GSK3。Wnt同等型和受体之间的不同相互作用是否及如何机械地调控这个过程仍然有待确定。
发明概述本发明的一个方面提供一种结合LRP6的分离的抗体，其中该抗体抑制由第一 Wnt同等型诱导的信号传导且强化由第二 fct同等型诱导的信号传导。在一个实施方案中，所述第一 fct同等型选自下组Wnt3和Wnt3a。在一个实施方案中，所述第二 Wnt同等型选自下组Wnt l、2、2b、4、6、7a、7b、8a、9a、9b、10a 和 10b。在另一个实施方案中，所述第一 Wnt同等型选自下组Wnts l、2、2b、6、8a、9a、9b和IOb且所述第二 Wnt同等型选自下组Wnt3和 Wnt3a。本发明的一个方面提供一种结合LRP6的E3-E4区的抗体。本发明的另一个方面提供一种结合LRP6的E1-E2区的抗体。还有另一个方面提供一种结合LRP6的两个不同区，诸如LRP6的E1-E2区和E3-E4区的抗体。一方面，这些抗体抑制由Wntl和Wnt3a的组合诱导的fct信号传导。一方面，这些抗体抑制自分泌Wnt信号传导。本发明的一个方面提供一种治疗具有癌症的个体的方法，包括对个体施用有效量的一种结合LRP6且抑制由选自Wnt3和Wnt3a的Wnt同等型诱导的信号传导的分离的抗体 和一种结合LRP6且抑制由选自Wnt l、2、2b、6、8a、9a、9b和IOb的Wnt同等型诱导的信号传导的分离的抗体。本发明的另一个方面提供一种治疗具有癌症的个体的方法，包括对个体施用有效量的一种结合LRP6且抑制由Wnt3和Wnt3a诱导的信号传导的分离的抗体和一种结合LRP6且抑制由Wnt l、2、2b、6、8a、9a、9b和IOb诱导的信号传导的分尚的抗体。本发明的另一个方面提供一种治疗具有癌症的个体的方法，包括对个体施用有效量的一种结合LRP6且抑制由Wnt3和Wnt3a诱导的信号传导的分离的抗体和一种结合LRP6且抑制由Wnt l、2、2b、4、6、7a、7b、8a、9a、9b、IOa和IOb诱导的信号传导的分离的抗体。本发明的一个方面提供一种治疗具有骨骼病症，诸如骨质疏松、骨关节炎、骨折和骨损伤的个体的方法，包括对个体施用有效量的本文所述抗LRP6抗体。本发明的另一个方面提供一种在个体中强化由一种Wnt同等型诱导的Wnt信号传导，包括对个体施用有效量的本文所述抗LRP6抗体和该Wnt同等型以强化由该Wnt同等型诱导的fct信号传导。还提供特异性抗LRP6抗体，包括双特异性抗LRP6抗体。在一个实施方案中，结合LRP6的分离的抗体包含VH，该VH包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID N0:13和SEQ ID NO: 15。在一个实施方案中，该抗体进一步包含VL，该VL包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 12。在一个实施方案中，结合LRP6的分离的抗体包含VH，该VH包含与氨基酸序列SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: IUSEQ ID NO: 13和SEQID NO: 15具有至少90%同源性的氨基酸序列。在一个实施方案中，结合LRP6的分离的抗体进一步包含VL，该VL包含与选自下组的氨基酸序列具有至少90%同源性的氨基酸序列SEQ ID NO:10 和 SEQ ID NO:12。在一个实施方案中，抗体是一种结合LRP6的两个不同区的分离的双特异性抗体，其中该抗体包含VH，该VH包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: IU SEQID N0:13和SEQ ID NO: 15。在一个实施方案中，双特异性抗体包含第一 VH和第二 VH，该第一 VH包含氨基酸序列SEQ ID NO: 15，该第二 VH包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO: 9，SEQ ID N0:11和SEQ ID NO: 13。在一个实施方案中，双特异性抗体进一步包含VL，该VL包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 12。在一个实施方案中，结合LRP6的两个不同区的双特异性抗体包含VH，该VH包含与选自下组的氨基酸序列具有至少90%同源性的氨基酸序列SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 11、SEQ ID N0:13、或SEQ ID N0:15。在一个实施方案中，结合LRP6的两个不同区的双特异性抗体包含第一 VH和第二 VH，该第一 VH包含 与氨基酸序列SEQ ID NO: 15具有至少90%同源性的氨基酸序列，该第二 VH包含与选自下组的氨基酸序列具有至少90%同源性的氨基酸序列SEQ ID NO:9, SEQ ID N0:11和SEQ ID N0:13。在一个实施方案中，双特异性抗体进一步包含VL，该VL包含与选自下组的氨基酸序列具有至少90%同源性的氨基酸序列SEQ IDNO:10 和 SEQ ID NO:12。在一个实施方案中，结合LRP6的两个不同区的分离的双特异性抗体包含第一 VH域且包含第二 VH域，该第一 VH域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VH HVR序列(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 17的HVR-Hl ； (b)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 18的HVR-H2 ;和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19的HVR-H3，该第二 VH域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VH HVR序列(d)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 22的HVR-Hl ；
(e)包含氨基酸序列SEQID NO:23的HVR-H2 ;和(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO:24的HVR-H3。在一个实施方案中，结合LRP6的两个不同区的分离的双特异性抗体包含第一 VH域且包含第二 VH域，该第一 VH域包含所有三个来自下述的VH HVR序列(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 17的HVR-Hl ； (b)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 18的HVR-H2 ； (c)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19的HVR-H3，该第二 VH域包含所有三个来自下述的VHHVR序列(d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:22的HVR-Hl ； (e)包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-H2 ;和
(f)包含氨基酸序列SEQID NO:24的HVR-H3。在一个实施方案中，结合LRP6的两个不同区的分离的双特异性抗体包含第一 VH域且包含第二 VH域，该第一 VH域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VH HVR序列(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 17的HVR-Hl ； (b)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 18的HVR-H2 ； (c)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 21的HVR-H3，该第二 VH域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VH HVR序列(d)包含氨基酸序列SEQ ID N0:22的HVR-Hl ； (e)包含氨基酸序列SEQ ID N0:23的HVR-H2 ;和(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 24的HVR-H3。在一个实施方案中，结合LRP6的两个不同区的分离的双特异性抗体包含第一 VH域且包含第二 VH域，该第一 VH域包含所有三个来自下述的VH HVR序列(a)包含氨基酸序列SEQ IDNO: 17的HVR-Hl ； (b)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 18的HVR-H2 ； (c)包含氨基酸序列SEQID NO: 21的HVR-H3，该第二 VH域包含所有三个来自下述的VHHVR序列(d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:22的HVR-Hl ； (e)包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-H2 ;和(f)包含氨基酸序列 SEQ ID NO:24 的 HVR-H3。在一个实施方案中，结合LRP6的两个不同区的分离的双特异性抗体包含第一 VH域且包含第二 VH域，该第一 VH域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VH HVR序列(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20的HVR-Hl ； (b)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 18的HVR-H2 ； (c)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19的HVR-H3，该第二 VH域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VH HVR序列(d)包含氨基酸序列SEQ ID N0:22的HVR-Hl ； (e)包含氨基酸序列SEQ ID N0:23的HVR-H2 ;和(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 24的HVR-H3。在一个实施方案中，结合LRP6的两个不同区的分离的双特异性抗体包含第一 VH域且包含第二 VH域，该第一 VH域包含所有三个来自下述的VH HVR序列(a)包含氨基酸序列SEQ IDNO:20的HVR-Hl ； (b)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 18的HVR-H2 ； (c)包含氨基酸序列SEQID NO: 19的HVR-H3，该第二 VH域包含所有三个来自下述的VHHVR序列(d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:22的HVR-Hl ； (e)包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-H2 ;和(f)包含氨基酸序列 SEQ ID NO:24 的 HVR-H3。在一个实施方案中，上述实施方案中的双特异性抗体进一步包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VL HVR序列(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 25的HVR-Ll ；(b)包含氨基酸序列SEQ ID N0:26的HVR-L2;(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 27的HVR-L3。在一个实施方案中，上述实施方案中的双特异性抗体进一步包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VL HVR序列(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 25的HVR-Ll ； (b)包含氨基酸序列SEQ ID N0:26的HVR-L2;(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 28的HVR-L3。一个实施方案提供一种结合LRP6的两个不同区的分离的双特异性抗体，其中该抗体包含第一 VH和第二 VH，该第一 VH包含氨基酸序列SEQ ID NO: 15，该第二 VH选自下组包含氨基酸序列SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 11和SEQ ID吣:13的￥!1。在一个实施方案中，这种抗体进一步包含VL，该VL包含氨基酸序列SEQ ID N0:10或SEQ ID N0:12。在一个实施方案中，双特异性抗体包含第一 VH和第二 VH和VL，该第一 VH包含氨基酸序列SEQID NO: 15，该第二 VH包含氨基酸序列SEQ ID NO: 9，该VL包含氨基酸序列SEQ ID N0:10o在一个实施方案中，双特异性抗体抑制由选自Wnt3和Wnt3a的Wnt同等型诱导的信号传导且抑制由选自Wnt l、2、2b、6、8a、9a、9b和IOb的Wnt同等型诱导的信号传导。在一个实施方案中，双特异性抗体进一步抑制由选自Wnt 4、7a、7b和IOa的Wnt同等型诱导的信号传导。在一个实施方案中，双特异性抗体抑制自分泌fct信号传导。本发明的一个方面提供一种双特异性抗体,其抑制由选自Wnt3和Wnt3a的Wnt同等型诱导的信号传导且抑制由选自Wnt l、2、2b、6、8a、9a、9b和IOb的Wnt同等型诱导的信号传导。在一个实施方案中，双特异性抗体进一步抑制由选自fct 4、7a、7b和IOa的Wnt同等型诱导的信号传导。本发明的一个方面提供一种抗体，其与本文所述任何抗LRP6抗体，包括双特异性抗体竞争对LRP6的结合。本发明的另一个方面提供一种抗体，其与本文所述双特异性抗体结合相同的两种表位。在一个实施方案中，所述两种表位之一包含LRP6的氨基酸残基R28、E51、D52、V70、S71、E73、L95、S96、D98、E115、R141和N185。在一个实施方案中，所述两种表位之一包含LRP6 的氨基酸残基 R28、E51、D52、V70、S71、E73、L95、S96、D98、E115、R141、N185、R29、W188、K202、P225、H226、S243 和 F266。本发明的另一个方面提供一种分离的核酸，其编码本文所述抗LRP6抗体。另一个方面提供一种宿主细胞，其包含此类核酸。本发明的一个方面提供一种免疫缀合物，其包含本文所述抗LRP6抗体和细胞毒齐U。另一个方面提供一种药物配制剂，其包含本文所述抗LRP6抗体和药学可接受载体。本发明的一个方面提供本文所述抗LRP6抗体，其用作药物。一个方面提供本文所述抗LRP6抗体，其用于治疗癌症或骨骼病症。一个方面提供本文所述抗LRP6抗体，其用于抑制由第一 fct同等型诱导的信号传导及强化由第二 Wnt同等型诱导的信号传导。一个方面提供本文所述抗LRP6抗体在制备药物中的用途，该药物可用于治疗例如癌症或骨骼病症。本发明的一个方面提供一种治疗具有癌症，诸如非小细胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肾癌和前列腺癌的个体的方法，包括对个体施用有效量的本文所述抗LRP6抗体。附图简述图IA。该图显示针对LRP6. E3-E4蛋白的抗体对HEK293细胞中用O. lmg/ml纯化的Wnt3a诱导的Wnt萤光素酶报告物活性的抑制。

图1B。未刺激或用Wnt3a诱导的并用所示LRP6抗体或纯化的蛋白质处理的HEK293细胞Western印迹分析。
图1C。该图显示YW210. 09抗体以与HEK293细胞中的Wnt3a浓度成比例的方式强Kfct报告物基因活性。图2A。该图显示用萤光素酶报告物转染并用LRP6抗体(单独地或组合地)或Fzd8CRD-Fc蛋白处理的PA-I畸胎癌细胞中自分泌Wnt信号传导的浓度依赖性抑制和强化。图2B。该图显示用或不用O. 3mg/ml Wnt3a蛋白处理，并用10mg/mlYW211. 31抗体、抗gD单克隆抗体(阴性对照)或Fzd8CRD-Fc蛋白(阳性对照)处理的PA-I细胞中Wnt诱导的基因SAXl和GADl和Wnt遏制的基因LEFTY2的qPCR表达分析的结果。数据相对于来自不添加(NA)Wnt3a的细胞的样品标准化。图3。该汇总表显示LRP6抗体和Fzd8CRD-Fc蛋白对细胞系中自分泌信号传导的影响。图4A。该图描绘用25yg/ml YW211. 31. 57抗体或Fzd8CRD_Fc蛋白，用和不用(NA) O. 2 μ g/ml Wnt3a处理的四种细胞系中AXIN2mRNA的qPCR表达分析的结果。图4B。该图描绘NCI-H23细胞中Wnt诱导的基因的表达受到YW211. 31. 57强化且受到YW210. 09抗体拮抗(30 μ g/ml)。CD4_Fc蛋白(30 μ g/ml)充当阴性对照。图4C。该图描述M14细胞中Wnt诱导的基因的表达受到YW211. 31. 57强化且受到YW210. 09 抗体拮抗(30 μ g/ml)。图4D。该图显示稳定整合有Wnt萤光素酶报告物的Hs578T细胞中YW211.31.57抗体对Wnt3a刺激的信号传导的浓度依赖性抑制。图4E。该图显示稳定整合有Wnt萤光素酶报告物的Hs578T细胞中YW211.31.57抗体对自分泌Wnt信号传导的浓度依赖性强化。图4F。该图显示用Wnt萤光素酶报告物转染的EKVX细胞展示YW211. 31. 57抗体对自分泌fct信号传导(NA)的强化和对Wnt3a诱导的信号传导的拮抗。图4G。该图显示抗体介导的对自分泌Wnt信号传导的强化受到5 μ g/mlFzd8CRD-Fc 蛋白抑制。图5。稳定整合有Wnt萤光素酶报告物的HEK293或Hs578T细胞系中10mg/ml LRP6抗体或FzdSCRD-Fc蛋白对由转染Wnt同等型的表达构建物诱导的信号传导的影响的汇总表。Wnt萤光素酶报告物的表达相对于细胞数标准化,并另外相对于转染相同表达构建物但不用蛋白质处理的细胞中的水平标准化。图6。10mg/ml LRP6抗体或Fzd8CRD-Fc蛋白对稳定整合有Wnt萤光素酶报告物的HEK293细胞系中信号传导的影响的汇总表。信号传导由转染嵌合蛋白的表达构建物诱导，该嵌合蛋白由fct同等型融合FZD同等型或LRP6组成。Wnt萤光素酶报告物的表达相对于细胞数标准化，并另外相对于转染相同表达构建物但不用蛋白质处理的细胞中的水平标准化。图7。10mg/ml LRP6抗体或抗体组合对稳定整合有Wnt萤光素酶报告物的细胞系中由转染fct同等型的表达构建物诱导的信号传导的影响的汇总表。fct萤光素酶报告物的表达相对于细胞数标准化，并另外相对于转染相同表达构建物但不用蛋白质处理的细胞中的水平标准化。图8A。该图显示YW211.31.57和YW210. 09抗体的组合抑制稳定整合有Wnt萤光素酶报告物的HEK293细胞中的信号传导，该细胞经过转染以表达Wnt3a、Wntl、或Wnt3a和Wntl 二者。显示抗gD抗体和Fzd8CRD-Fc蛋白，分别作为抑制Wnt信号传导的阴性和阳性对照。·图8B。该图显示YW211. 31. 57和YW210. 09抗体的组合强化Hs578T细胞中的自分泌Wnt信号传导。图8C。该图显示YW211. 31. 57和YW210. 09抗体的组合强化EKVX细胞中的自分泌Wnt信号传导。图9A和B。用在链霉亲合素生物传感器上固定化的生物素化LRP6 E1-E4蛋白进行的生物层干涉测定法指示YW211. 31. 57抗体抑制Wnt3a和Wnt9b结合LRP6，而YW210. 09抗体仅抑制fct9b结合。图9C。用较小的非交叠LRP6片段进行的生物层干涉测定法显示Wnt3a结合E3-E4区，而且这种相互作用受到完整或一臂YW211. 31抗体(one-armed YW211. 31 antibody)阻断。图9D。用较小的非交叠LRP6片段进行的生物层干涉测定法显示YW210. 09抗体结合LRP6E1-E2蛋白片段且与Wnt9b结合竞争。图9E。该生物层干涉测定法显示YW211.31.57和YW210. 09抗体在以任一次序序贯添加时能一起结合固定化LRP6. E1-E4蛋白，确认了分开的表位。图10A。该图显示用YW210. 09抗体处理小鼠时MMTV-Wntl同种异体移植物肿瘤生长消退，与用Fzd8CRD-Fc蛋白观察到的相似。图10B。该图显示根据qPCR分析，用完整或一臂YW211. 31抗体处理的小鼠中Ntera-2异种移植物肿瘤展示降低的SP5mRNA表达，但是YW210. 09抗体不然。图10C。该图显示YW210. 09抗体处理培养中的小鼠颅盖外植块显著提高钙化顶骨的骨矿物质密度(BMD)，与RANK-Fc蛋白处理相似，但是YW211. 31. 62抗体不然。图11A。该图显示在大肠杆菌或HEK293细胞中生成的双特异性抗LRP6抗体相似地以浓度依赖性方式抑制HEK293细胞中用O. I μ g/ml纯化的Wnt3a诱导的Wnt萤光素酶报告物活性。IC50值分别为O. 032和O. 014 μ g/ml 0图11B。该图显示所示对照缓冲液(PBS)、抗体、抗体组合、或Fzd8CRD_Fc蛋白(各10 μ g/ml)对稳定整合有Wnt萤光素酶报告物的PA-I和M14细胞和转染有报告物的CAL-51细胞中自分泌Wint信号传导的影响，用所示对照缓冲液(PBS)、抗体、抗体组合、或Fzd8CRD-Fc 蛋白(各 10 μ g/ml)处理，有(C)或无(B)O. I μ g/ml Wnt3a 刺激。
图11C。该图显示所示对照缓冲液(PBS)、抗体、抗体组合、或Fzd8CRD_Fc蛋白(各10 μ g/ml)处理对用O. I μ g/ml Wnt3a刺激的，稳定整合有Wnt萤光素酶报告物的PA-I和M14细胞和转染有报告物的CAL-51细胞的影响。图12。稳定整合有Wnt萤光素酶报告物的HEK293或Hs578T细胞系中抗体或FzdSCRD蛋白(10 μ g/ml)对由转染Wnt同等型的表达构建物诱导的信号传导的影响的汇总表。图13A。有或无Wnt3a转染并用所示抗体或Fzd8CRD_Fc蛋白(5 μ g/ml)处理18小时的HEK293细胞的Western分析。为上部和下部凝胶分别显示β-肌动蛋白或GAPDH蛋白水平，作为样品加载对照。图13Β。显示根据qPCR分析，用30mg/kg LRP6双特异性抗体或Fzd8CRD蛋白但不用对照抗gD抗体处理16小时的SCID-bg小鼠中的M14异种移植物肿瘤展示降低的AXIN2 和APCDDl mRNA表达的图。图14。⑶R H3与LRP6沟的残基相互作用的详细视图，显示由NAVK基序进行的相互作用的重要网络。图15。由CDR Hl, 2，LI, 2和3进行的相互作用的详情。图16。例示性抗LRP6抗体的重链可变区(VH)，显示Kabat⑶R。图17。例示性抗LRP6抗体的轻链可变区(VL)，显示Kabat⑶R。发明详述I.定义出于本文中的目的，“受体人框架”指包含自人免疫球蛋白框架或如下文定义的人共有框架衍生的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)来表述。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和例示性的实施方案。“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中具有一处或多处改变的抗体，与不拥有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。术语“抗LRP6抗体”和“结合LRP6的抗体”指能够以足够亲和力结合LRP6，使得该抗体可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向LRP6的抗体。在一个实施方案中，根据例如通过放射免疫测定法(RIA)的测量，抗LRP6抗体结合无关的、非LRP6的蛋白质的程度小于该抗体对LRP6的结合的约10%。在某些实施方案中，结合LRP6的抗体具有彡I μ M、彡IOOnM,(ΙΟηΜ、彡 InM、彡 O. InM、彡 O. OlnM、或彡 O. OOlnM(例如 10_8M 或更少，例如 KT8M 到 I(T13M,例如10_9M到I(T13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗LRP6抗体结合在来自不同物种的LRP6中保守的LRP6表位。本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体中结合完整抗体结合的抗原的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’ _SH、F(ab’ )2 ;双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv);和由抗体片段形成的多特异性抗体。与参照抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中将参照抗体对其抗原的结合阻断50%或更多的抗体，且相反，参照抗体在竞争测定法中将该抗体对其抗原的结合阻断50%或更多。本文中提供了例示性的竞争测定法。术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长/增殖不受调 控的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤(例如何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤)、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝瘤(h印atoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、夕卜阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)、白血病和其它淋巴增殖性病症、及各种类型的头和颈癌。“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括烧化剂类(alkylating agents),诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide) (CYTOXAN )；横酸焼基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙卩定类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemeIamine)、三乙撑憐酉先胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代憐酉先胺(triethylenethiophosphoramide)和三轻甲蜜胺(trimethylolomelamine);番蒸枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone));δ -9-四氢大麻酌· (tetrahydrocannabinol)(屈大麻酌· (dronabinol)，MARINOL );β -拉帕醌(Iapachone)；拉帕醇(Iapachol);秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinic acid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan) ( HYCAMTIN )、CPT-Il (伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR )、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9_氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin ;CC_1065 (包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin);鬼臼酸(podophyllinicacid);替尼泊苷(teniposide);隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素I和隐藻素8);多拉司他汀(dolastatin) ；duocarmycin (包括合成类似物，KW-2189和CBl-TMl);艾植塞洛素(eleutherobin) ；pancratistatin ；sarcodictyin ;海绵抑素(spongistatin);氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆憐酸胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环憐酉先胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamineoxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆留醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲憐胺(trofosfamide)、尿啼 P定氮芥(uracil mustard);亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(Iomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine);抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素Y II和加利车霉素ω (参见例如 Nicolaou et al.，Angew. Chem Intl. Ed. Engl. , 33:183-186(1994) ) ；CDP323, 一种口服α -4整联蛋白抑制齐[J ;蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A ;埃斯波霉素(esperamicin);以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素 D (dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6_ 二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括 ADRIAMYCIN 、吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、盐酸多柔比星脂质体注射剂(DOXIL )、脂质体多柔比星TLC D-99 (MYOCET )、PEG化脂质体多柔比星(CAELYX )和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcelIomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酷酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤、吉西他滨(gemcitabine) ( GEMZAR )、替加氟(tegafur) ( UFTORAL )、卡培他滨(capecitabine) (XEL.ODA )、埃坡霉素(epothilone)和 5_ 氟尿啼P定(5-FU);叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate) ; 票呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-疏基票呤(mercaptopurine)、硫咪票呤(thiamiprine)、硫鸟 P票呤(thioguanine)；啼卩定类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6_氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifIuridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(fIoxuridine);雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄焼(mepitiostane)、睾内酯(testolactone);抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid);醋葡醒内酯(aceglatone);醒磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside);氨基乙酉先丙酸(aminolevulinic acid);恩尿啼唳(eniluracil);安口丫P定(amsacrine) ；bestrabucil ;比生群(bisantrene);依达曲沙(edatraxate)；地憐酉先胺(defosfamide);地美可辛(demecolcine);地口丫酉昆(diaziquone) ；elfornithine ；依利醋铵(elliptinium acetate) ;epothilone ;依托格鲁(etoglucid);硝酸镓；轻脲(hydroxyurea);香燕多糖(Ientinan);氯尼达明(Ionidamine);美登木素生物减类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone);米托蒽醌(mitoxantrone);莫哌达醇(mopidamol) ； 二胺硝口丫 P定(nitracrine);喷司他丁 (pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet)；卩比柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(Iosoxantrone) ;2_ 乙基酸月井(ethylhydrazide);丙卡巴餅(procarbazine) ； PSK 多糖复合物(JHS Natural Products, Eugene, OR);雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西索菲兰(sizof iran);螺方定错(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid);三亚胺醌(triaziquone) ；2, 2 !，2"-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、抚孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin));乌拉坦(urethan);长春地辛(vindesine) ( ELD 丨 SINE , F1LDES1N ):达卡巴嗪(dacarbazine);甘露醇氮芥(mannomustine) ; 二溴甘露醇(mitobronitol) ; 二溴卫矛醇(mitolactol);哌泊溴焼(pipobroman) ;gacytosine ;阿糖胞苷(arabinoside) (“Ara_C”)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel) ( TAXOL )、清蛋白改造的纳米颗粒剂型帕利他塞(ABRAXANETM)和多西他塞(doxetaxel) ( TAXOTERE' );苯丁酸氮芥(chlorambucil) ;6_ 硫鸟票呤(thioguanine);疏基票呤(mercaptopurine)；甲·氨蝶呤(methotrexate);钼类似物，诸如顺钼(cisplatin)、奥沙利钼(oxaliplatin)(例如ELOXATIN )和卡钼(carboplatin);长春药类(vincas)，其阻止微管蛋白聚合形成微管，包括长春碱(vinblastine) (VELBAN )、长春新碱(vincristine) (ONCOVIN )、长春地辛(vindesine) (ELDISINE , FILDESIN )和长春瑞滨(vinorelbine) (NAVELBiNΕ )；依托泊音(etoposide) (VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide);米托蒽酉昆(mitoxantrone);亚叶酸(Ieucovorin)；能灭瘤(novantrone);依达曲沙(edatrexate);道诺霉素(daunomycin);氨基蝶呤(aminopterin);伊本勝酸盐(ibandronate);拓扑异构酶抑制剂RFS 2000 ； 二氟甲基鸟氨酸(DMFO);类维A酸(retinoids)，诸如维A酸(retinoic acid)，包括贝沙罗汀(bexarotene) (TARGRETINOi))； . ·.膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如BONEFOS 或OSTAC )、依替膦酸钠(etidronate) ( DIDROCAL )、\E_58095、唑来膦酸 / 唑来膦酸盐(zoledronicacid/zoledronate) ( ZOMETA )、阿伦膦酸盐(alendronate) (FOSAMAX )、帕米膦酸盐(pamidronate) ( AREDIA )、替鲁膦酸盐(tiludronate) ( SKELID )或利塞膦酸盐(risedronate) ( ACTONEL );以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉异常细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC- a、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R);疫苗，诸如THERATOPE 疫苗和基因疗法疫苗，例如AIXOVECTIN 疫苗、;LEUVECTIN 疫苗和VAXID 疫苗；拓扑异构酶I抑制剂(例如 LURTOTECAN ) ;rmRH (例如 ABARELIX ) ；BAY439006 (soraf enib; Bayer)；SU-11248 (sunitinib, SUTENT ，Pfizer);哌立福辛(perifosine)，C0X-2 抑制剂(如塞来考昔(celecoxib)或艾托考昔(etoricoxib))，蛋白体抑制剂(例如PS341)；bortezomib ( VELCADE ); CCI-779 ；tipifarnib (R11577) ；orafenib, ABT510 ;Bcl_2抑制剂，诸如 oblimersen sodium ( GENASENSΕ )； pixantrone ；EGFR 抑制剂(见下文定义)；酪氨酸激酶抑制剂(见下文定义)；丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂，诸如雷帕霉素(rapamycin) (sirolimus, RAPAMLiNE );法尼基转移酶抑制剂,诸如 lonafarnib (SCH6636, SARASARTM);及任何上述各项的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或更多种上述各项的组合，诸如CHOP (环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX (奥沙利钼(EL0XATIN )联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。如本文中定义的，化疗剂包括起调节、降低、阻断或抑制可促进癌生长的激素效果作用的“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”类。它们自身可以是激素，包括但不限于具有混合的激动剂/拮抗剂特性的抗雌激素类，包括他莫昔芬(tamoxifen) (NOLVADEX)、4-轻基他莫昔芬、托瑞米芬(toremifene) (FARES ΓΟΝ⑧)、艾多昔芬(idoxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、雷洛昔芬(raloxifene) (EVISTA )、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)，和选择性雌激素受体调节剂类(SERM)，诸如SERM3 ;没有激动剂特性的纯的抗雌激素类，诸如氟维司群(fulvestrant) (FASLODEX ^PEM800 (此 类药剂可阻断雌激素受体(ER) 二聚化、抑制DNA结合、提高ER周转和/或遏制ER水平)；芳香酶抑制剂类，包括类固醇芳香酶抑制剂类，诸如福美坦(formestane)和依西美坦(exemestane) (AROMASIN )，和非类固醇芳香酶抑制剂类，诸如阿那曲唑(anastrozole) (ARIMIDEX )、来曲卩坐(Ietrozole) (FEMARA )和氛鲁米特(aminoglutethimide),和其它芳香酶抑制剂类，包括伏氯唑(vorozole) (RI VIS OR )、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate) (MEGASE⑧)、法倔唑(fadrozole)和 4(5)-咪
唑；促黄体生成激素释放激素激动剂类，包括亮丙瑞林(leuprolide) ( LUPRON
和ELIGARD )、戈舍瑞林(goserelin)、布舍瑞林(buserelin)和曲普瑞林(triptorelin);性类固醇类(sex steroids),包括妊娠素类(progestine),诸如醋酸甲地孕酮和醋酸甲轻孕酮(medroxyprogesterone acetate),雌激素类,诸如二乙基己烯雌酹(diethylstiIbestrol)和普雷马林(premarin),和雄激素类/类视黄酸类,诸如氟甲睾酮(fluoxymesterone)、所有反式视黄酸(transretionic acid)和芬维 A 胺(fenretinide)；奥那司酮(onapristone);抗孕酮类；雌激素受体下调剂类(ERD);抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide);及任何上述物质的药剂学可接受的盐、酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的组合。术语“嵌合”抗体指其中的重和/或轻链的一部分自特定的来源或物种衍生，而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体。抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5大类IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1' IgG2, IgG3、IgG4, IgA1和IgA2。与不同类免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、Y和μ。在用于本文时，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y9°、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素);化学治疗剂或药物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；及下文公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。“效应器功能”指那些可归于抗体Fe区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括Clq结合和补体依赖性细胞毒性(CDC) ；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC);吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。药剂(例如药物配制剂)的“有效量”指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。本文中的术语“Fe区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区一部分的C端 区。该术语包括天然序列Fe区和变体Fe区。在一个实施方案中，人IgG重链Fe区自Cys226，或自Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fe区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定，Fe区或恒定区中的氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，又称作EU 索弓 I,如记载于 Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991。“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。一般地，可变域的FR由4个FR域组成FR1、FR2、FR3和FR4。因而，HVR和FR序列在VH (或VL)中一般以如下的顺序出现:FR1-H1 (LI) -FR2-H2 (L2) -FR3-H3 (L3) -FR4。 术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，指与天然抗体结构具有基本上类似的结构或者具有含有如本文中所限定的Fe区的重链的抗体。术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已经导入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。本文中包括具有与在初始转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。通常，序列亚组是如 Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，NIHPublication 91-3242，Bethesda MD(1991),第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组κ I。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组III。“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有HVR (例如，CDR)对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体，例如非人抗体的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。在用于本文时，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的和/或形成结构上限定的环(“高变环”)的每个区。一般地，天然的4链抗体包含6个HVR;三个在VH中(HI、H2、H3)，且三个在VL中(LI、L2、L3)。HVR 一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后一种是最高序列变异性的和/或牵涉抗原识另U。例示性的高变环存在于氨基酸残基26-32 (LI)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (Hl)、53-55 (H2)和 96-101 (H3)。(Chothia 和 Les k, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。例示性的 CDR (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-Hl、CDR-H2 和 CDR-H3)存在于 LI 的氨基酸残基 24-34、L2 的 50-56、L3 的 89-97、Hl 的 31_35B、H2 的 50-65 和 H3 的 95-102 (Kabat 等，Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第 5 版 Public Health Service, NationalInstitutes of Health, Bethesda, MD(1991))。除了 VH 中的 CDRl 外，CDR—般包含形成高变环的氨基酸残基。⑶R还包含“特异性决定残基”，或“SDR”，其是接触抗原的残基。SDR包含在称作缩短的-⑶R，或a-⑶R的⑶R区内。例示性的a-⑶R (a_⑶R-Ll、a_⑶R-L2、 a-CDR-L3、a-CDR-Hl、a-CDR-H2 和 a_CDR-H3)存在于 LI 的氨基酸残基 31-34、L2 的 50-55、L3 的 89-96、Hl 的 31-35B、H2 的 50-58 和 H3 的 95-102 (见 Almagro 和 Fransson, Front.Biosci. 13:1619-1633(2008)) ο除非另有指示，可变域中的HVR残基和其它残基(例如，FR残基)在本文中依照Kabat等，见上文编号。“免疫缀合物”指与一种或多种异源分子，包括但不限于细胞毒剂缀合的抗体。“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如，牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类诸如猴)、家兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。“分离的”抗体指已经与其天然环境的组分分开的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95%或99%的纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述，见例如 Flatman 等,J. Chromatogr. B848:79-87 (2007)。“分离的”核酸指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但是核酸分子在染色体外或在与其天然染色体位置不同的染色体位置处存在。“编码抗LRP6抗体的分离的核酸”指编码抗体重和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括单一载体或不同载体中的此类核酸分子，和存在于宿主细胞中的一个或多个位置的此类核酸分子。在用于本文时，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特性，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。“裸抗体”指未与异源模块(例如细胞毒性模块)或放射性标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物配制剂中。“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150，000道尔顿的异四聚糖蛋白，由二硫化物键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，又称作可变重域或重链可变域，接着是三个恒定域(CHI、CH2和CH3)。类似地，从N至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，又称作可变轻域或轻链可变域，接着是一个恒定轻(CL)域。根据其恒定域氨基酸序列，抗体轻链可归入两种类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包含的用法说明书，其含有关于涉及此类治疗产品应用的适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信 肩、O关于参照多肽序列的“百分比(%)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定用于比对序列的合适参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech, Inc.编写，并且源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(US Copyright Office, WashingtonD. C.，20559)，其中其以美国版权注册号TXU510087注册。公众自Genentech, Inc.，SouthSan Francisco, California可获得ALIGN-2程序,或者可以从源代码编译。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统，包括数码UNIX V4. OD上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算分数X/Y 乘 100其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。应当领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。术语“药物配制剂”指处于如下的形式，使得容许其中含有的活性成分的生物学活性是有效的，且不含对会接受配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的别的组分的制剂。
“药学可接受载体”指药物配制剂中与活性成分不同的，且对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂、或防腐剂。在用于本文时，术语“LRP6”指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然，除非另有说明。该术语涵盖“全长”，未加工的LRP6以及LRP6因细胞中的加工所致的任何形式。该术语还涵盖LRP6的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。一种例示性人LRP6的氨基酸序列显示于SEQ IDNO: 29。还可参见 NCBI 登录号 AAI43726 ；Strausberg, R. L. , et al. , Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 99:16899-16903 (2002) ；He, X. , et al. , Development, 131:1663-1677 (2004)；Chen, Μ. , et al. , J. Biol. Chem. , 284:35040-35048 (2009)。在用于本文时，“治疗/处理”(及其语法变型)指试图改变所治疗个体的天然过程的临床干预，并且可以为了预防或者在临床病理学的过程期间实施。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减轻/减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展速率、改善或减轻疾病状态和消退或改善的预后。在一些实施方案中，使用本发明的抗体来延迟疾病的形成或减缓疾病的进展。·术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链可变域(分别为VH和VL) —般具有类似的结构,其中每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR) ο (见例如Kindt等Kuby Immunology,第6版，W.
H.Freeman and Co.,第91页(2007))。单个VH或VL域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL域筛选互补VL或VH域的文库来分离结合特定抗原的抗体。见例如，Portolano 等,J. Immunol. 150:880-887 (1993) ; Clarkson等，Nature352:624-628 (1991)。在用于本文时，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及整合入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。II.组合物和方法本发明提供具有出乎意料的能力，即抑制一些Wnt同等型的信号传导及强化其它同等型的信号传导的抗LRP6抗体。如实施例中描述的,表征的两种抗LRP6抗体进一步显示对大多数Wnt的相反活性，其中一种抗体拮抗而另一种强化。这两种抗体结合LRP6的不同区(正如不同fct同等型)，而且对信号传导的抑制源自阻断Wnt结合。基于它们与本发明抗LRP6抗体的功能相互作用，测试的14种Wnt同等型可分组成三类Wnt3和Wnt3a受到抗LRP6抗体YW211. 31的抑制且受到抗LRP6抗体YW210. 09的强化；ffnt 1、2、2B、6、8A、9A、9B和10B受到抗LRP6抗体YW211. 31的强化且受到抗LRP6抗体YW210. 09的拮抗；而Wnt 4、7A、7B和10A受到抗LRP6抗体YW211. 31的强化且不受抗LRP6抗体YW210.09抑制(图3C)。这些分类显然与建议的Wnt基因系统发生不符，尽管Wnt3/3a亚家族是进化上最趋异的(Cho et al.，2010)。抑制不同类的Wnt同等型的抗LRP6抗体的组合可用于为治疗与fct信号传导有关的疾病提供有效治疗剂。抗体介导的LRP6 二聚化只能在Wnt同等型也能够结合复合物时强化信号传导，大概是募集FZD。不同肿瘤细胞系中的内源自分泌Wnt信号传导能被LRP6抗体拮抗或增强。共同受体-配体相互作用的这种复杂性可容许差异调节fct同等型的信号传导，而且可利用抗体来差异操作特定组织或疾病状态中的Wnt信号传导。在一些实施方案中，抗LRP6抗体能抑制一些细胞类型中的自分泌或内源Wnt信号传导及强化其它细胞类型中的自分泌信号传导。在一些实施方案中，抗LRP6抗体介导LRP6二聚化且在同时结合LRP6的Wnt同等型存在下增强或强化信号传导。在一些实施方案中，抗LRP6抗体通过抑制Wnt拮抗剂，诸如DKK同等型和SOST的结合来强化Wnt信号传导。抗LRP6抗体可用于选择性调控受到W nt同等型诱导的信号传导激活或抑制的过程。此类过程包括例如不同癌症类型中的细胞增殖、细胞命运规范(specification)和干细胞自我更新，和发育过程。抗LRP6可用于例如治疗Wnt介导的病症，诸如癌症和骨或骨骼系统的病症和血管病症。可使用抗LRP6抗体治疗的癌症的例子包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤O^patoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(包括肾细胞癌)、肝癌、前列腺癌。可使用抗LRP6抗体治疗的骨骼或骨病症的例子包括骨质疏松、骨关节炎、骨折和骨损伤。可使用抗LRP6抗体治疗的血管病症的例子包括视网膜血管病诸如诺里(Norrie)病、骨质疏松-假胶质瘤综合征(OPPG)、家族性渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)、早产儿视网膜病(ROP)、糖尿病视网膜病、老年性黄斑变性、早产儿视网膜病、冠茨(Coats)氏病和冠茨氏样反应和视网膜动脉或静脉阻塞和心肌相关状况，诸如心肌梗死和缺血性心脏病。因而，本发明的一个方面提供结合LRP6的抗体，其中该抗体抑制由一种Wnt同等型诱导的信号传导且强化由另一种fct同等型诱导的信号传导。在一个实施方案中，抗体抑制Wnt3和/或Wnt3a的信号传导。在一个实施方案中，抗体强化Wnt l、2、2b、4、6、7a、7b、8a、9a、9b、IOa和/或IOb的信号传导。在一个实施方案中，抗体抑制fct3和/或Wnt3a的信号传导且强化Wnt l、2、2b、4、6、7a、7b、8a、9a、9b、IOa和/或IOb的信号传导。在一个实施方案中，抗体抑制Wnt3和Wnt3a的信号传导且强化Wnt l、2、2b、4、6、7a、7b、8a、9a、9b、IOa和IOb的信号传导。在一个实施方案中，抗LRP6抗体结合LRP6的E3-E4区(第一个和第二个β -螺旋)。在另一个实施方案中，抗体抑制Wnt 1、2、2^6、8&、9&、％和/或1013的信号传导。在一个实施方案中，抗体强化fct3和/或Wnt3a的信号传导。在一个实施方案中，抗体抑制Wnt l、2、2b、6、8a、9a、9b和/或IOb的信号传导且强化Wnt3和/或Wnt3a的信号传导。在一个实施方案中，抗体抑制Wnt l、2、2b、6、8a、9a、9b和/或IOb的信号传导且强化Wnt3和/或Wnt3a的信号传导。在一个实施方案中，抗LRP6抗体结合LRP6的E1-E2区(第三个和第四个 β -螺旋(beta-propeller))。本发明的另一个方面提供多特异性抗LRP6抗体。如实施例中显示的，在一些实施方案中，多特异性抗体具有抑制所有三类Wnt同等型的好处。在一个实施方案中，抗LRP6抗体是能够结合LRP6的两个或更多个不同区或表位的多特异性抗体。在一个实施方案中，多特异性抗体是能够特异性结合LRP6的两个不同区的双特异性抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体结合LRP6的E1-E2区且结合LRP6的E3-E4区。在一个实施方案中，多特异性抗体抑制由选自fct3和Wnt3a的Wnt同等型诱导的信号传导且抑制由选自Wntl、2、2b、6、8a、9a、9b和IOb的Wnt同等型诱导的信号传导。在一个实施方案中，多特异性抗体抑制由选自Wnt3和Wnt3a的Wnt同等型诱导的信号传导且抑制由选自Wnt l、2、2b、6、8a、9a、9b和IOb的Wnt同等型诱导的信号传导且进一步抑制由选自Wnt 4、7a、7b和IOa的Wnt同等型诱导的信号传导。在一个实施方案中，多特异性抗体抑制由Wntl和Wnt3a的组合诱导的Wnt信号传导。在一个实施方案中，多特异性抗体抑制自分泌Wnt信号传导。在某些实施方案中，多特异性抗体是抑制由选自Wnt3和Wnt3a的Wnt同等型诱导的信号传导且抑制由选自Wnt l、2、2b、6、8a、9a、9b和IOb的Wnt同等型诱导的信号传导的双特异性抗体。在某些实施方案中，多特异性抗体是抑制由选自fct3和Wnt3a的Wnt同等型诱导的信号传导且抑制由选自Wnt l、2、2b、6、8a、9a、9b和IOb的Wnt同等型诱导的信号传导且进一步抑制由选自fct 4、7a、7b和IOa的Wnt同等型诱导的信号传导的双特异性抗体。在某些实施方案中，多特异性抗体是抑制由fctI和Wnt3a的组合诱导的信号传导的双特异性抗体。在一个实施方案中，多特异性抗体是比与双特异性抗体具有相同特异性的单特异性抗体组合更加有效地抑制由fctl和Wnt3a的组合诱导的信号传导的双特异性抗体。在某些实施方案中，多特异性抗体是比与双特异性抗体具有相同特异性的单特异性抗体组合更加有效地抑制自分泌fct信号传导的双特异性抗体。
在某些实施方案中，抗LRP6抗体或多特异性抗LRP6抗体将Wnt信号传导抑制至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或更多。对Wnt信号传导的抑制可使用本领域已知和本文所述测定法来测定。例如，对fct信号传导的抑制可使用Wnt报告物测定法，诸如实施例中描述的fct萤光素酶报告物测定法来测定。对Wnt信号传导的抑制也可通过监测Wnt靶基因，诸如AP⑶DI、AXIN2、GADI、LEFTY2和SAXl的表达来测定，如实施例中描述的。在某些实施方案中，抗LRP6抗体或多特异性抗LRP6抗体将Wnt靶基因，诸如APCDD1、AXIN2、GADU LEFTY2 和 SAXl 的表达抑制至少约 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%。在一个实施方案中，fct靶基因的表达使用基因表达测定法，诸如PCR，包括qPCR来测定。本发明的另一个方面提供结合LRP6且与本文所述任何抗LRP6抗体竞争结合的抗体。本发明的另一个方面提供与本文所述任何抗LRP6抗体结合LRP6上相同表位的抗体。A.例示性抗LRP6抗体本发明的一个方面提供一种抗LRP6抗体，其是单克隆抗体，包括嵌合的、人源化的或人的抗体。在一个实施方案中，抗LRP6抗体是使用噬菌体文库生成的。在一个实施方案中，抗LRP6抗体是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab ’、scFv、双抗体、或F (ab ’)2片段。在另一个实施方案中，抗体是全长抗体，例如完整IgGl抗体或其它抗体类或同等型，如本文中定义的。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含重链序列，该重链序列包含表2的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含轻链序列，该轻链序列包含表2的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含重链序列和轻链序列，该重链序列和轻链序列包含表2的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含重链序列，该重链序列包含氨基酸序列SEQID NO: I。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含轻链序列，该轻链序列包含氨基酸序列SEQID NO: 2。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含重链序列和轻链序列，该重链序列包含氨基酸序列SEQ ID NO: I，该轻链序列包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含重链序列，该重链序列包含氨基酸序列SEQID N0:3。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含轻链序列，该轻链序列包含氨基酸序列SEQID NO: 4。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含重链序列和轻链序列，该重链序列包含氨基酸序列SEQ ID NO: 3，该轻链序列氨基酸序列SEQ ID N0:4。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含重链序列，该重链序列包含氨基酸序列SEQID N0:5。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含轻链序列，该轻链序列包含氨基酸序列SEQID NO: 6。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含重链序列和轻链序列，该重链序列包含氨基酸序列SEQ ID NO: 5,该轻链序列氨基酸序列SEQ ID N0:6。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含重链序列，该重链序列包含氨基酸序列SEQID N0:7。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含轻链序列，该轻链序列包含氨基酸序列SEQID NO: 8。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含重链序列和轻链序列，该重链序列包含氨基酸序列SEQ ID NO: 7，该轻链序列氨基酸序列SEQ ID N0:8。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含来自表3氨基酸序列的重链可变域(VH)。在·一个实施方案中，抗LRP6抗体包含来自表3氨基酸序列的轻链可变域(VL)。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含来自表3氨基酸序列的VH和VL。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含重链可变域(VH)，该重链可变域(VH)来自氨基酸序列SEQ ID NO: I的重链。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含轻链可变域(VL)，该轻链可变域(VL)来自氨基酸序列SEQ ID N0:2的轻链序列。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含VH和VL，该来自氨基酸序列SEQ ID NO: I的重链，该VL来自氨基酸序列SEQ IDNO:2的轻链序列。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含重链可变域(VH)，该重链可变域(VH)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 9。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含轻链可变域(VL)，该轻链可变域(VL)包含氨基酸序列SEQ ID N0:10o在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO: 9，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO: 10。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含重链可变域(VH)，该重链可变域(VH)来自氨基酸序列SEQ ID N0:3的重链。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含轻链可变域(VL)，该轻链可变域(VL)来自氨基酸序列SEQ ID N0:4的轻链序列。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含VH和VL，该VH来自氨基酸序列SEQ ID NO: 3的重链，该VL来自氨基酸序列SEQID NO:4的轻链序列。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含重链可变域(VH)，该重链可变域(VH)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 11。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含轻链可变域(VL)，该轻链可变域(VL)包含氨基酸序列SEQ ID N0:12。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO: 11，该VL包含氨基酸序列SEQ ID N0:12。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含重链可变域(VH)，该重链可变域(VH)来自氨基酸序列SEQ ID N0:5的重链。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含轻链可变域(VL)，该轻链可变域(VL)来自氨基酸序列SEQ ID N0:6的轻链序列。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含VH和VL，该VH来自氨基酸序列SEQ ID NO: 5的重链，该VL来自氨基酸序列SEQID NO:6的轻链序列。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含重链可变域(VH)，该重链可变域(VH)包含氨基酸序列SEQ ID N0:13。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含轻链可变域(VL)，该轻链可变域(VL)包含氨基酸序列SEQ ID N0:14。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO: 13，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO: 14。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含重链可变域(VH)，该重链可变域(VH)来自氨基酸序列SEQ ID N0:7的重链。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含轻链可变域(VL)，该轻链可变域(VL)来自氨基酸序列SEQ ID N0:8的轻链序列。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含VH和VL，该VH来自氨基酸序列SEQ ID NO: 7的重链，该VL来自氨基酸序列SEQID NO:8的轻链序列。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含重链可变域(VH)，该重链可变域(VH)包含氨基酸序列SEQ ID N0:15。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含轻链可变域(VL)，该轻链可变域(VL)包含氨基酸序列SEQ ID N0:16。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO: 15，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO: 16。本发明的另一个方面提供一种多特异性抗LRP6抗体。在一个实施方案中，多特异 性抗体包含重链,该重链包含SEQ ID N0:USEQ ID NO:3,SEQ ID N0:5、或SEQ ID N0:7中至少一项的氨基酸序列。在一个实施方案中，多特异性抗体包含重链，该重链包含SEQ IDNO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、或SEQ ID NO: 7中至少两项的氨基酸序列。在一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体，其包含重链，该重链包含SEQ ID NOiUSEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5、或SEQ ID NO:7中至少一项的氨基酸序列。在一个实施方案中，双特异性抗体包含第一重链和第二重链，该第一重链包含氨基酸序列SEQ ID NO: 1，该第二重链包含氨基酸序列SEQ ID N0:7。在一个实施方案中，双特异性抗体包含第一重链和第二重链，该第一重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:3，该第二重链包含氨基酸序列SEQ ID N0:7。在一个实施方案中，双特异性抗体包含第一重链和第二重链，该第一重链包含氨基酸序列SEQ IDNO:5，该第二重链包含氨基酸序列SEQ ID N0:7。在一个实施方案中，多特异性抗LRP6抗体包含VH，该VH来自SEQ ID NO: K SEQID NO:3, SEQ ID N0:5、或SEQ ID NO:7中至少一项的氨基酸序列的重链。在一个实施方案中，多特异性抗体包含VH，该VH来自SEQ ID NO: K SEQ ID NO:3, SEQ ID N0:5、或SEQID NO:7中至少两项的氨基酸序列的重链。在一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体，其包含 VH，该 VH 来自氨基酸序列 SEQ ID NO: I、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、或 SEQ IDNO: 7的重链。在一个实施方案中，双特异性抗体包含如下的VH，该VH来自氨基酸序列SEQID NO: I的重链，且包含如下的VH，该VH来自氨基酸序列SEQ ID N0:7的重链。在一个实施方案中，双特异性抗体包含如下的VH，该VH来自氨基酸序列SEQ ID N0:3的重链，且包含如下的VH，该VH来自氨基酸序列SEQ ID N0:7的重链。在一个实施方案中，双特异性抗体包含如下的VH，该VH来自氨基酸序列SEQ ID NO: 5的重链，且包含如下的VH，该VH来自氨基酸序列SEQ ID NO:7的重链。在一个实施方案中，多特异性抗LRP6抗体包含VH，该VH包含SEQ ID N0:9、SEQ IDNO: IUSEQ ID NO: 13、或SEQ ID NO: 15中至少一项的氨基酸序列。在一个实施方案中，多特异性抗体包含 VH，该 VH 包含 SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: IUSEQ ID NO: 13、或 SEQ ID NO: 15中至少两项的氨基酸序列。在一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体，其包含VH，该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID N0:13、或 SEQ ID N0:15。在一个实施方案中，双特异性抗体包含第一 VH和第二 VH，该第一 VH包含氨基酸序列SEQ IDNO: 9，该第二 VH包含氨基酸序列SEQ ID N0:15。在一个实施方案中，双特异性抗体包含第
一VH和第二 VH，该第一 VH包含氨基酸序列SEQ ID NO: 11，该第二 VH包含氨基酸序列SEQID NO: 15。在一个实施方案中，双特异性抗体包含第一 VH和第二 VH，该第一 VH包含氨基酸序列SEQ ID NO: 13，该第二 VH包含氨基酸序列SEQ ID NO: 15。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个、或六个选自下述的HVR : (a) HVR-Hl，其来自表4的HVR-Hl氨基酸序列；(b) HVR-H2，其来自表4的HVR-H2氨基酸序列；(c) HVR-H3，其来自表4的HVR-H3氨基酸序列；(d) HVR-Ll，其来自表4的HVR-Ll氨基酸序列；(e) HVR-L2，其来自表4的HVR-L2氨基酸序列；和(f) HVR-L3，其来自表4的HVR-L3氨基酸序列。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含VH，该VH包含至少一个、两个、三个、四个、五个、或六个选自下述的HVR (a) SEQ ID NO: I的重链的HVR-Hl ； (b) SEQ ID NO: I的重链的HVR-H2 ； (c) SEQ ID NO: I 的重链的 HVR-H3 ； (d) SEQ ID NO: 2 的轻链的 HVR-Ll ； (e) SEQ IDNO: 2 的轻链的 HVR-L2 ;和(f) SEQ ID NO: 2 的轻链的 HVR-L3。 在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的 VH HVR 序列(a) SEQ ID NO: I 的重链的 HVR-Hl ； (b) SEQ ID NO: I 的重链的 HVR-H2 ； (c)SEQ ID NO: I的重链的HVR-H3。在一个实施方案中，抗体包含SEQ ID NO: I的重链的HVR-H3。在另一个实施方案中，抗体包含SEQ ID N0:1的重链的HVR-H3和SEQ ID N0:2的轻链的HVR-L3。在又一个实施方案中，抗体包含SEQ ID NO: I的重链的HVR-H3，SEQ ID N0:2的轻链的HVR-L3和SEQ ID NO: I的重链的HVR-H2。在又一个实施方案中，抗体包含(a) SEQID NO: I 的重链的 HVR-Hl ； (b) SEQ ID NO: I 的重链的 HVR-H2 ;和(c) SEQ ID NO: I 的重链的HVR-H3。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VH HVR序列(a) HVR-Hl，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 17 ; (b) HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:18 ;(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:19。在一个实施方案中，抗体包含HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19。在另一个实施方案中，抗体包含HVR-H3和HVR-L3，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19,该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ IDNO: 27。在又一个实施方案中，抗体包含HVR-H3、HVR-L3和HVR-H2，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID N0:19，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO: 27，该HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO: 18。在又一个实施方案中，抗体包含(a)HVR-Hl，其包含氨基酸序列SEQ IDN0:17 ;(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 18 ;和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQID NO:19。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的 VL HVR 序列(a) SEQ ID NO: 2 的轻链的 HVR-Ll ； (b) SEQ ID NO: 2 的轻链的 HVR-L2 ;和(c)SEQ ID N0:2的轻链的HVR-L3。在一个实施方案中，抗体包含(a) SEQ ID N0:2的轻链的 HVR-Ll ； (b)SEQ ID NO: 2 的轻链的 HVR-L2 ;和(c) SEQ ID NO: 2 的轻链的 HVR-L3。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含(a) VH域，该VH域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VH HVR序列(i)SEQ ID NO: I的重链的HVR-H1，(ii)SEQ ID NO: I的重链的HVR-H2，和(iii)SEQ ID NO: I的重链的HVR-H3 ;和(b) VL域，该VL域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VL HVR序列(i)SEQ ID NO:2的轻链的HVR-Ll，(ii)SEQ ID N0:2 的轻链的 HVR-L2，和(c) SEQ ID NO: 2 的轻链的 HVR-L3。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含(a) VH域，该VH域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VH HVR序列(i) HVR-Hl，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 17,(ii)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:18，和(iii)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ IDNO: 19;和(b) VL域，该VL域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VL HVR序列(i)HVR-Ll，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:25, (ii)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:26,(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列 SEQ ID N0:27。另一方面，本发明提供一种抗体，其包含(a) SEQ ID NO: I的重链的HVR-Hl ; (b)SEQ ID NO: I 的重链的 HVR-H2 ； (c) SEQ ID NO: I 的重链的 HVR-H3 ； (d) SEQ ID NO: 2 的轻链的 HVR-Ll ； (e)SEQ ID NO: 2 的轻链的 HVR-L2 ;和(f) SEQ ID NO: 2 的轻链的 HVR-L3。另一方面，本发明提供一种抗体，其包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ IDN0:17 ;(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 18 ; (c) HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ IDNO: 19 ;(d)HVR-Ll，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 25 ; (e) HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:26 ;和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:27。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个、或六个选自下述的 HVR (a) SEQ ID NO: 3 的重链的 HVR-Hl ； (b) SEQ ID NO: 3 的重链的 HVR-H2 ； (c)SEQ ID N0:3 的重链的 HVR-H3 ;(d)SEQ ID NO: 4 的轻链的 HVR-Ll ； (e) SEQ ID NO: 4 的轻链的 HVR-L2 ;和(f)SEQ ID NO:4 的轻链的 HVR-L3。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的 VH HVR 序列(a) SEQ ID NO: 3 的重链的 HVR-Hl ； (b) SEQ ID NO: 3 的重链的 HVR-H2 ； (c)SEQ ID NO:3的重链的HVR-H3。在一个实施方案中，抗体包含SEQ ID N0:3的重链的HVR-H3。在另一个实施方案中，抗体包含SEQ ID N0:3的重链的HVR-H3和SEQ ID N0:4的轻链的HVR-L3。在又一个实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:3的重链的HVR-H3，SEQ ID NO:4的轻链的HVR-L3，和SEQ ID NO: 3的重链的HVR-H2。在又一个实施方案中，抗体包含(a) SEQID NO: 3 的重链的 HVR-Hl ； (b) SEQ ID NO: 3 的重链的 HVR-H2 ;和(c) SEQ ID NO: 3 的重链的HVR-H3。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VH HVR序列(a)HVR-Hl，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 17 ; (b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:18 ;(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 21。在一个实施方案中，抗体包含HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:21。在另一个实施方案中，抗体包含重链HVR-H3和HVR-L3，该重链HVR-H3为SEQ ID NO: 21，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO: 28。在又一个实施方案中，抗体包含HVR-H3、HVR-L3和HVR-H2，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ IDN0:21，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO: 28，该HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO: 18。在又一个实施方案中，抗体包含(a)HVR-Hl，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 17 ； (b)HVR-H2,其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 18;和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:21。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的 VL HVR 序列(a) SEQ ID NO: 4 的轻链的 HVR-Ll ; (b) SEQ ID NO: 4 的轻链的 HVR-L2 ;和
(c)SEQ ID N0:4的轻链的HVR-L3。在一个实施方案中，抗体包含(a) SEQ ID NO: 4的轻链的 HVR-Ll ； (b)SEQ ID NO: 4 的轻链的 HVR-L2 ;和(c) SEQ ID NO: 4 的轻链的 HVR-L3。
在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VL HVR序列(a)HVR-Ll，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 25 ; (b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:26 -M (c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:28。在一个实施方案中，抗体包含(a) HVR-Ll，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 25 ; (b) HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:26 -M (c)HVR-L3，其包含氨基酸序列 SEQ ID N0:28。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含(a) VH域，该VH域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VH HVR序列(i)SEQ ID NO: 3的重链的HVR-Hl，(ii)SEQ ID NO: 3的重链的HVR-H2，和(iii)SEQ ID NO: 3的重链的HVR-H3 ;和(b) VL域，该VL域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VL HVR序列(i)SEQ ID NO:4的轻链的HVR-Ll，(ii)SEQ ID N0:4 的轻链的 HVR-L2，和(c) SEQ ID NO: 4 的轻链的 HVR-L3。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含(a) VH域，该VH域包含至少一个、至少两 个、或所有三个选自下述的VH HVR序列(i) HVR-Hl，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 17,(ii)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:18，和(iii)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ IDN0:21;和(b) VL域，该VL域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VL HVR序列(i)HVR-Ll，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:25, (ii)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:26，和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:28。另一方面，本发明提供一种抗体，其包含(a) SEQ ID NO: 3的重链的HVR-Hl ; (b)SEQ ID N0:3 的重链的 HVR-H2 ;(c)SEQ ID NO: 3 的重链的 HVR-H3 ; (d) SEQ ID NO: 4 的轻链的 HVR-Ll ； (e) SEQ ID NO: 4 的轻链的 HVR-L2 ;和(f) SEQ ID NO: 4 的轻链的 HVR-L3。另一方面，本发明提供一种抗体，其包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ IDN0:17 ;(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 18 ; (c) HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ IDNO: 21 ;(d)HVR-Ll，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 25 ; (e) HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:26 ;和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:28。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个、或六个选自下述的 HVR (a) SEQ ID NO: 5 的重链的 HVR-Hl ； (b) SEQ ID NO: 5 的重链的 HVR-H2 ； (c)SEQ ID N0:5 的重链的 HVR-H3 ;(d)SEQ ID NO: 6 的轻链的 HVR-Ll ； (e) SEQ ID NO: 6 的轻链的 HVR-L2 ;和(f)SEQ ID NO:6 的轻链的 HVR-L3。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的 VH HVR 序列(a) SEQ ID NO: 5 的重链的 HVR-Hl ； (b) SEQ ID NO: 5 的重链的 HVR-H2 ； (c)SEQ ID NO:5的重链的HVR-H3。在一个实施方案中，抗体包含SEQ ID N0:5的重链的HVR-H3。在另一个实施方案中，抗体包含SEQ ID N0:5的重链的HVR-H3和SEQ ID N0:6的轻链的HVR-L3。在又一个实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:5的重链的HVR-H3，SEQ ID NO:6的轻链的HVR-L3，和SEQ ID NO: 5的重链的HVR-H2。在又一个实施方案中，抗体包含(a) SEQID NO: 5 的重链的 HVR-Hl ； (b) SEQ ID NO: 5 的重链的 HVR-H2 ;和(c) SEQ ID NO: 5 的重链的HVR-H3。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VH HVR序列(a) HVR-Hl，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20 ; (b) HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:18 ;(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:19。在一个实施方案中，抗体包含HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19。在另一个实施方案中，抗体包含HVR-H3和HVR-L3，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19,该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ IDNO: 27。在又一个实施方案中，抗体包含HVR-H3、HVR-L3和HVR-H2，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19,该HVR-L3包含氨基酸序列SEQID NO: 27，该HVR-H2包含氨基酸序列SEQID NO: 18ο在又一个实施方案中，抗体包含(a)HVR-Hl，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:20 ；
(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQID NO: 18 -M (c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:19。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的 VL HVR 序列(a) SEQ ID NO: 6 的轻链的 HVR-Ll ; (b) SEQ ID NO: 6 的轻链的 HVR-L2 ;和
(c)SEQID N0:6的轻链的HVR-L3。在一个实施方案中，抗体包含(a) SEQ ID NO: 6的轻链的 HVR-Ll ； (b)SEQ ID NO: 6 的轻链的 HVR-L2 ;和(c) SEQ ID NO: 6 的轻链的 HVR-L3。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含(a) VH域，该VH域包含至少一个、至少两个、 或所有三个选自下述的VH HVR序列(i)SEQ ID NO: 5的重链的HVR-Hl，(ii)SEQ ID NO: 5的重链的HVR-H2，和(iii)SEQ ID NO: 5的重链的HVR-H3 ;和(b) VL域，该VL域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VL HVR序列(i)SEQ ID NO:6的轻链的HVR-Ll，(ii)SEQ ID N0:6 的轻链的 HVR-L2，和(c) SEQ ID NO: 6 的轻链的 HVR-L3。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含(a) VH域，该VH域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VH HVR序列(i) HVR-Hl，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20,(ii)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:18，和(iii)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ IDNO: 19;和(b) VL域，该VL域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VL HVR序列(i)HVR-Ll，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:25, (ii)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:26，和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:27。另一方面，本发明提供一种抗体，其包含(a) SEQ ID NO: 5的重链的HVR-Hl ; (b)SEQ ID N0:5 的重链的 HVR-H2 ;(c)SEQ ID NO: 5 的重链的 HVR-H3 ; (d) SEQ ID NO: 6 的轻链的 HVR-Ll ； (e)SEQ ID NO: 6 的轻链的 HVR-L2 ;和(f) SEQ ID NO: 6 的轻链的 HVR-L3。另一方面，本发明提供一种抗体，其包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ IDN0:20 ;(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 18 ; (c) HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ IDNO: 19 ;(d)HVR-Ll，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 25 ; (e) HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:26 ;和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:27。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含至少一个、两个、三个、四个、五个、或六个选自下述的 HVR (a) SEQ ID NO: 7 的重链的 HVR-Hl ； (b) SEQ ID NO: 7 的重链的 HVR-H2 ； (c)SEQ ID N0:7 的重链的 HVR-H3 ;(d)SEQ ID NO: 8 的轻链的 HVR-Ll ; (e) SEQ ID NO: 8 的轻链的 HVR-L2 ;和(f)SEQ ID NO:8 的轻链的 HVR-L3。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的 VH HVR 序列(a) SEQ ID NO: 7 的重链的 HVR-Hl ； (b) SEQ ID NO: 7 的重链的 HVR-H2 ； (c)SEQ ID NO:7的重链的HVR-H3。在一个实施方案中，抗体包含SEQ ID N0:7的重链的HVR-H3。在另一个实施方案中，抗体包含SEQ ID N0:7的重链的HVR-H3和SEQ ID N0:8的轻链的HVR-L3。在又一个实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:7的重链的HVR-H3，SEQ ID NO:8的轻链的HVR-L3，和SEQ ID NO: 7的重链的HVR-H2。在又一个实施方案中，抗体包含(a) SEQID NO: 7 的重链的 HVR-Hl ； (b) SEQ ID NO: 7 的重链的 HVR-H2 ;和(c) SEQ ID NO: 7 的重链的HVR-H3。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VH HVR序列(a) HVR-Hl，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 22 ; (b) HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:23 ;(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 24。在一个实施方案中，抗体包含HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:24。在另一个实施方案中，抗体包含HVR-H3和HVR-L3，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO: 24,该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ IDNO: 27。在又一个实施方案中，抗体包含HVR-H3、HVR-L3和HVR-H2，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID N0:24，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO: 27，该HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO:23。在又一个实施方案中，抗体包含(a)HVR-Hl，其包含氨基酸序列SEQ IDN0:22 ;(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 23 ;和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQID NO:24。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的 VL HVR 序列(a) SEQ ID NO: 8 的轻链的 HVR-Ll ; (b) SEQ ID NO: 8 的轻链的 HVR-L2 ;和
(c)SEQID N0:8的轻链的HVR-L3。在一个实施方案中，抗体包含(a) SEQ ID NO: 8的轻链的 HVR-Ll ； (b)SEQ ID NO: 8 的轻链的 HVR-L2 ;和(c) SEQ ID NO: 8 的轻链的 HVR-L3。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含(a) VH域，该VH域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VH HVR序列(i)SEQ ID NO: 7的重链的HVR-H1，(ii)SEQ ID NO: 7 的重链的HVR-H2，和(iii)SEQ ID NO: 7的重链的HVR-H3 ;和(b) VL域，该VL域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VL HVR序列(i)SEQ ID NO:8的轻链的HVR-Ll，(ii)SEQ ID N0:8 的轻链的 HVR-L2，和(c) SEQ ID NO: 8 的轻链的 HVR-L3。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含(a) VH域，该VH域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VH HVR序列(i) HVR-Hl，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:22,(ii)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:23，和(iii)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ IDN0:24;和(b) VL域，该VL域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VL HVR序列(i)HVR-Ll，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:25, (ii)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:26，和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:27。在另一个实施方案中，本发明提供一种抗体，其包含(a)SEQ ID N0:7的重链的HVR-Hl ； (b)SEQ ID NO: 7 的重链的 HVR-H2 ； (c) SEQ ID NO: 7 的重链的 HVR-H3 ； (d) SEQ IDNO:8 的轻链的 HVR-Ll ;(e) SEQ ID NO:8 的轻链的 HVR-L2 ;和(f) SEQ ID N0:8 的轻链的HVR-L3。在另一个实施方案中，本发明提供一种抗体，其包含(a) HVR-Hl，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:22 ;(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:23 ; (c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:24 ;(d)HVR-Ll，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:25 ; (e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:26 ;和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:27。在一个实施方案中，抗LRP6抗体是多特异性抗LRP6抗体，其包含第一 VH域，该第
一VH域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VHHVR序列(a) SEQ ID NO: I的重链的 HVR-Hl ； (b) SEQ ID NO: I 的重链的 HVR-H2 ； (c) SEQ ID NO: I 的重链的 HVR-H3,且包含第二 VH域，该第二 VH域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VH HVR序列
(d)SEQID NO: 7 的重链的 HVR-Hl ;(e) SEQ ID NO: 7 的重链的 HVR-H2 ; (f) SEQ ID NO: 7 的重链的HVR-H3。在一个实施方案中，抗LRP6抗体是多特异性抗LRP6抗体，其包含第一 VH域，该第
一VH域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VHHVR序列(a) HVR-Hl，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 17 ; (b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 18 ; (c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19，且包含第二 VH域，该第二 VH域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VH HVR序列(d)HVR-Hl，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 22 ; (e)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:23 ;(f)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:24。在一个实施方案中，抗LRP6抗体是多特异性抗LRP6抗体，其包含第一 VH域，该第一 VH域包含所有三个来自下述的VH HVR序列(a) SEQ ID NO: I的重链的HVR-Hl ； (b)SEQ ID N0:1的重链的HVR-H2 ;(c)SEQ ID NO: I的重链的HVR-H3，且包含第二 VH域，该第
二VH域包含所有三个来自下述的VH HVR序列(d) SEQ ID NO: 7的重链的HVR-Hl ； (e) SEQID NO: 7 的重链的 HVR-H2 ； (f) SEQ ID NO: 7 的重链的 HVR-H3。
在一个实施方案中，抗LRP6抗体是多特异性抗LRP6抗体，其包含第一 VH域，该第一 VH域包含所有三个来自下述的VH HVR序列(a) HVR-Hl，其包含氨基酸序列SEQID N0:17 ;(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 18 ; (c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19，且包含第二 VH域，该第二 VH域包含所有三个来自下述的VH HVR序列(d)HVR-Hl，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:22 ; (e)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:23 ；(f)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:24。在一个实施方案中，抗LRP6抗体是多特异性抗LRP6抗体，其包含第一 VH域，该第
一VH域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VHHVR序列(a) SEQ ID N0:3的重链的 HVR-Hl ； (b) SEQ ID NO: 3 的重链的 HVR-H2 ; (c) SEQ ID NO: 3 的重链的 HVR-H3，且包含第二 VH域，该第二 VH域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VH HVR序列
(d)SEQ ID NO: 7 的重链的 HVR-Hl ;(e) SEQ ID NO: 7 的重链的 HVR-H2 ; (f) SEQ ID NO: 7 的重链的HVR-H3。在一个实施方案中，抗LRP6抗体是多特异性抗LRP6抗体，其包含第一 VH域，该第一VH域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VHHVR序列(a)HVR-Hl，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:17 ;(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 18 ; (c) HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:21，且包含第二 VH域，该第二 VH域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VH HVR序列(d)HVR-Hl，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:22 ; (e)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:23 ;(f)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:24。在一个实施方案中，抗LRP6抗体是多特异性抗LRP6抗体，其包含第一 VH域，该第一 VH域包含所有三个来自下述的VH HVR序列(a) SEQ ID NO: 3的重链的HVR-Hl ； (b)SEQ ID NO: 3的重链的HVR-H2 ； (c) SEQ ID NO: 3的重链的HVR-H3，且包含第二 VH域，该第
二VH域包含所有三个来自下述的VH HVR序列(d) SEQ ID NO: 7的重链的HVR-Hl ； (e) SEQID NO: 7 的重链的 HVR-H2 ； (f) SEQ ID NO: 7 的重链的 HVR-H3。在一个实施方案中，抗LRP6抗体是多特异性抗LRP6抗体，其包含第一 VH域，该第一 VH域包含所有三个来自下述的VH HVR序列(a) HVR-Hl，其包含氨基酸序列SEQID N0:17 ;(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 18 ; (c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:21，且包含第二 VH域，该第二 VH域包含所有三个来自下述的VH HVR序列(d)HVR-Hl，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:22 ; (e)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:23 ；(f)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:24。在一个实施方案中，抗LRP6抗体是多特异性抗LRP6抗体，其包含第一 VH域，该第一 VH域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VHHVR序列(a) SEQ ID N0:5的重链的 HVR-Hl ； (b) SEQ ID NO: 5 的重链的 HVR-H2 ; (c) SEQ ID NO: 5 的重链的 HVR-H3，且包含第二 VH域，该第二 VH域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VH HVR序列
(d)SEQ ID NO: 7 的重链的 HVR-Hl ;(e) SEQ ID NO: 7 的重链的 HVR-H2 ; (f) SEQ ID NO: 7 的重链的HVR-H3。在一个实施方案中，抗LRP6抗体是多特异性抗LRP6抗体，其包含第一 VH域，该第
一VH域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VHHVR序列(a) HVR-Hl，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20 ; (b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 18 ; (c)HVR-H3，其包含 氨基酸序列SEQ ID NO: 19，且包含第二 VH域，该第二 VH域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VH HVR序列a(d)HVR-Hl，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:22 ；(e)HVR-H2,其包含氨基酸序列SEQ ID N0:23 ;(f)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:24。在一个实施方案中，抗LRP6抗体是多特异性抗LRP6抗体，其包含第一 VH域，该第一 VH域包含所有三个来自下述的VH HVR序列(a) SEQ ID NO: 5的重链的HVR-Hl ； (b)SEQ ID NO: 5的重链的HVR-H2 ； (c) SEQ ID NO: 5的重链的HVR-H3，且包含第二 VH域，该第
二VH域包含所有三个来自下述的VH HVR序列(d) SEQ ID NO: 7的重链的HVR-Hl ； (e) SEQID NO: 7 的重链的 HVR-H2 ； (f) SEQ ID NO: 7 的重链的 HVR-H3。在一个实施方案中，抗LRP6抗体是多特异性抗LRP6抗体，其包含第一 VH域，该第一 VH域包含所有三个来自下述的VH HVR序列(a) HVR-Hl，其包含氨基酸序列SEQID N0:20 ;(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 18 ; (c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19，且包含第二 VH域，该第二 VH域包含所有三个来自下述的VH HVR序列(d)HVR-Hl，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:22 ; (e)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:23 ；(f)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:24。在多特异性抗LRP6抗体的任何上述实施方案中，抗体进一步包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VL HVR序列(a)SEQ ID NO: 2的轻链的HVR-Ll ; (b) SEQ IDN0:2的轻链的HVR-L2 ;和(c) SEQ ID N0:2或SEQ ID NO:4的轻链的HVR-L3。在一个实施方案中，抗体包含(a) SEQ ID NO: 2的轻链的HVR-Ll ； (b) SEQ ID NO: 2的轻链的HVR-L2 ;和
(c)SEQ ID N0:2的轻链的HVR-L3。在一个实施方案中，抗体包含(a) SEQ ID N0:2的轻链的 HVR-Ll ； (b)SEQ ID NO: 2 的轻链的 HVR-L2 ;和(c) SEQ ID NO: 4 的轻链的 HVR-L3。在多特异性抗LRP6抗体的任何上述实施方案中，抗体进一步包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VL HVR序列(a)HVR-Ll，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 25 ；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 26 -M (c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ IDN0:27或SEQ ID NO:28。在一个实施方案中，抗体包含(a)HVR-Ll，其包含氨基酸序列SEQ IDN0:25 ;(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 26 ;和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQID NO:27。在一个实施方案中，抗体包含(a)HVR-Ll，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:25 ；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:26 ;和(c)HVR_L3，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:28。在一个实施方案中，抗LRP6抗体或多特异性抗LRP6抗体包含HVR-H3，其包含氨基酸序列N X1 X2 K(SEQ ID N0:41)。在一个实施方案中，抗LRP6抗体或多特异性抗LRP6抗体包含HVR-H3，其包含氨基酸序列N X1X2KN(SEQ ID NO:42)。在一个实施方案中，抗LRP6抗体或多特异性抗LRP6抗体包含HVR-H3，其包含氨基酸序列N X1VK(SEQ ID N0:43)。在一个实施方案中，抗LRP6抗体或多特异性抗LRP6抗体包含HVR-H3，其包含氨基酸序列NX1IK (SEQID NO:44)。在一个实施方案中，抗LRP6抗体或多特异性抗LRP6抗体包含HVR-H3，其包含氨基酸序列NXiVKN(SEQ ID N0:45)。在一个实施方案中，抗LRP6抗体或多特异性抗LRP6抗体包含HVR-H3，其包含氨基酸序列NX1IKN(SEQ ID N0:46)。在上述实施方案中，X1为氨基酸且X2为I或V ;或X1为A、S、F、T、Y、或L且X2为I或V ;或X1为A、S、F、T、Y、或L且X2 为 I ;或 X1 为 A、S、F、T、Y、或 L 且 X2 为 V。在一个实施方案中，抗LRP6抗体或多特异性抗LRP6抗体包含HVR-H3，其包含氨基酸序列NAVK(SEQ ID NO:47)。在一个实施方案中，抗LRP6抗体或多特异性抗LRP6抗体包含HVR-H3，其包含氨基酸序列NAIK(SEQ ID NO: 48)。在一个实施方案中，抗LRP6抗体或多特异性抗LRP6抗体包含HVR-H3，其包含氨基酸序列NAVKN(SEQ ID N0:49)。在一个实施方案中，抗LRP6抗体或多特异性抗LRP6抗体包含HVR-H3，其包含氨基酸序列NAIKN(SEQ IDNO:50)。·在任何上述实施方案中，抗LRP6抗体是人源化的。在一个实施方案中，抗LRP6抗体包含任何上述实施方案中的HVR，且进一步包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。另一方面，抗LRP6抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO: K SEQ ID NO: 3, SEQ IDN0:5、或SEQ ID N0:7 的重链的VH具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列同一'丨生的重链可变域(VH)序列。另一方面，抗LRP6抗体包含与氨基酸序列SEQID NO:9、SEQ ID NO: IUSEQ ID NO: 13、或 SEQ ID NO: 15 具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性的VH序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)、插入、或删除，但是包含该序列的抗LRP6抗体保留结合LRP6的能力。在某些实施方案中，在 SEQ ID NO: I、SEQ ID NO:3, SEQ ID N0:5、或 SEQ ID NO:7的 VH 中或在 SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: IUSEQ ID NO: 13、或 SEQ ID NO: 15 中替代、插入和/或删除总共I到10个氨基酸。另一方面，抗LRP6抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO: K SEQ ID NO: 3, SEQ IDNO: 5、或 SEQ ID N0:7 具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、or 100% 序列同一性的重链序列。在某些实施方案中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性的重链序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)、插入、或删除，但是包含该序列的抗LRP6抗体保留结合LRP6的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO: I、SEQ ID NO:3, SEQ ID N0:5、或SEQ ID NO:7中替代、插入和/或删除总共I到10个氨基酸。在某些实施方案中，替代、插入、或删除发生于HVR以外的区域(即在FR中)。任选地,抗 LRP6 抗体包含 SEQ ID NO: K SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5、或 SEQ ID NO:7 的重链和/或重链VH,包括该序列的翻译后修饰。另一方面，提供一种抗LRP6抗体，其中该抗体包含轻链可变域(VL)，该轻链可变域(VL)与氨基酸序列 SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:6、或 SEQ ID N0:8 的轻链的VL具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100%序列同一性。另一方面，提供一种抗LRP6抗体，其中该抗体包含轻链可变域(VL)，该轻链可变域(VL)与氨基酸序列 SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、或 SEQ ID NO: 16 具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列同一性。在某些实施方案中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性的VL序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)、插入、或删除，但是包含该序列的抗LRP6抗体保留结合LRP6的能力。在某些实施方案中，在 SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6、或 SEQ ID NO:8 的 VL 中或在 SEQID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、或 SEQ ID NO: 16 中替代、插入和 / 或删除总共 I到10个氨基酸。另一方面，提供一种抗LRP6抗体，其中该抗体包含轻链，该轻链与氨基酸序列SEQID NO:2, SEQ ID NO:4、SEQ ID N0:6、或 SEQ ID NO:8 具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列同一性。在某些实施方案中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性的轻链序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)、插入、或删除，但是包含该序列的抗LRP6抗体保留结合LRP6的能力。在某些实施方 案中，在 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、或 SEQ ID NO:8 中替代、插入和 / 或删除总共I到10个氨基酸。在某些实施方案中，替代、插入、或删除发生于HVR以外的区域(即在FR中)。任选地,抗 LRP6 抗体包含 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、或 SEQ ID NO:8 中的轻链和/或VL序列，包括该序列的翻译后修饰。另一方面，提供一种抗LRP6抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的实施方案中的任何VL。又一方面，本发明提供与本文中提供的抗LRP6抗体结合相同表位的抗体。例如，在某些实施方案中，提供与选自下述抗LRP6抗体的抗LRP6抗体结合相同表位的抗体其包含 VH 序列 SEQ ID NO: 9 和 VL 序列 SEQ ID NO: 10，或 VH 序列 SEQ ID NO: 11 和 VL 序列 SEQID NO: 12，或 VH 序列 SEQ ID NO: 13 和 VL 序列 SEQ ID NO: 14，或 VH 序列 SEQ ID NO: 15 和VL序列SEQ ID NO: 16。在一个实施方案中，抗LRP6抗体结合由LRP6的E1-E2区中的氨基酸残基构成的表位。在一个实施方案中，抗LRP6抗体结合由LRP6的E3-E4区中的氨基酸残基构成的表位。在一个实施方案中，抗LRP6抗体是双特异性抗体，其结合由存在于LRP6的E1-E2区中氨基酸残基构成的表位且结合由存在于LRP6的E3-E4区中的氨基酸残基构成的表位。在一个实施方案中，抗LRP6抗体结合构象表位，其包括LRP6的残基R28、E51、D52、V70、S71、E73、L95、S96、D98、E115、R141 和 N185。在一个实施方案中，抗 LRP6 抗体结合构象表位，其包括 LRP6 的残基 R28、E51、D52、V70、S71、E73、L95、S96、D98、E115、R141、N185、R29、W188、K202、P225、H226、S243 和 F266。在一个实施方案中，抗LRP6抗体与LRP6的El β -螺旋桨的氨基酸残基R28、E51、D52、V70、S71、E73、L95、S96、D98、E115、R141 和 N185 中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少i 个、或所有相互作用。在又一个实施方案中，抗LRP6抗体进一步与LRP6残基R29、W188、K202、P225、H226、S243和F266中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个相互作用。在又一个方面，依照任何上述实施方案的抗LRP6抗体可单一地或组合地掺入下文1-7节中描述的任何特征I.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文中提供的抗体具有彡ΙμΜ、彡IOOnM, ^ IOnM, ^ InM,(O. InM、彡 O.OlnM、或彡 O. OOlnM (例如 1(Γ8Μ 或更少，例如 1(Γ8Μ 至 10_13M，例如，10_9M 至I(T13M)的解离常数(Kd)。在一个实施方案中，Kd是通过如下述测定法所述用Fab型式的感兴趣抗体及其抗原实施的放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的。通过在存在未标记抗原的滴定系列的情况中用最小浓度的(125I)标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(见例如Chen等，J. Mo I.Biol. 293:865-881(1999))。为了建立测定法的条件，将MICROTITER 多孔板(ThermoScientific)用 50mM 碳酸钠(pH 9. 6)中的 5 μ g/ml 捕捉用抗 Fab 抗体(Cappel Labs)包被过夜，随后用PBS中的2%(w/v)牛血清清蛋白于室温(约23° C)封闭2-5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将IOOpM或26pM 125I-抗原与连续稀释的感兴趣Fab (例如与Presta 等，Cancer Res. 57:4593-4599(1997)中抗 VEGF 抗体，Fab-12 的评估一致)混合。然后将感兴趣的Fab温育过夜；然而，温育可持续更长时间(例如约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板，于室温温育(例如I小时)。然后除去溶液，并用PBS中的O. 1%聚山梨酯20 (Τ\\ ΕΝ-20 )洗板8次。平板干燥后，加入150 μ I/孔闪烁液(MICR0SCINT-20 ; Packard)，然后在T0PC0UNT 伽马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20%的浓度用于竞争性结合测定法。依照另一个实施方案，Kd是使用表面等离振子共振测定法使用BIAcore -2000或 BIAcore -3000 (BIAcore, Inc. , Piscataway, NJ)于 25 ° C 使用固定化抗原 CM5 芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简言之，依照供应商的用法说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIACORE, Inc.)。将抗原用IOmM乙酸钠pH 4. 8稀释至5 μ g/ml (约0.2 μ M)，然后以5 μ I/分钟的流速注射以获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入IM乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，于25° C以约25 μ I/分钟的流速注入在含0. 05%聚山梨酯20 (TWEEN-20 )表面活性剂的PBS (PBST)中两倍连续稀释的Fab (0. 78ηΜ至500ηΜ)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIACORE⑩Evaluation Software version 3. 2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率Gw)和解离速率U。平衡解离常数(Kd)以比率I^ffZXn计算。见例如Chen等，J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过IO6M-1S-1,那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINC0 分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量,在存在浓度渐增的抗原的情况中，测量PBSpH 7. 2中20nM抗抗原抗体(Fab形式)于25°C的荧光发射强度(激发=295nm ;发射=340nm，16nm带通)的升高或降低。
2.抗体片段在某些实施方案中，本文中提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’ _SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段，及下文所描述的其它片段。关于某些抗体片段的综述，见Hudson等Nat. Med. 9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，见例如Pluckthiin,于 The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第 113 卷，Rosenburg和Moore 编,(Springer-Verlag, New York),第 269-315 页(1994);还可见 WO 93/16185;及美国专利No. 5，571，894和5，587，458。关于包含补救受体结合表位残基，并且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论，见美国专利No. 5，869，046。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。见例如 EP 404, 097; WO 1993/01161; Hudson 等，Nat. Med. 9:129-134 (2003);及 Hollinger等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)。三抗体和四抗体也记载于 Hudson等，Nat. Med. 9:129-134 (2003)。
单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis, Inc. , Waltham, MA ;见例如美国专利 No. 6，248，516B1)。可以通过多种技术，包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化及重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生成来生成抗体片段，如本文中所描述的。3.嵌合的和人源化的抗体在某些实施方案中，本文中提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体记载于例如美国专利 No. 4，816，567;及 Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，自小鼠、大鼠、仓鼠、家兔、或非人灵长类，诸如猴衍生的可变区)和人恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换的”抗体，其中类或亚类已经自亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR，例如⑶R (或其部分)自非人抗体衍生，而FR (或其部分)自人抗体序列衍生。任选地，人源化抗体还会至少包含人恒定区的一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如衍生HVR残基的抗体)的相应残基替代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。人源化抗体及其生成方法综述于例如Almagro和Fransson, Front.Biosci.13:1619-1633(2008),并且进一步记载于例如 Riechmann 等，Nature332:323-329 (1988) ;Queen 等，Proc.Nat，l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989);美国专利 No. 5，821，337，7，527，791，6，982，321 和 7，087，409; Kashmiri 等，Methods36:25-34(2005)(描述了 SDR(a-CDR)嫁接);Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498(1991)(描述了“重修表面”);Dall’Acqua 等，Methods 36:43-60(2005)(描述了“FR 改组”);及 Osbourn等，Methods 36:61-68(2005)和 Klimka 等，Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)(描述了 FR改组的“引导选择”方法)。可以用于人源化的人框架区包括但不限于使用“最佳拟合(best-fit)”方法选择的框架区(见例如Sims等J. Immunol. 151:2296 (1993))；自轻或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生的框架区(见例如Carter等Proc. Natl.Acad. Sci. USA,89:4285 (1992);及 Presta 等 J. Immunol.，151:2623(1993));人成熟的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(见例如Almagro和Fransson, Front.Biosci. 13:1619-1633 (2008));和通过筛选FR文库衍生的框架区(见例如Baca等，J. Biol.Chem. 272:10678-10684(1997)及 Rosok 等，J. Biol. Chem. 271:22611-22618(1996))。4.人抗体在某些实施方案中，本文中提供的抗体是人抗体。可以使用本领域中已知的多种技术来生成人抗体。一般地，人抗体记载于van Dijk和van de ffinkel, Curr. Opin.Pharmacol. 5:368-74(2001)及 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459(2008)。 可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，所述转基因动物已经修饰为响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有所有或部分人免疫球蛋白基因座，其替换内源免疫球蛋白基因座，或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，一般已经将内源免疫球蛋白基因座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述，见Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)。还可见例如美国专利No. 6，075，181和6，150，584，其描述了 XEN0M0USE 技术；美国专利No. 5，770，429，其描述了 HUMAB 技术；美国专利No. 7，041，870，其描述了 K-M MOUSE 技术，和美国专利申请公开文本No. US 2007/0061900,其描述了VELOaMOUSE 技术)。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。也可以通过基于杂交瘤的方法生成人抗体。已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系(见例如Kozbor J. Immunol.，133:3001 (1984) ;Brodeur 等,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,第 51-63 页(Marcel Dekker, Inc. , New York, 1987)；及 Boerner 等,J.Immunol. , 147:86 (1991))。经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也记载于Li等，Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)。其它方法包括那些例如记载于美国专利No. 7，189，826 (其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体)和Ni，XiandaiMianyixue, 26 (4) : 265-268 (2006)(其描述了人-人杂交瘤)的。人杂交瘤技术(Trioma技术)也记载于 Vollmers 和 Brandlein, Histology and Histopathology, 20 (3) : 927-937 (2005)及Vollmers和Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)。也可以通过分离自人衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变域序列生成人抗体。然后，可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。下文描述了自抗体文库选择人抗体的技术。5.文库衍生的抗体可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离本发明的抗体。例如，用于生成噬菌体展示文库并对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法综述于例如Hoogenboom等于Methods in MolecularBiology 178:1-37 (0，Brien 等编,Human Press, Totowa, NJ, 2001)，并且进一步记载于例如 McCafferty 等，Nature348:552-554;Clackson 等，Nature 352:624-628(1991);Marks等，J. Mol. Biol. 222:581-597(1992);Marks 和 Bradbury,于 Methods in MolecularBiology 248 :161-175 (Lo 编，Human Press, Totowa, NJ, 2003) ; Sidhu 等，J. Mol.Biol. 338(2) :299-310(2004) ;Lee 等,J. Mol. Biol. 340(5) : 1073-1093(2004) ;Fellouse,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (34):12467-12472 (2004);及 Lee 等，J. Immunol. Methods284(1-2):119-132(2004)。在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的全集分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体，如记载于 Winter 等,Ann. Rev. Tmmunol. , 12:433-455 (1994)的。卩遼菌体通常以单链 Fv (scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以(例如自人)克隆天然全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源，如由Griffiths等，EMBOJ, 12:725-734(1993)描述的。最后，也可以通过自干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文·库，如由 Hoogenboom 和 Winter, J. Mol. Biol.，227:381-388 (1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如美国专利No. 5，750, 373和美国专利公开文本No. 2005/0079574，2005/0119455，2005/0266000，2007/0117126，2007/0160598，2007/0237764，2007/0292936 和 2009/0002360。认为自人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文中的人抗体或人抗体片段。6.多特异性抗体在某些实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一针对LRP6，而另一种针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体结合LRP6的两个不同表位。也可以使用双特异性抗体来将细胞毒剂定位于表达LRP6的细胞。双特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(见Milstein 和 Cuello, Nature 305:537 (1983))、W0 93/08829和Traunecker等，EMBO J. 10:3655(1991))和“突起-入-空穴”工程化(见例如美国专利No. 5，731，168)。也可以通过用于生成抗体Fe-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(W0 2009/089004A1);交联两个或更多个抗体或片段(见例如美国专利No. 4，676，980，及Brennan等，Science, 229:81 (1985));使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(见例如Kostelny等，J. Immunol.，148(5) : 1547-1553(1992));使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(见例如 Hollinger 等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993));及使用单链Fv(sFv) 二聚体(见例如 Gruber 等，J. Immunol. , 152:5368 (1994));及如例如 Tutt等J. Immunol. 147:60(1991)中所描述的,制备三特异性抗体来生成多特异性抗体。本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体，包括“章鱼抗体”(见例如US 2006/0025576A1)。本文中的抗体或片段还包括包含结合LRP6及另一种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用 FAb” 或 “DAF”(见例如 US 2008/0069820)ο7.抗体变体
在某些实施方案中，涵盖本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可以期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将合适的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除和/或插入和/或替代。可以进行删除、插入和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如，抗原结合。a)替代、插入和删除变体在某些实施方案中，提供了具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和FR。保守替代在表I中在“保守替代”的标题下显示。更实质的变化在表I中在“例示性替代”的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC。表I·
初始残基例示性替代优选的替代
Ala(A)Val; Leu; HeVal
Arg(R)Lys;Gin;AsnLys
Asn (N)Gln;His;Asp, Lys;ArgGln
Asp (D)Glu;AsnGlu
Cys (C)Ser;AlaSer
Gln (Q)Asn;GluAsn
Glu(E)Asp;GlnAsp
Gly(G)AlaAla
His (H)Asn;Gin;Lys;ArgArg
He (I)Leu; Val; Met; Ala; Phe;正亮氨酸Leu
Leu(L)正亮氨酸；Ile;Val;Met;Ala;Phelie
Lys(K)Arg;Gin;AsnArg
Met (M)Leu; Phe; HeLeu
Phe(F)Trp;Leu;Val;lie;Ala;TyrTyr
Pro (P)AlaAlaSer(S)ThrThr
Thr (T)Val;SerSer
Trp(W)Tyr;PheTyr
Tyr(Y)Trp;Phe;Thr;SerPhe
Val (V)He; Leu; Met; Phe; Ala;正亮氨酸Leu依照共同的侧链特性，氨基酸可以如下分组(I)疏水性的正亮氨酸，Met, Ala, Val, Leu, He ；(2)中性、亲水性的Cys, Ser, Thr, Asn, Gln ；⑶酸性的Asp,Glu ;(4)碱性的His，Lys, Arg ；(5)影响链取向的残基Gly，Pro ；(6)芳香族的Trp, Tyr, Phe。非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗体会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力、降低的免疫原性)和/或会基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展示，并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。可以对HVR做出变化(例如，替代)，例如以改善抗体亲和力。可以对HVR “热点”，即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基(见例如Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008))，和 / 或 SDR(a-CDR)做出此类变化，其中对所得的变体VH或VL测试结合亲和力。通过次级文库的构建和再选择进行的亲和力成熟已经记载于例如 Hoogenboom 等于 Methods in Molecular Biology 178:1-37 (0，Brien等编，Human Press, Totowa, NJ, (2001))。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组、或寡核苷酸指导的诱变)将多样性引入为成熟选择的可变基因。然后，创建次级文库。然后，筛选文库以鉴定具有期望的亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及HVR指导的方法，其中将几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定参与抗原结合的HVR残基。特别地，经常靶向 CDR-H3 和 CDR-L3。在某些实施方案中，可以在一个或多个HVR内发生替代、插入、或删除，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以对HVR做出保守变化(例如，保守替代，如本文中提供的)，其不实质性降低结合亲和力。此类变化可以在HVR “热点”或SDR外部。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR是未改变的，或者含有不超过
I、2或3处氨基酸替代。一种可用于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如由 Cunningham 和 Wells (1989) Science, 244:1081-1085 所描述的。在此方法中，将残基或祀残基的组(例如，带电荷的残基诸如arg、asp、his、lys和glu)鉴定,并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外，利用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原间的接触点。作为替代的候选，可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。氨基酸序列插入包括长度范围为I个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合，及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N或C端与酶(例如对于ADEPT )或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。b)糖某化夺体在某些实施方案中，改变本文中提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列，使得创建或消除一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体的糖 基化位点的添加或删除。在抗体包含Fe区的情况中，可以改变其附着的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体通常包含分支的、双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fe区的CH2域的Asn297。见例如Wright等TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附着于双触角寡糖结构“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改善的特性的抗体变体。在一个实施方案中，提供了抗体变体，其具有缺乏附着(直接或间接)于Fe区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中的岩藻糖量可以是1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。通过相对于附着于Asn297的所有糖结构(例如，复合的、杂合的和高甘露糖的结构)的总和，计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量，如通过MALDI-T0F质谱术测量的，例如如记载于WO 2008/077546的。Asn297指位于Fe区中的约第297位(Fe区残基的Eu编号方式)的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于第297位上游或下游约±3个氨基酸，即在第294位和第300位之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。见例如美国专利公开文本No. US2003/0157108 (Presta, L.) ; US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd)。涉及“脱岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体的出版物的例子包括US 2003/0157108; WO2000/61739;W0 2001/29246;US 2003/0115614;US 2002/0164328;US 2004/0093621;US2004/0132140;US2004/01 10704;US 2004/0 1 10282;US 2004/0109865;WO2003/085119;W02003/084570;WO 2005/035586;WO 2005/035778;W02005/053742;W02002/031140;Okazaki 等 J.Mol. Biol. 336:1239-1249(2004);Yamane-Ohnuki 等 Biotech.Bioeng. 87:614(2004)。能够生成脱岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的 Lecl3CH0 细胞(Ripka 等 Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545(1986);美国专利申请 No US2003/0157108Al，Presta，L;及 WO 2004/056312A1, Adams 等，尤其在实施例11)，和敲除细胞系，诸如α-1，6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(见例如 Yamane-Ohnuki 等 Biotech. Bioeng. 87:614 (2004);Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng. , 94(4):680-688(2006);及 W02003/085107)。进一步提供了具有两分型寡糖的抗体变体，例如其中附着于抗体Fe区的双触角寡糖是通过GIcNAc两分的。此类抗体变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子记载于例如WO 2003/011878 (Jean-Mairet等)；美国专利 No. 6，602，684 (Umana 等)；及 US 2005/0123546 (Umana 等)。还提供了在附着于 Fe 区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体记载于例如WO 1997/30087 (Patel等)；W0 1998/58964(Raju, S.);及冊1999/22764(Raju, S.)。c)Fc 区夺体在某些实施方案中，可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fe区中，由此生成Fe区变体。Fe区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fe区序列(例如，人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
在某些实施方案中，本发明涵盖拥有一些但不是所有效应器功能的抗体变体，所述效应器功能使其成为如下应用的期望候选物，其中抗体的体内半衰期是重要的，而某些效应器功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如，可以进行Fe受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺乏Fe YR结合(因此有可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达Fe Y RIII，而单核细胞表达Fe Y RI、Fe Y RH 和 Fe Y RIII。在 Ravetch 和 Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)的第464页上的表3中汇总了造血细胞上的FcR表达。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子记载于美国专利No. 5, 500, 362 (见例如Hellstrom, I.等 Proc. Nat，I Acad.Sci. USA 83:7059-7063(1986))和 Hellstrom, I 等，Proc.Nat，I Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985) ; 5，821，337 (见 Bruggemann, M.等,J. Exp.Med. 166:1351-1361 (1987))。或者，可以采用非放射性测定方法(见例如用于流式细胞术的ACTI 非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology, Inc. MountainView, CA jPCytoTox96 非放射性细胞毒性测定法(Promega，Madison, WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如披露于Clynes等Proc. Nat’ I Acad. Sci.USA95:652-656 (1998)的。也可以实施Clq结合测定法以确认抗体不能结合Clq，并且因此缺乏 CDC 活性。见例如 WO 2006/029879 和 WO 2005/100402 中的 Clq 和 C3c 结合 ELISA0为了评估补体激活，可以实施⑶C测定法(见例如Gazzano-Santoro等，J. Immunol. Methods202:163 (1996) ; Cragg, M. S.等，Blood 101:1045-1052 (2003);及 Cragg, M. S.和 M. J. Glennie, Bloodl03:2738-2743 (2004))。也可以使用本领域中已知的方法来实施FcRn结合和体内清除 / 半衰期测定(见例如 Petkova, S. B.等，Int，I. Immunol. 18 (12) : 1759-1769 (2006)
)o具有降低的效应器功能的抗体包括那些具有Fe区残基238，265，269，270，297，327和329中的一个或多个的替代的(美国专利No. 6，737，056)。此类Fe突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两处或更多处具有替代的Fe突变体，包括残基265和297替代成丙氨酸的所谓的“DANA” Fe突变体(美国专利No. 7，332，581)。描述了具有改善的或降低的对FcR的结合的某些抗体变体(见例如美国专利No. 6，737，056; WO 2004/056312，及 Shields 等，J. Biol. Chem. 9 (2) :6591-6604(2001))。在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一处或多处氨基酸替代，例如Fe区的位置298、333和/或334 (残基的EU编号方式)的替代的Fe区。在一些实施方案中，对Fe区做出改变，其导致改变的(即，改善的或降低的)Clq结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如记载于美国专利No. 6，194，551、WO99/51642、及 Idusogie 等 J. Immunol. 164:4178-4184(2000)的。具有延长的半衰期和改善的对新生儿Fe受体(FcRn)的结合的抗体记载于US2005/0014934Al(Hinton等)，新生儿Fe受体(FcRn)负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等,J. Immunol. 117:587 (1976)及 Kim 等,J. Immunol. 24:249 (1994))。那些抗体包含其中具有改善Fe区对FcRn结合的一处或多处替代的Fe区。此类Fe变体包括那些在Fe区残基 238，256，265，272，286，303，305，307，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，413，424或434中的一处或多处具有替代，例如，Fe区残基434的替代的(美国专利No. 7，371，826)。 还可见Duncan 和 Winter, Nature 322:738-40 (1988);美国专利 No. 5，648，260;美国专利No. 5,624,821;及WO 94/29351，其关注Fe区变体的其它例子。d)经半胱氨酸工程化改造的抗体变体在某些实施方案中，可以期望创建经半胱氨酸工程化改造的抗体，例如，“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在具体的实施方案中，替代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸替代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体与其它模块，诸如药物模块或接头-药物模块缀合，以创建免疫缀合物，如本文中进一步描述的。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸替代下列残基之任一个或多个轻链的V205 (Kabat编号方式)；重链的A118 (EU编号方式);和重链Fe区的S400 (EU编号方式)。可以如例如美国专利No. 7，521，541所述生成经半胱氨酸工程化改造的抗体。e)抗体衍牛物在某些实施方案中，可以进一步修饰本文中提供的抗体以含有本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三B恶烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)和右旋糖苷或聚(η-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体要改进的具体特性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。在另一个实施方案中，提供了抗体和可以通过暴露于辐射选择性加热的非蛋白质性质模块的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam等，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 102:11600-11605 (2005))。辐射可以是任何波长的，并且包括但不限于对普通细胞没有损害，但是将非蛋白质性质模块加热至抗体-非蛋白质性质模块附近的细胞被杀死的温度的波长。B.重组方法和组合物可以使用重组方法和组合物来生成抗体，例如，如记载于美国专利No. 4，816，567的。在一个实施方案中，提供了编码本文中所描述的抗LRP6抗体的分离的核酸。此类核酸可以编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻和/或重链)。在又一个实施方案中，提供了包含此类核酸的一种或多种载体(例如，表达载体)。在又一个实施方案中，提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包 含(例如，已经用下列载体转化)(I)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸，所述第二载体包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，YO、NSO、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了生成抗LRP6抗体的方法，其中该方法包括在适合于表达抗体的条件下培养包含编码抗体的核酸的宿主细胞，如上文提供的,并且任选地，自宿主细胞(或宿主细胞培养液)回收抗体。对于抗LRP6抗体的重组生成，将编码抗体的核酸(例如如上文所描述的)分离，并插入一种或多种载体中，以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规规程将此类核酸容易地分离并测序(例如，通过使用寡核苷酸探针来进行，所述寡核苷酸探针能够特异性结合编码抗体的重和轻链的基因)。适合于克隆或表达抗体编码载体的宿主细胞包括本文中所描述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中生成抗体，特别是在不需要糖基化和Fe效应器功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，见例如美国专利No. 5，648，237，5，789，199和5，840，523(还可见 Charlton, Methods in Molecular Biology,第 248 卷(Β· K. C. Lo 编，HumanaPress, Totowa, NJ, 2003),第245-254页，其描述了抗体片段在大肠杆菌(E. coli.)中的表达)。表达后，可以将抗体在可溶性级分中自细菌细胞浆分离，并可以进一步纯化。在原核生物外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是适合于抗体编码载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”，导致生成具有部分或完全人的糖基化样式的抗体的真菌和酵母菌株。见 Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004),及 Li 等，Nat.Biotech.24:210-215(2006)。适合于表达糖基化抗体的宿主细胞也自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞一起使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。也可以利用植物细胞培养物作为宿主。见例如美国专利No. 5，959，177，6，040，498，6，420，548，7，125，978和6，417，429 (其描述了用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIB0DIESTM 技术)。也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适合于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是经SV40转化的猴肾CVl系(C0S-7);人胚肾系(293或293细胞，如记载于例如Graham等，J. GenVirol. 36:59(1977)的)；幼年仓鼠肾细胞(BHK);小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如记载于例如Mather, Biol. R印rod. 23:243-251 (1980)的)；猴肾细胞(CVl);非洲绿猴肾细胞(VER0-76);人宫颈癌细胞(HELA);犬肾细胞(MDCK;牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL3A);人肺细胞(W138);人肝细胞(Hep G2);小鼠乳房肿瘤(MMT 060562) ;TRI细胞，如记载于例如 Mather 等，Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)的；MRC 5 细胞；和 FS4 细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216(1980));和骨髓瘤细胞系诸如 YO、NSO 和 Sp2/0。关于适合于抗体生成的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，见例如Yazaki和Wu, Methods inMolecular Biology,第 248 卷(B. K. C. Lo 编，Humana Press, Totowa, NJ),第 255-268 页(2003)。C.测定法可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的抗LRP6抗体鉴定、筛选、或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。·I.结合测定法和其它测定法一方面，对本发明的抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如ELISA、Western印迹等来进行。另一方面，可使用竞争测定法来鉴定与本发明的抗LRP6抗体竞争对LRP6的结合的抗体。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合与本发明的抗LRP6抗体所结合表位相同的表位(例如线性或构象表位)。用于定位抗体所结合表位的详细例示性方法见 Morris(1996) “Epitope Mapping Protocols”，Methods in Molecular Biologyvol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)。在一种例示性竞争测定法中，在包含第一经标记抗体(其结合LRP6)和第二未标记抗体(其要测试与第一抗体竞争对LRP6的结合的能力)的溶液中温育固定化LRP6。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在包含第一经标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中温育固定化LRP6。在允许第一抗体结合LRP6的条件下温育后，除去过量的未结合抗体，并测量与固定化LRP6联合的标记物的量。如果测试样品中与固定化LRP6联合的标记物的量与对照样品相比实质性降低，那么这指示第二抗体与第一抗体竞争对LRP6的结合。参见 Harlow and Lane (1988) Antibodies:A Laboratory Manual ch. 14 (Cold SpringHarbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)。2.活性测定法一方面，提供了用于鉴定具有生物学活性的抗LRP6抗体的测定法。生物学活性可包括例如抑制或强化fct同等型介导的信号传导、调控骨量/含量、抑制细胞增殖、提高细胞增殖。还提供了在体内和/或在体外具有此类生物学活性的抗体。在某些实施方案中，对本发明的抗体测试此类生物学活性。实施例中提供了用于测试生物学活性的的具体测定法。D.免疫缀合物本发明还提供了包含与一种或多种细胞毒剂，诸如化学治疗剂或药物、生长抑制齐U、毒素(例如，蛋白质毒素、细菌、真菌、植物、或动物起源的酶活性毒素、或其片段)、或放射性同位素缀合的本文中的抗LRP6抗体的免疫缀合物。在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，包括但不限于美登木素生物碱(见美国专利No. 5，208,020,5,416,064和欧洲专利EP O 425 235 BI) ;auristatin诸如单甲基auristatin药物模块DE和DF(MMAE 和 MMAF)(见美国专利 No. 5，635，483 和 5，780, 588 及 7，498，298);多拉司他汀(dolastatin);加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物(见美国专利No. 5，712，374，5，714，586，5，739，116，5，767，285，5，770，701，5，770，710，5，773，001 和 5，877，296; Hinman等，Cancer Res. 53:3336-3342(1993);及 Lode 等，Cancer Res. 58:2925-2928 (1998));蒽环类抗生素诸如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(见Kratz等，Current Med. Chem. 13 : 477-523 (2006) ; Jeffrey 等，Bioorganic & Med. Chem.Letters 16:358-362 (2006) ;Torgov 等，Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005) ;Nagy等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 : 829-834 (2000) ; Dubowchik 等，Bioorg. & Med.Chem.Letters 12:1529-1532 (2002);King 等，J. Med. Chem. 45:4336-4343(2002);及美国专利No. 6，630, 579);甲氨蝶呤；长春地辛(vindesine);紫杉烧(taxane)诸如多西他赛(docetaxel)、帕利他塞、Iarotaxel、tesetaxel和ortataxel ;单端抱霉素 (trichothecene);和 CC1065。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文中所描述的抗体，所述酶活性毒素包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutitesfordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酿霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端抱菌素(trichothecenes)。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的如本文中所描述的抗体。多种放射性同位素可用于生成放射性缀合物。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212 和 Lu 的放射性同位素。在使用放射性缀合物进行检测时，它可以包含供闪烁法研究用的放射性原子，例如tc99m或1123，或供核磁共振(NMR)成像(又称为磁共振成像，mri)用的自旋标记物，诸如再一次的碘-123、碘-131、钢_111、氣_19、碳-13、氣-15、氧_17、礼、猛或铁。可以使用多种双功能蛋白质偶联剂来生成抗体和细胞毒剂的缀合物，诸如N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-I-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)_乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6- 二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1，5- 二氟-2，4- 二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可以如Vitetta等，Science 238:1098 (1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的I-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见W094/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感性接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari等，Cancer Res 52:127-131 (1992);美国专利 No. 5，208，020)。本文中的免疫缀合物或ADC明确涵盖，但不限于用交联试剂制备的此类缀合物，所述交联试剂包括但不限于 BMPS、EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS、MPBH、SBAP, SIA、SI AB, SMCC、SMPB, SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC和sulfo-SMPB，及SVSB(琥 珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，它们是商品化的(例如，来自 Pierce Biotechnology, Inc. , Rockford, IL. ,U.S. A)。E.用于诊断和检测的方法和组合物在某些实施方案中，本文中提供的任何抗LRP6抗体可用于检测生物学样品中LRP6的存在。在用于本文时，术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中，生物学样品包含细胞或组织。在一个实施方案中，提供了在诊断或检测方法中使用的抗LRP6抗体。在又一方面，提供了检测生物学样品中LRP6的存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括在容许抗LRP6抗体结合LRP6的条件下使生物学样品与抗LRP6抗体接触，如本文中所描述的，并检测是否在抗LRP6抗体与LRP6间形成复合物。此类方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，使用抗LRP6抗体来选择适合用抗LRP6抗体治疗的受试者，例如其中LRP6是一种用于选择患者的生物标志。可使用本发明的抗体来诊断的例示性病症包括癌症和骨骼系统的病症。在某些实施方案中，提供了经标记的抗LRP6抗体。标记物包括但不限于直接检测的标记物或模块(诸如荧光、发色、电子致密、化学发光和放射性标记物)、及例如经由酶反应或分子相互作用间接检测的模块，诸如酶或配体。例示性的标记物包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和1311、荧光团诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明(rhodamine)及其衍生物、丹酰、伞形酮、萤光素酶，例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利No. 4，737，456)、萤光素、2，3- 二氢酞嗪二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖类氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、杂环氧化酶诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶(其与采用过氧化氢氧化染料前体的酶诸如HRP偶联)、乳过氧化物酶、或微过氧化物酶、生物素/亲合素、自旋标记物、嗤囷体标记物、稳定的自由基、等等。F.药物配制剂通过混合具有期望纯度的此类抗体与一种或多种任选的药学可接受载体(Remington，s Pharmaceutical Sciences 第 16 版，0sol，A.编(1980))混合以冻干配制剂或水性溶液形式制备如本文中所描述的抗LRP6抗体的药物配制剂。一般地，药学可接受载体在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括但不限于缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA ;糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的例示性的药学可接受载体进一步包含间质药物分散剂诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20 ( HYLENEX , BaxterInternational, Inc.)。某些例示性的sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20记载于美国专利公开文本No. 2005/0260186和2006/0104968。在一方面，将sHASEGP与一种或多种别的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。例示性的冻干抗体配制剂记载于美国专利No. 6，267，958。水性抗体配制剂包括那些记载于美国专利No. 6，171，586和W02006/044908的，后一种配制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲液。本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性组分，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的化合物。此类活性组分适于以有效用于所需目的的量而
组合存在。活性成分可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)，或在粗滴乳状液中。此类技术披露于例如 Remington' s Pharmaceutical Sciences,第 16 版，0sol，A.编(1980)。可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形商品形式，例如膜，或微胶囊。用于体内施用的配制剂一般是无菌的。无菌性可容易地实现，例如通过穿过无菌滤膜过滤。G.治疗性方法和组合物可以在治疗性方法中使用本文中提供的任何抗LRP6抗体。在一方面，提供了作为药物使用的抗LRP6抗体。在别的方面，提供了在治疗Wnt介导的病症，诸如癌症或骨骼或骨病症中使用的抗LRP6抗体。在某些实施方案中，提供了在治疗方法中使用的抗LRP6抗体。在某些实施方案中，本发明提供了在治疗具有癌症或骨骼或骨病症的个体的方法中使用的抗LRP6抗体，所述方法包括对个体施用有效量的抗LRP6抗体。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，例如，如下文所描述的。在别的实施方案中，本发明提供了在抑制由第一 fct同等型诱导的信号传导及强化由第二 fct同等型诱导的信号传导中使用的抗LRP6抗体。在某些实施方案中，本发明提供了在个体中抑制由第一 fct同等型诱导的信号传导及强化由第二Wnt同等型诱导的信号传导的方法中使用的抗LRP6抗体，所述方法包括对个体施用有效量的抗LRP6抗体以抑制由第一 Wnt同等型诱导的信号传导及强化由第二 Wnt同等型诱导的信号传导。依照任何上述实施方案的“个体”优选是人。在又一方面，本发明提供了抗LRP6抗体在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，药物用于治疗fct介导的病症，诸如癌症或骨骼或骨病症。在又一个实施方案中，药物在治疗fct介导的病症，诸如癌症或骨骼或骨病症的方法中使用，所述方法包括对具有fct介导的病症的个体施用有效量的药物。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，例如如下文所描述的。依照任何上述实施方案的“个体”可以是人。在又一方面，本发明提供了治疗Wnt介导的病症，诸如癌症或骨骼或骨病症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括对具有此类fct介导的病症的个体施用有效量的抗LRP6抗体。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，如下文所描述的。依照任何上述实施方案的“个体”可以是人。在一个实施方案中，Wnt介导的病症是癌症，诸如例如非小细胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肾癌、或前列腺癌。在另一个实施方案中，fct介导的病症是骨骼或骨病症，诸如例如骨质疏松、骨关节炎、骨折、或骨损伤。一个实施方案提供了治疗具有癌症的个体的方法，包括对个体施用有效量的结合LRP6且抑制由选自Wnt3和Wnt3a的Wnt同等型诱导的信号传导的抗体和结合LRP6且抑制由选自Wnt l、2、2b、6、8a、9a、9b和IOb的Wnt同等型诱导的信号传导的抗体。另一个实·施方案提供了治疗具有癌症的个体的方法，包括对个体施用有效量的结合LRP6且抑制由Wnt3和Wnt3a诱导的信号传导的抗体和结合LRP6且抑制由Wnt l、2、2b、6、8a、9a、9b和IOb诱导的信号传导的抗体。另一个实施方案提供了治疗具有癌症的个体的方法，包括对个体施用有效量的结合LRP6且抑制由Wnt3和Wnt3a诱导的信号传导的抗体和结合LRP6且抑制由Wnt l、2、2b、4、6、7a、7b、8a、9a、9b、10a和IOb诱导的信号传导的抗体。在又一方面，本发明提供了用于在个体中强化由一种Wnt同等型诱导的Wnt信号传导的方法，包括对个体施用有效量的强化由该fct同等型诱导的信号传导的抗LRP6抗体和该Wnt同等型以强化由该Wnt同等型诱导的Wnt信号传导。在又一方面，本发明提供了药物配制剂，其包含本文中提供的任何抗LRP6抗体，例如在任何上述治疗性方法中使用。在一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何抗LRP6抗体和药学可接受载体。在另一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何抗LRP6抗体和至少一种别的治疗剂，例如如下文所描述的。可以单独或与疗法中的其它药剂组合使用本发明的抗体。例如，可以与至少一种别的治疗剂共施用本发明的抗体。在某些实施方案中，别的治疗剂是化学治疗剂。在另一个实施方案中，该药剂是有效治疗癌症或治疗骨骼或骨病症的抗体。上文记录的此类联合疗法涵盖联合施用(其中两种或更多种治疗剂包含在相同或不同配制剂中)，和分开施用，在该情况中，可以在施用别的治疗剂和/或辅助剂之前、同时和/或之后施用本发明的抗体。也可以与放射疗法组合使用本发明的抗体。可以通过任何合适的手段，包括胃肠外、肺内和鼻内，及若期望用于局部治疗的话，损伤内施用来施用本发明的抗体(和任何别的治疗剂)。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。部分根据施用是短暂的还是长期的，剂量给药可以通过任何合适的路径，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射进行。本文中涵盖各种剂量给药日程表，包括但不限于单次施用或在多个时间点里的多次施用、推注施用和脉冲输注。本发明的抗体应当以一种符合良好的医学实践的方式配制、确定剂量及给药。关于这一点考虑的因素包括在治疗的特定病症、在治疗的特定哺乳动物、患者个体的临床状态、病因、药物递送部位、给药方法、服药日程以及其它为开业医生所知的因素。抗体无需但可任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所述病症的药物一起配制。上述其它药物的有效量取决于配方中所存在的抗体的量、所治疗病症的类型、以及其它上述讨论的因素。这些药物通常以相同的剂量使用并具有本文中所描述的给药途径，或以约1-99%的本文所描述的剂量使用，或以任何剂量并通过任何途径使用，所述剂量和途径是凭经验确定的/经临床测定合适的。为了预防或治疗疾病，本发明的抗体(当单独或与一种或多种其它别的治疗剂联合使用时)的合适剂量应取决于所要治疗的疾病的类型、抗体的种类、疾病的严重性和病程、所给予抗体的预防或治疗目的、之前的治疗、患者的临床史和对抗体的应答、以及主治医师的斟酌决定。抗体适合于在一次或一系列的治疗中给予患者。取决于疾病的类型和严重性，约I μ g/kg-15mg/kg(例如O. lmg/kg-10mg/kg)的抗体可作为首次候选用量给予患者，无论是例如通过一次或多次单独的给药或通过连续输注。取决予上述提及的因素，一个典型的日剂量可在约1μ g/kg-100mg/kg或更多的范围内。对于几天或更长时间的重复给药，取决于病情，治疗应通常持续直至出现病症得到期望的抑制为止。抗体的一个例证性的剂量应为约O. 05mg/kg-约10mg/kg。因此,可将一个或多个约O. 5mg/kg、2. 0mg/kg、4. Omg/·kg或10mg/kg (或它们的任何组合)的剂量给予患者。上述剂量可间歇给予,如每周或每三周给予一次(如使得患者得到约2-约20个，或例如约6个剂量的抗体)。可给予初始较高的负荷剂量，接着给予一个或多个较低的剂量。通过常规技术和测定方法易于监测该治疗的进展。应当理解，可以替换抗LRP6抗体或在抗LRP6抗体外使用本发明的免疫缀合物实施任何上述配制剂或治疗性方法。H.制品在本发明的另一方面，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上文所描述的病症的材料。制品包含容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、管形瓶、注射器、IV溶液袋、等等。容器可以由多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器容纳单独或与另一种组合物组合有效治疗、预防和/或诊断状况的组合物，并且可以具有无菌存取口(例如，容器可以是具有由皮下注射针可穿过的塞子的管形瓶或静脉内溶液袋)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装插页指示使用组合物来治疗选择的状况。此外，制品可以包含(a)具有其中含有的组合物的第一容器，其中组合物包含本发明的抗体；和(b)具有其中含有的组合物的第二容器，其中组合物包含别的细胞毒性或其它方面治疗性的药剂。在本发明的此实施方案中的制品可以进一步包含包装插页，其指示可以使用组合物来治疗特定的状况。或者/另外，制品可以进一步包含第二(或第三)容器，其包含药学可接受缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包含从商业和用户观点看期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针和注射器。应当理解，任何上述制品可包括本发明的免疫缀合物来代替或补充抗LRP6抗体。III.实施例以下是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，鉴于上文提供的一般描述，可以实施各种其它实施方案。实施例I
实验规程细胞培养和细胞测定法细胞系EKVX和M14在补充有10%胎牛血清和2mM谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中培养细胞在具有相同补充物的Williams氏培养基E中培养。所有其它细胞系得自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)且像推荐的那样维持。将细胞依照制造商的推荐在24孔板中用FuGENE 6转染试剂(Roche)转染。对于萤光素酶报告物测定法，转染表达质粒DNA的混合物7. 5ngT0PgloW (Upstate)或TOPbrite (Zhang 等，2009)萤火虫萤光素酶 Wnt 报告物，O. 5ng pRL_SV40 Renilla 萤光素酶(Promega)，和Ing LEF1。将细胞用抗体处理16_20h，在转染后24h开始。将Wnt3a蛋白(依照X纯化，或购自R&D Systems)添加至细胞，在启动抗体处理后Ih开始。在150ul 裂解缓冲液(DeAlmeida等，2007)中收获细胞，并使用双重Glo萤光素酶系统(Promega)和Envision Multilabel Reader(PerkinElmer)对 30_50ul 裂解物测定发光。为了转染效率，将萤火虫萤光素酶水平相对于Renilla萤光素酶水平标准化，并另外将相对萤光素酶单位(RLU)相对于未用Wnt3a刺激的细胞中的水平标准化。为了潮霉素抗性选择稳定整合有TOPbrite报告物的HEK293和Hs578T细胞系。基于稳定整合的SV40驱动的Renilla萤光素酶(用于HEK293细胞)或基于MultiTox-Fluor细胞存活力测定法(Promega)(用于Hs578T细胞)将Wnt萤光素酶报告物的表达相对于细胞数标准化。通过在pRK5表达载体中在全长FZD4、FZD5、或LRP6的上游克隆全长Wntl或Wnt3a来生成Wnt嵌合物构建物。将24个氨基酸的接头(GGGSGGGT) 3插入fct和FZD或LRP6序列(Cong等，2004 )之间。使用“结节-入-空穴”工程技术(Ridgway,J. B. B. et al, Protein Engineering9:617-621 (1996)通过共表达YW211. 31. 62重和轻链及截断的Fe域在大肠杆菌中生成一臂YW211.31抗体变体。为了抗体交联，将Fe特异性山羊抗人IgG抗体或F(ab' )2片段(Sigma-Aldrich)与一臂YW211. 31抗体一起温育lh，之后将混合物添加至细胞。对于Western分析，将I. 2x IO6个HEK293细胞接种到10_cm皿上并在3天后用10 μ g/ml 抗体，或 X μ g/ml DKKl (R&D Systems)或 Fzd8CRD_Fc (DeAlmeida 等，2007)蛋白处理lh，之后添加O. 2ug/ml Wnt3a蛋白，再处理lh。将细胞用冷PBS清洗两次并在O. 5ml裂解缓冲液中在冰上裂解。将20 μ g蛋白质在变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶(4-12%)上电泳解析，转移至硝酸纤维素膜，并用针对磷酸-和总-LRP6 (Cell Signaling Technology)、β-联蛋白(BD Transduction Laboratories)、β -肌动蛋白和GAPDH的抗体探查。使用红外标记的二抗(Rockland Immunochemicals)和Odyssey成像仪(LI-C0R)显现蛋白质。对于定量实时PCR (qPCR)表达分析，使用RNeasy试剂盒(QIAGEN)自细胞分离RNA,并用TaqMan —步RT-PCR大师级混合试剂试剂盒(Applied Biosystems)在7900HT快速实时PCR系统(Applied Biosystems)上实施反应。使用Δ Δ Ct方法计算相对RNA水平并相对于同一样品内的人GAPDH或小鼠Rpll9RNA水平标准化，并另外相对于来自没有添加(NA) Wnt3a、抗体、或其它蛋白质的细胞的样品标准化。引物和探针集(为正向引物、反向引物和探针序列以5'至3'列出)分别为SP5 :AATGCTGCTGAACTGAATAGAAA (SEQ IDNO 32),AACCGGTCCTAGCGAAAA (SEQ ID NO 33),CCGAGCACTGTTTCAAATCTCCCA (SEQ ID NO:34) ；ZNRF3 TGAGAGTGTGACATTGTTGGAA (SEQ ID NO 35), GTAAAATCTGTGTGCAATTATCATGT(SEQ ID NO 36), AATCATTGAAAATGACTAACACAAGACCCTGTAAAT (SEQ ID NO :37);小鼠Mmp7 TGAGGACGCAGGAGTGAA (SEQ ID NO 38), CCCAGAGAGTGGCCAAAT (SEQ ID NO 39),CCTGTTTGCTGCCACCCATGA (SEQ ID NO :40)。用于人APCDDl、轴蛋白2、GADl、LEFTY2和SAXl，及用于小鼠Rpl 19和轴蛋白2的引物和探针先前分别有记载(DeAlmeida等，2007 ；Liu等，2010)。GAPDH引物和探针购自Applied Biosystems。对于报告物基因和qPCR测定法，所有数值代表二份或四份实验重复的均值和标准偏差。LRP6杭体筛诜和亲和力成熟分开将人LRP6cDNA片段编码区E1-E2(SEQID NO :29 的氨基酸A19-R644)和E3-E4 (SEQ ID N0:29的氨基酸V629-G1244)克隆入含有HSV信号序列和人IgG Fe区作为蛋白质标签的哺乳动物表达载体(SEQ ID NO 30 (El_E2-fc);SEQ ID NO 31 (E3_E4_fc))。通过瞬时转染在CHO细胞中表达LRP6. E1-E2-FC和LRP6. E3_E4_Fc蛋白并通过蛋白Α/G亲和层析来纯化。也分别地使用LRP6. E1-E2-FC和LRP6. E3_E4_Fc蛋白筛选人合成Fab噬菌体展示库。在固定化LRP6蛋白上选择后，分离噬菌体克隆并通过噬菌体ELISA确认对LRP6_Fc融合蛋白片段而非Fe蛋白的结合。然后为了作为人IgGl单克隆抗体表达，将噬菌体Fab克隆重定形式。在具有共同Herc印tin衍生人卡帕轻链的HEK293细胞中转染并瞬时表达24个针对LRP6. E1-E2-FC的独特抗体重链克隆和22个针对LRP6. E3_E4_Fc的克隆，并通过亲和层析纯化IgG蛋白。通过CHO细胞中的瞬时转染来生成随后大规模抗体制备物。使用带His标签的LRP6.E3-E4蛋白对YW211.31抗体进行亲和力成熟。通过软随机化选定残基在分开的库中靶向⑶R环的三个不同组合(H1/L3、H2/L3和H3/L3)进行随机化。另外，靶向L1/L2/L3 CDR组合进行硬随机化。在第一轮选择中，用固定化LRP6.E3-4-His蛋白自随机化库选择噬菌体，接着是五轮溶液相分选，其中LRP6. E3-4_His的浓度自300nM逐渐降低至O. 5nM，并添加100倍过量的LRP6. E3_4_Fc蛋白以消减具有较快解离速率的抗体。纯化了 11个噬菌体克隆，而且根据噬菌体竞争ELISA的测定，都显示出改善的对LRP3. E3-E4的亲和力。这些克隆的序列展示出⑶R-H1、⑶R-H3和⑶R-L3中I至6个氨基酸的变化。使用BIAcore仪器通过表面等离振子共振分析来评估纯化的抗体的解离速率常数。牛物层干渉LRP6蛋白结合测定法实施生物层干涉，如先前记载的(Bourhis等,2010)。简言之，使用AviTag系统(GeneCopoeia)自杆状病毒感染的昆虫细胞纯化生物素化、带His标签的LRP6蛋白。使用加载有20 μ g/ml LRP6蛋白的链霉亲合素高结合FA传感器在Octet RED系统(ForteBio)上测量结合动力学。自R&D Systems获得不含载体的纯化的人Wnt3a和小鼠Wnt9b，并生成纯化的DKKl蛋白，如先前记载的(Bourhis等，2010)。肿瘤和骨研究将来自MMTV-Wntl转基因小鼠的肿瘤在C57BL/6小鼠的乳房脂肪垫中传代，机械和酶促解离，在Matrigel和Hank氏平衡盐溶液(HBSS)中重悬浮，并注射入无胸腺NCr裸鼠(Taconic)的乳房脂肪垫。一旦肿瘤体积达到250-800mm3就启动处理。对于每一个处理组，每两天给十只小鼠腹膜内(IP)施用30mg/kg抗体或蛋白质。使用测径器测量来分析肿瘤体积。实施Ntera-2异种移植物肿瘤生长和体内研究，如先前记载的(DeAlmeida等，2007)。简言之,给NU/NU无胸腺裸鼠(Charles River)皮下注射每只小鼠I千万个Ntera-2细胞(在HBSS中的50%Matrigel中)，分成四或五只动物的组(一旦均值肿瘤体积达到535_595mm3),并注射一剂 IP 100mg/kg 抗体或 30mg/kg Fzd8CRD_Fc 蛋白。处理后 16h 收集肿瘤和血清样品。使用TissueLyser系统(QIAGEN)将肿瘤勻楽并使用RNeasy试剂盒(QIAGEN)提取 RNA。收获并培养颅盖，如Mohammad等，2008记载的。简言之，自2日龄小鼠幼畜解剖颅盖，切成两半，并与硬脑膜、血管和头皮分开。将颅盖在组织培养板中在补充有O. 1%牛血清清蛋白和100U/ml青霉素和链霉素的BGJb培养基中培养I天，之后用10 μ g/ml抗体或蛋白质处理7天。在5%C02的增湿气氛中于37° C培养骨。用μ CT 40 (SCANCO Medical,Basserdorf, Switzerland) χ-射线micro-CT系统对小鼠颉盖成像。用下述参数获取 micro-CT数据χ-射线管能量水平=45kV，电流=177 μ Α,积分时间=300msec，2000次发射。以各向同性分辨率6μπι获得轴向图像。使用羟磷灰石(HA)幻影进行校准。用Analyze(AnalyzeDirect Inc. , Lenexa, KS, USA)分析micro-CT扫描。为每一份样品创建横断面的
三维表面描绘和最大强度发射。使用Trace工具手工绘制顶骨边界以分割顶区。在此区内，计算样品体积和均值骨矿物质密度(BMD)。将阈值0. 3gm-HA/cm3应用于该区以计算该区内仅仅钙化组织的均值BMD。还使用该阈值来计算顶区钙化体积百分比，通过钙化体素数目除以顶区总体素来进行。为每一份样品分析下述参数顶区体积，顶区钙化体素BMD，和顶区钙化百分比。如果Dunnett氏检验的P值小于0. 05，那么认为组间差异是显著的。所有使用小鼠的实验依照Genentech科研动物护理和使用委员会方针来实施。实施例2Wnt拮抗件和强化件LRP6单克降抗体的分离为了开发候选治疗性分子来操控Wnt信号传导，生成了能抑制或增强由fct3a蛋白诱导的信号传导的抗体。使用重组LRP6. El-E2-Fc (SEQ ID NO :30)和LRP6. E3_E4_Fc(SEQ ID NO 31)蛋白来筛选人合成Fab噬菌体展示库并通过ELISA确认分离的噬菌体克隆的LRP6的结合。分离了 24个针对LRP6. E1-E2的独特抗体重链克隆和22个针对LRP6.E3-E4的克隆，重定形式并表达成人IgGl抗体。六种LRP6. E3-E4抗体以浓度依赖性方式抑制用0. lmg/ml纯化的Wnt3a诱导的HEK293细胞中的Wnt萤光素酶报告物活性(图1A。除非另外指明，这幅和所有其它图的误差条代表至少3份重复样品的标准偏差)。将这些抗体命名为 YW211. 03、YW211. 08、YW211. 11、YW211. 12、YW211. 31 和 YW211. 33。LRP6. E1-E2抗体无一展现出这种抑制。识别LRP6. E3-E4域的YW211. 31抗体是在抑制经Wnt3a刺激的HEK293细胞中的信号传导方面最有效力的，IC5tl为大约lug/ml (或6nM)。YW211. 31抗体抑制Wnt3a诱导的LRP6磷酸化和β -联蛋白蛋白质稳定化，不影响LRP6蛋白的水平，与纯化的Fzd8CRD和DKKl蛋白类似(图1B，显示未刺激的或用Wnt3a诱导并用所示LRP6抗体或纯化的蛋白质处理的HEK293细胞的Western分析(显示b_肌动蛋白和GAPDH蛋白水平作为样品加载对照))。RNAi实验证明了仅仅受到b-联蛋白多克隆抗体识别的较低分子量条带代表b-联蛋白蛋白质。YW211. 31抗体还能拮抗小鼠Lrp6功能，因为它部分抑制小鼠NIH/3T3细胞中的由Wnt3a诱导的报告物活性和小鼠L细胞中的β -联蛋白蛋白质稳定化。YW211. 31抗体具有约2ηΜ (根据表面等离振子共振(SPR))和O. 6ηΜ (根据Scatchard分析)的结合亲和力。为了改进YW211. 31抗体的亲和力和潜在效力，使用带His标签的LRP6 Ε3-Ε4蛋白和⑶R组合库(其中靶向选定⑶R残基进行随机化)对该克隆进行亲和力成熟。将四个根据噬菌体竞争ELISA显示出亲和力改善最多的噬菌体克隆，即 YW211. 31. 11、YW211. 31. 11,35, YW211. 31. 57 和 YW211. 31. 62 重定形式并表达成全长人IgG。四种亲和力成熟的IgG的解离速率常数都降低了，导致最好的两种抗体即YW211. 31. 57 和 YW211. 31. 62 的改善的亲和力分别为 KD O. 27 和 O. 17nM。YW211. 31. 57 和YW211. 31. 62还在抑制经Wnt3a刺激的HEK293细胞中的信号传导方面显示出改善的效力，IC50 值为大约 O. I μ g/ml (O. 6nM)。
在外源Wnt3a蛋白刺激缺失下，在筛选中分离的抗体无一激活HEK293细胞中的信号传导，然而五种LRP6 E1-E2和两种E3-E4抗体将Wnt3a诱导的信号传导强化至少2倍。在小鼠NIH/3T3细胞中，YW210. 09 (一种E1-E2抗体)也将Wnt3a诱导的信号传导强化至少I. 5倍，指示它也识别小鼠LRP6。在HEK293细胞中，YW210. 09抗体增强Wnt3a诱导的信号传导的程度与fct3a浓度成比例(图1C)。YW210. 09抗体与人LRP6 E1-E2蛋白相互作用，根据SPR分析的测量，KD为5nm。ELISA测试显示了所有拮抗性和强化性抗体仅仅特异性结合分离它们所采用的LRP6蛋白片段，而且无一识别E1-E2和E3-E4 二者。FACS分析指示可溶性LRP6 E1-E4蛋白有效且完全阻断YW21L 31. 57和YW210. 09结合HEK293细胞，指示这些抗体不识别其它细胞表面蛋白。实施例3LRP6单克降抗体对自分泌Wnt信号传导的影响使用多种肿瘤细胞系测定了 LRP6抗体拮抗或强化内源或自分泌Wnt信号传导的能力(Bafico 等，2004 ;DeAlmeida 等，2007 ；Akiri 等，2009)。在畸胎癌细胞系 PA-I 和NTERA-2中，YW211. 31抗体抑制由自分泌Wnt信号传导诱导的报告物活性，效力与对外源Wnt3a观察到的效力类似(图2A，显示用萤光素酶报告物转染并用单独的或组合的LRP6抗体，或Fzd8CRD-Fc蛋白(阳性对照)处理的PA-I畸胎癌细胞中自分泌Wnt信号传导的浓度依赖性抑制和强化)。在PAl细胞中，对内源Wnt靶基因的表达也观察到YW211. 31抗体对Wnt信号传导的抑制(图2B)。图2B显示用或不用O. 3mg/ml Wnt3a蛋白处理，且用10mg/ml YW211.31抗体、抗gD单克隆抗体(作为阴性对照)、或Fzd8CRD-Fc蛋白(作为阳性对照样品)处理的PA-I细胞中(并另外相对于来自不添加(NA) Wnt3a的细胞的样品标准化)Wnt诱导的基因SAXl和GADl和Wnt阻抑的基因LEFTY2的qPCR表达分析结果。该抗体部分抑制由外源Wnt3a蛋白诱导或由内源、自分泌Wnt信号传导维持的SAXKGADI和APCDDl表达。相反，YW211. 31抗体解除Wnt3a蛋白或自分泌Wnt信号传导对LEFTY2表达的阻抑。与YW211. 31不同，根据报告物基因测定法，YW210. 09抗体强化PA-I和NTERA-2细胞系中的Wnt3a诱导的和自分泌的Wnt信号传导二者(图2A)。虽然YW211. 31. 57抗体对Wnt信号传导的抑制随抗体浓度升高而逐渐升高,但是potentiation by YW210. 09和其它抗体的强化作用可以在一些细胞类型(诸如PA-I细胞)中在高抗体浓度降低。这可能提示受体LRP6 二聚化是强化所需要的，因为高抗体浓度会有利于单价相互作用且如此限制LRP6分子交联。用YW211. 31. 57和YW210. 09抗体二者的组合处理PA-I或NTERA-2细胞拮抗Wnt3a诱导的和自分泌的Wnt信号传导二者，与单独的YW211. 31. 57的效果类似。为了鉴定别的展示自分泌Wnt信号传导的细胞系，对具有相对较高轴蛋白2 (Axin2) mRNA表达或磷酸-LRP5/6的细胞系在Wnt萤光素酶报告物基因测定法中测试Fzd8CRD-Fc蛋白对Wnt信号传导的抑制。9种细胞系展现受Fzd8CRD-Fc蛋白抑制的自分泌Wnt信号传导，包括NSCLC细胞NCI-H23和NCI-H2030和软组织肉瘤细胞SW872和HT-1080，先前基于使用其它Wnt拮抗剂的测定法报告了它们具有内源Wnt信号传导(Guo等，2008 ；Akiri等,2009 ；Nguyen等,2009)。图3显示通过单向方差分析(ANOVA)分析的数据的汇总(P值〈O. 01)。使用10mg/ml抗体实施测定法，NCI-H358和HT-1080细胞除外，它们分别用lmg/ml YW211. 31. 57或YW210. 09抗体来处理，以提高强化效果。在所有九种细胞系中通过外源Wnt3a蛋白进一步诱导Wnt信号传导，而且YW211. 31. 57抗体抑制这种对Wnt3a的响应(图3、4A、4D和4F)。令人惊讶地，YW211. 31. 57抗体在所有九种这些细胞系中强化自分泌Wnt信号传导，而YW210. 09在五种细胞系中强化而在三种细胞系中抑制自分泌Wnt信号传导(图3、4A-4C、4E和4F)。不仅使用萤光素酶报 告物而且对六种测试细胞系中内源fct靶基因诸如轴蛋白2的表达观察到YW211. 31. 57抗体对自分泌和Wnt3a诱导的信号传导的这种相反活性(图4A、4B和4C)。在EKVX和乳腺癌Hs578T细胞系中，确认了 YW211. 31抗体对Wnt信号传导的提高依赖于自分泌Wnt，这是通过证明这种提高受FzdSCRD-Fc蛋白阻断而实现的(图4G)。用在筛选中鉴定出的Wnt3a诱导的信号传导的其它五种抗体拮抗剂也观察到EKVX和Hs578T细胞中自分泌Wnt信号传导的强化。在图4A 中，HT-1080、EKVX、NCI_H358 和 Hs578T 中轴蛋白 2mRNA 的 qPCR表达分析指示YW211. 31. 57 (25mg/ml)抗体强化自分泌(NA)Wnt信号传导且抑制由Wnt3a (O. 2mg/ml)诱导的信号传导，而Fzd8CRD-Fc (25mg/ml)拮抗自分泌(NA)和Wn3a诱导的信号传导二者。在图4B和4C中，NCI-H23 (B)和M14 (C)细胞中Wnt诱导的基因的表达受YW211. 31. 57强化且受 YW210. 09 抗体拮抗(30mg/ml)。显不 Wnt3a (O. 2mg/ml)和 Fzd8CRD_Fc (30mg/ml)处理分别作自分泌fct信号传导为强化和抑制的阳性对照，而CD4-Fc蛋白(B)或抗gD抗体(C )充当阴性对照(30mg/ml )。对于肌4细胞(0，与AP⑶DI和ZNRF3表达相比，轴蛋白2和SP5表达受Wnt3a蛋白或YW211. 31. 57抗体强化更有力。图4D和4E显示在稳定整合有Wnt萤光素酶报告物的Hs578T细胞中，YW211. 31. 57抗体显示出浓度依赖性抑制Wnt3a刺激的信号传导(D)和强化自分泌fct信号传导(E),而在有或无(NA) O. lmg/ml Wnt3a刺激的情况中，Fzd8CRD-Fc蛋白抑制而YW210. 09抗体强化信号传导。RNAi实验指示Hs578T细胞中至少41%的Wnt3a诱导的信号传导依赖于LRP5表达，而且这种信号传导预测受Fzd8CRD-Fc蛋白而非YW211. 31. 57抗体抑制。在这个实验中，没有为了标准化来转染SV40驱动的萤光素酶，而且改为，独立确认抗体和蛋白质处理对这种细胞系的存活力没有显著影响。图4F和4G显示用Wnt萤光素酶报告物转染的EKVX细胞也展示YW211. 31. 57抗体对自分泌Wnt信号传导的强化和对Wnt3a诱导的信号传导的拮抗。抗体介导的对自分泌Wnt信号传导的强化受5mg/ml Fzd8CRD_Fc蛋白抑制。实施例4LRP6抗体对不同Wnt同等型的相反活件
YW211. 31抗体抑制所有细胞系中由外源Wnt3a蛋白诱导的信号传导，但是能以细胞系依赖性方式抑制或强化自分泌fct信号传导，提示驱动自分泌信号的特定fct同等型规定该抗体的活性。因此，测定该抗体对由fct3a和其它Wnt同等型外源表达诱导的信号传导的活性。HEK293或Hs578T细胞中由Wnt3a转染诱导的Wnt信号传导受YW211. 31. 57抗体抑制，效力与对由Wnt3a蛋白处理诱导的信号传导的抑制类似。令人惊讶地，两种细胞系中由Wntl表达诱导的信号传导受YW211. 31. 57抗体强化。Wntl和Wnt3a信号传导二者受Fzd8CRD-Fc蛋白抑制，正如预期的。用筛选中鉴定的其它fct3a拮抗性抗体也观察到对Wntl信号传导的强化。YW210. 09抗体也展示出针对Wnt3a-和Wntl-诱导的信号传导的相反活性，它们与YW211. 31. 57活性相反；8卩，对Wnt3a的强化和对Wntl信号传导的抑制。YW210. 09抗体还抑制在来自MMTV-Wntl小鼠肿瘤的培养物中培养的肿瘤细胞中的Wntl信号传导，如通过fct靶基因轴蛋白2和Mmp7的表达降低至与Fzd8CRD-Fc蛋白处理类似的程度而观察到的。在MMTV-Wntl细胞中，YW211. 31. 57抗体未能强化Wntl信号传导，可能是因为Wntl信号传导在这些细胞中已经最大了。证明了 YW211.31.57和YW210. 09抗体对Wnt3a和Wntl启动的Wnt信号传导具有相反活性后，还对在HEK293细胞中将萤光素酶报告物诱导超过2倍的19种Wnt基因中的·另外11种实施这种分析。图5提供数据的汇总，使用10 μ g/ml抗体、10 μ g/ml Fzd8CRD实施测定法。只有fct3a和Wnt3活性受YW211. 31. 57抗体抑制，而且二者受YW210. 09强化。在Wntl之外的7种Wnt同等型受YW211. 31. 57强化且受YW210. 09抑制。第三类Wnt同等型(Wnt7a、7b和IOa)展现不受任一抗体抑制且至少受YW211. 31. 57强化的信号传导活性。在用不同fct同等型转染的Hs578T细胞中，抗体展示大多数这些相同活性。特别地，YW211. 31. 57抑制Wnt3和Wnt3a且强化所有11种将萤光素酶报告物诱导至少2倍的其它Wnt同等型。YW210. 09也强化Hs578T细胞中的Wnt3和Wnt3a，以及抑制在HEK293细胞中受到拮抗且能够在Hs578T细胞中测试的7种Wnt同等型中的5种。这个类别中的另两种Wnt同等型(即Wnt8a和Wnt9b)在Hs578T细胞中不受YW210. 09抗体影响。由于RNAi实验指示Hs578T而非HEK293细胞中的Wnt3a信号传导由LRP6和LRP5 二者转导，因此Wnt8a和Wnt9b在Hs578T细胞中可能主要经由LRP5发信号。正如在HEK293细胞中那样，第三类的fct同等型在Hs587T细胞中不受任一抗体抑制，而且我们可以将Wnt4添加至这个类另iJ，Wnt4在HEK293细胞中不诱导信号传导。这个类别中只有fct7b的活性表现出差异，即YW210. 09抗体在Hs578T而非HEK293细胞中强化其信号传导。与YW211. 31. 57和YW210. 09抗体的Wnt同等型特异性活性不同，Fzd8CRD-Fc蛋白能有力地抑制HEK293细胞中除Wnt6和Wnt9b外的所有Wnt的活性。在Hs578T细胞中，自分泌Wnt信号传导受YW211. 31. 57和YW210. 09抗体二者强化，正如由Wnt4、Wnt7a和Wnt7b表达诱导的信号传导。如此，这三种Wnt同等型是Hs578T细胞中驱动自分泌信号传导的候选Wnt同等型。多种针对Wnt7b而且其它Wnt同等型的siRNA抑制Hs578T细胞中的自分泌信号传导，鉴定出介导信号传导的特定fct蛋白。因为PA-I细胞中的自分泌Wnt信号传导受YW211. 31. 57抗体抑制且受YW210. 09强化，所以Wnt3或Wnt3a很可能激活这些细胞中的内源信号传导。确实，针对fct3而非Wnt3a的siRNA抑制PA-I细胞中的自分泌Wnt信号传导。在NCI-H23NSCLC细胞中和在M14黑素瘤细胞中，YW211. 31抗体对自分泌Wnt信号传导的强化和YW210. 09的拮抗与Wnt2 RNAi抑制NCI-H23细胞中的内源信号传导及与M14细胞中的内源Wntl表达一致。使用多种siRNA，我们确认了 NCI-H23细胞中的Wnt2表达和M14细胞中的Wntl是自分泌Wnt信号传导所需要的。由于所有自实施例2中的筛选分离的拮抗经Wnt3a刺激的HEK293细胞中的信号传导的抗体也抑制测试的所有其它细胞系中的fct3a刺激，而且也抑制畸胎癌细胞系中的自分泌fct信号传导，出乎意料的是这些抗体强化测试的其它9种细胞系中的自分泌Wnt信号传导。另外，YW210. 09抗体强化测试的所有细胞系中的Wnt3a信号传导且增强7种细胞系中的自分泌fct信号传导，但是它抑制另3种系中的内源信号传导。这些研究显示了不同Wnt同等型(在相同细胞系中表达)决定LRP6抗体的活性，而且Wnt3a拮抗性和强化性抗体对大多数其它Wnt蛋白也具有相反效果。研究还显示了将不同Wnt同等型导入相同细胞系决定LRP6抗体的活性，而且Wnt3a拮抗性和强化性抗体对大多数其它Wnt蛋白也具有相反效果。根据它们与两种LRP6抗体的功能性相互作用，测试的14种Wnt同等型可以分组成三个类别Wnt3 和 Wnt3a 受 YW211. 31 抑制且受 YW210. 09 强化；ffnt l、2、2b、6、8a、9a、9b和IOb受YW211. 31强化且受YW210. 09拮抗;而听^ 4、7a、7b和IOa受YW211. 31强化且不受YW210. 09抑制(图5)。这些分类明显不符合Wnt基因的建议系统发生，尽管Wnt3/3a 亚家族是进化上分歧最大的(Cho等，2010)。实施例5ffnt同等型规定LRP6抗体的不同活性不同Wnt同等型可能优先结合各种细胞系中内源表达的不同FZD同等型，而且能令人信服地说明我们的LRP6抗体的差异活性。为了检查这种可能性，构建了共价连接不同Wnt-FZD对的嵌合蛋白来测试特定Wnt或FZD同等型是否决定LRP6抗体的活性。在内源Wnt表达假定缺失下，与FZD4或FZD5任一融合的Wnt3a或Wntl有力激活HEK293细胞中的Wnt信号传导，而FZD4或FZD5过表达不诱导Wnt信号传导。YW211. 31. 57抗体抑制与FZD4或FZD5任一融合的Wnt3a的信号传导活性，且强化与FZD4或FZD5任一融合的Wntl的活性(图6提供数据的汇总，使用10 μ g/ml抗体、10 μ g/ml Fzd8CRD实施测定法)。YW210. 09抗体针对Wntl嵌合物显示出相反活性,抑制二者。如此,该抗体的活性与fct同等型,而非FZD同等型有关。Fzd8CRD-Fc蛋白对由任何四种Wnt-FZD嵌合物诱导的信号传导没有影响，与嵌合物发挥功能不依赖于Wnt的FZD结合位点一致。与LRP6过表达相比，将Wntl或Wnt3a融合至LRP6的嵌合物的表达更强地诱导Wnt信号传导。YW211. 31. 57和YW210. 09抗体不能抑制这种诱导，与抗体的抑制功能依赖于阻断Wnt结合LRP6的假说一致(图6)。这项研究确认了 Wnt而非FZD的同等型决定抗体的活性。Wnt同等型与LRP6而非FZD的嵌合蛋白融合物对LRP6抗体的抑制作用不敏感，提示拮抗可能通过阻断配体-共同受体相互作用来介导。这得到了 Wnt3a和YW210. 09抗体(二者在LRP6的E3-E4区内竞争性结合)及Wnt9b和YW211. 31抗体(它们在E1-E2区内竞争结合)的体外结合研究的确认。两种LRP6抗体的表位各自限定不同类别的Wnt同等型的结合位点，一个在E1-E2内而一个在E3-E4域内。为不受任一抗体及其组合抑制的同等型预测了至少第三个fct结合位点，而且似乎有可能四个重复域各自结合fct同等型不同子集。这种模块组织可能容许不同Wnt及其结合位点的结构分歧以适应结合Wnt的和结合共同受体的拮抗剂分别诸如SFRP和DKK蛋白同等型的差异调节。
实施例6抗体介导的对Wnt信号传导的强化牵涉LRP6 二聚化YW211. 31抗体对自分泌Wnt信号传导的强化需要亲合效应，大概是经由LRP6 二聚化。YW211. 31的单价Fab片段和重组一臂YW211. 31抗体在抑制EKVX和Hs578T细胞中Wnt3a诱导的信号传导的浓度展现出不强化这些细胞系中的自分泌Wnt信号传导。相反，YW211. 3IFab片段和一臂mAb抑制PA-I畸胎癌细胞系中的自分泌Wnt和Wnt3a诱导的信号传导二者，效力与完整IgG抗体类似。为了测试一臂YW211. 31抗体的交联是否会恢复完整IgG分子的Wnt强化功能，使用展现出由YW211. 31. 57抗体强化自分泌Wnt和Wnt2诱导的信号传导的HT-1080软组织肉瘤细胞系，以及由Fe交联增强的Apomab抗体诱导的凋亡(Adams等，2008)。一臂YW211. 31抗体对自分泌Wnt信号传导或由Wnt2转染诱导的信号传导没有影响。在提升Apomab介导的凋亡的抗Fe抗体的交联条件下,确定了一臂抗体的交联部分重建用YW211. 31. 57完整抗体观察到的对自分泌Wnt和Wnt2信号传导二者的强化。
抗体介导的Wnt强化需要共同受体二聚化，因为一臂和Fab抗体形式未能增强Wnt信号传导，除非交联。另外，本文中呈现的基于细胞的和生化的数据指示fct结合交联的LRP6也是强化信号传导所必需的，大概是反映对由Wnt介导的将FZD募集入复合物中的需要。一小部分过表达的LRP6可鉴定为细胞表面的同二聚体，而且二聚化需要胞外域，然而不清楚这是否有助于由LRP6过表达诱导的Wnt非依赖性b-联蛋白信号传导(Liu等，2003)。删除LRP6胞外域也以不依赖Wnt的方式激活信号传导，而且通过不同方法迫使这种重组蛋白胞外二聚化能增强或抑制这种活性(Liu等,2003 ；Cong等,2004)。Wnt在质膜处诱导LRP6聚集和磷酸化，二者需要胞内DVL蛋白的同寡聚化功能(Bilic等，2007)。这些大聚集物也含有轴蛋白和GSK3，且有可能抑制b-联蛋白降解。实施例7通过抑制Wnt拮抗剂的结合，抗体介导的对Wnt信号传导的强化抑制胞外LRP6拮抗剂诸如DKKI同等型和SOST的活性也能强化Wnt信号传导(Niida等，2004)。外源DKKl蛋白抑制HEK293细胞中Wntl诱导的信号传导，而且YW211. 31. 57抗体能阻断这种拮抗且甚至在DKKl蛋白存在下在足够高的浓度强化信号传导(图4G)。相反，YW211. 31 一臂抗体在这些相同浓度只是非常弱地抑制DKKl对Wntl信号传导的拮抗。YW211. 31. 57完整抗体在测试的所有DKKl浓度有效拮抗DKKl活性，而一臂抗体甚至在低DKKl浓度具有最低限度的效果或没有效果。用完整而非一臂YW211. 31抗体观察到的对外源DKKl活性的有力拮抗可能归于完整抗体特异性的Wnt强化活性。或者，由于DKKl蛋白不能完全抑制这种测定法中Wntl诱导的信号传导，因此也有可能完整YW211. 31抗体仅仅经由LRP6 二聚化强化剩余信号。由于抗体对DKKl与LRP6相互作用的抑制不必然赋予fct强化活性，而且DKKl拮抗似乎需要LRP6 二聚化，因此对DKKl活性的抑制有可能主要由Wnt结合共同受体对残余信号传导的强化来介导。实施例8ffnt信号传导拮抗在LRP6抗体组合中占优势上述测定法指示Wnt3a和Wnt3在LRP6的E1-E2区内结合且受YW211. 31. 57抗体抑制而免于结合。预测fctl类的Wnt同等型结合E3-E4区，而且这种结合受YW210. 09抗体阻断。不受任一理论束缚，对fct信号传导的强化能在Wnt同等型和抗体二者能够结合同一 LRP6分子时发生，大概需要Wnt对FZD的募集和抗体对LRP6的二聚化。这种模型预测两种抗体的组合会抑制由任一类fct同等型诱导的信号传导，因为虽然LRP6 二聚化会仍有可能发生，但是fct结合会被一种或另一种抗体阻断。正如预测的，同时用YW211. 31. 57和YW210. 09抗体处理HEK293细胞抑制由Wnt3a或Wntl任一表达启动的信号传导(图7和8A)。在稳定整合有Wnt萤光素酶报告物的、用Wnt3a、Wntl任一或Wnt3a和Wntl 二者的表达构建物转染的HEK293细胞中实施图8A所示测定法。所有抗体和蛋白质各自以10 μ g/ml使用。将这种分析延伸至fctl类的另三种Wnt同等型，而且发现YW211. 31. 57和YW210. 09抗体的组合抑制Wnt信号传导，程度与单独的YW210. 09类似(图7)。在同时表达Wnt3a和Wntl 二者时,两种抗体都不拮抗Wnt信号传导,但是两种抗体的组合确实抑制信号传导(图8A)。这种结果一种可能的解释是每一种抗体只抑制一种Wnt同等型的结合，而且两种抗体能够同时结合LRP6分子以阻断两个Wnt结合位点。不受YW211. 31. 57或YW210. 09抗体拮抗的第三类的四种Wnt同等型可能结合LRP6上不受两种抗体任一阻断的位点，或者它们可能具有结合由抗体限定的Wnt结合位点任一的能力。对于每一种这些fct同等型，两种抗体的组合也不抑制它们的信号传导，而是强化或不影响它们的活性，提示这些Wnt同等型能结合与YW211. 31. 57和YW210. 09表位不·同的位点(图7)。观察到的YW211. 31. 57和YW210. 09抗体组合对由外源Wnt同等型诱导的Wnt信号传导的活性也延伸至内源、自分泌Wnt信号传导。在YW211. 31. 57抗体抑制而YW210. 09强化自分泌fct信号传导的畸胎癌细胞系PA-I和Ntera-2中，抗体组合抑制信号传导(图2A)。在两种抗体强化自分泌Wnt信号传导的Hs578T和EKVX细胞中，抗体组合也起到了强化作用(图8B和8C)。实施例9LRP6抗体差异抑制Wnt结合多种位点LRP6抗体的相反活性提示YW211. 31. 57和YW210. 09与LRP6上的不同Wnt同等型结合位点相互作用，而且fct结合受到拮抗性抗体的竞争但受到强化性抗体的允许。测量纯化的fct蛋白对纯化的、固定化的LRP6胞外域蛋白质片段的结合的生物层干涉测定法(见实施例I)证明了 Wnt3a结合LRP6的E3-E4区(YW211. 31. 57抗体的表位驻留在那里)，而且Wnt9b (与Wntl属于抗体相互作用的同一类别)只结合E1-E2区(YW210. 09抗体也结合那里)(Bourhis 等(2010)。YW211. 31. 57 抗体而非 YW210. 09 抑制 Wnt3a 结合 LRP6. E1-E4蛋白质片段(图9A)。相反，YW210. 09而非YW211.31.57抑制Wnt9b结合LRP6. E1-E4 (图9B)。在这些测定法中，容许结合LRP6蛋白的抗体达到平衡，而且随后为Wnt蛋白结合的结合和解离阶段显示干涉样式的波长移动。抗体介导的对Wnt结合的抑制也能使用较小的Wnt结合片段来检测，即Wnt3a的E3-E4和Wnt9b的E1_E2(图9C和9D)。一臂YW211. 31抗体也能抑制Wnt3a结合E3-E4片段。还有，YW211. 31. 57和YW210. 09能在没有竞争的情况中及在以任一次序添加时序贯结合LRP6. E3-E4蛋白(图9E)。LRP6蛋白上的不同位点处只在Wnt3a和YW211. 31. 57抗体之间和只在Wnt9b和YW210. 09之间的结合竞争与每一种抗体针对由特定Wnt同等型进行的信号传导的抑制活性有关。
生物层干涉测定法先前显示了纯化的DKKl蛋白能结合LRP6的E3-E4和E1-E2片段二者，而且这种结合能抑制Wnt3a和Wnt9b结合这些相应蛋白质区(Bourhis等,2010)。使用这种测定法来显示YW211. 31. 57和YW210. 09抗体各自能抑制DKKl结合LRP6. E1-E4蛋白。YW211. 31. 57抗体还抑制DKKl结合LRP6. E3-E4蛋白，而YW210. 09抗体阻断DKKl结合LRP6. E1-E2片段。一臂YW211. 31抗体完全保留这种抑制活性，即使它不能强化fct信号传导也不能显著拮抗外源DKKl对细胞中Wnt信号传导的活性。这个结果提示DKKl拮抗有可能对抗体介导的对fct信号传导的强化没有显著贡献。实施例10LRP6抗体对Wnt驱动的肿瘤和骨形成有活性为了开始探索LRP6抗体的抗肿瘤治疗功效，处理Wnt配体驱动的肿瘤的两种模型。MMTV-Wntl转基因乳房肿瘤同种异体移植物依赖于Wntl表达而Ntera-2人畸胎癌异 种移植物由未知Wnt同等型的自分泌Wnt信号传导驱动(DeAlmeida等，2007)。使用来自MMTV-Wntl转基因小鼠乳房肿瘤分离的细胞在无胸腺小鼠中建立肿瘤，每两天用抗体处理。用YW210. 09抗体观察到快速且持续的肿瘤消退，与Fzd8CRD-Fc蛋白类似(图10A)。与对照缓冲液(PBS)或抗gD抗体处理相比，YW211. 31. 57抗体在这些条件下不改变肿瘤生长。每两天(箭头)给小鼠施用30mg/kg抗体或蛋白质(图10A)。这些结果与上文关于组织培养中处理的MMTV-Wntl肿瘤细胞描述的抗体对Wnt靶基因表达的影响一致。也使用Ntera-2畸胎癌细胞来在无胸腺裸鼠中建立异种移植物肿瘤，用两种抗体任一或 Fzd8CRD-Fc 蛋白处理。自用抗体 YW211. 31. 57、一臂 YW211. 31、或 YW21L 31. 57 和YW210. 09的组合处理的肿瘤提取的RNA揭示了 Wnt靶基因SP5的表达降低至自注射缓冲液的对照小鼠的肿瘤的水平的41-57%，而Fzd8CRD-Fc蛋白处理将SP5表达降低至8. 0%。将SP5mRNA水平相对于同一肿瘤内的GAPDH mRNA水平标准化，并另外相对于PBS处理的肿瘤标准化。根据AN0VA，除YW210. 09外的所有处理展示出与PBS对照相比的p值〈O. 005 (图10B)。Fzd8CRD-Fc将轴蛋白2表达降低至只有56. 2%，而对任何抗体处理没有检测到轴蛋白2表达的显著变化。YW210. 09抗体处理没有显著影响SP5或轴蛋白2任一的表达。测定对HEK293细胞中Wnt3a诱导的信号传导的抑制或强化的血清样品确认了注射的抗体和蛋白质在整个16-h暴露中保留至少一些体内活性。由于通过增强成骨细胞分化和功能及间接通过抑制破骨细胞分化，对Wnt信号传导的激活或强化能增加骨量(Glass等，2005)，测试了 LRP6抗体对器官型培养(organotypic culture)中的小鼠颉盖骨的活性。在有抗体或RANK-Fc的情况中培养显微解剖的颅盖外植块，然后通过微型计算机化断层摄影术来分析顶骨体积和密度。使用对对照样品的柱状图分析，为钙化(骨)和非钙化(软骨)组织定义X-射线衰减范围。YW210.09抗体处理将钙化顶骨的均值骨矿物质密度(BMD)显著提高7. 4%，与对RANK-Fc处理抑制破骨细胞分化观察到的6. 8%提高类似(图IOC ；Hsu等，1999)。YW211. 31. 62抗体处理没有显著改变钙化顶骨BMD。所有处理为10 μ g/ml抗体或蛋白质7天。在图IOC中，数据点代表来自每一个处理组的四只小鼠的八块半块颅盖；均值和均值的标准误差分别以水平和垂直线显示。只有YW210. 09和RANK-Fc处理与未处理样品有显著差异，Dunnett氏检验的p值分别小于O. 01和O. 05 (二者的t检验均〈O. 05)。抗体或RANK-Fc处理没有显著改变总顶骨区(钙化和非钙化)的体积和这个区中钙化骨的比例，提示YW210. 09抗体可能在没有总体改变细胞增殖的情况中增强矿化。实施例11LRP6双特异性抗体起泛Wnt抑制剂的作用使用结节-入-空穴工程(Atwell等，1997)来构建具有YW211. 31. 62和YW210. 09重链异二聚体的双特异性IgG杂合物。这种在大肠杆菌或HEK293细胞中生成的LRP6双特异性抗体拮抗HEK293细胞(图11A)和肿瘤细胞系PA-I、M14和CAL-51 (图11C)中Wnt3a诱导的(O. I μ g/ml)信号传导。值得注意地，该双特异性抗体至少像YW211. 31那样有力地抑制且不保留YW210. 09的Wnt3a强化活性。该双特异性抗体还抑制测试的所有三种肿瘤细胞系中的自分泌Wnt信号传导(图11B)，保留YW211. 31抗体在PA-I细胞中的和YW210. 09在M14细胞中的抑制活性。有趣的是，即使YW211. 31强化而YW210. 09不影响CAL-51乳腺癌细胞中的自分泌Wnt信号传导，该双特异性抗体抑制信号传导。对YW211. 31和YW210. 09抗体的组合没有观察到这种新的拮抗活性。在上述测定法中，在有(IlC)或无(IlB) O. Iyg/ ml Wnt3a刺激的情况中用所示对照缓冲液(PBS )、抗体、抗体组合、或Fzd8CRD_Fc蛋白(10 μ g/ml每种)处理稳定整合有Wnt萤光素酶报告物的PA-I和M14细胞，和转染有报告物的CAL-51细胞。在对HEK293细胞中由转染13种Wnt同等型诱导的信号传导测试时，该双特异性抗体有力地抑制所有受YW211. 31或YW210. 09任一阻断的Wnt (图12)。表12中汇总的测定法测定抗体或蛋白质(10 μ g/ml)对稳定整合有Wnt萤光素酶报告物的HEK293或Hs578T细胞系中由转染fct同等型的表达构建物诱导的信号传导的影响。将报告物活性相对于细胞数标准化并另外相对于用相同表达构建物转染但未用抗体或蛋白质处理的细胞中的水平标准化。使用抗gD作为对照。当倍数变化值在用对照抗gD抗体处理观察到的范围之外时，认为它们是有关的HEK293细胞中抑制小于O. 80和强化大于I. 30，及Hs578T细胞中抑制小于O. 65和强化大于I. 30。与YW211. 31和YW210. 09抗体的组合类似，而且与单独的任一抗体不同，双特异性抗体阻断由fctl和Wnt3a的组合诱导的信号传导(图12)。出乎意料地，双特异性抗体还降低由不受单独的或组合的同二聚体抗体抑制的三种fct进行的信号传导。在Hs578T细胞中也观察到这些双特异性抗体的这些拮抗活性，缺失对fct7a诱导的信号传导的影响可能除外。检查了该双特异性抗体抑制Wnt3a诱导的β -联蛋白蛋白质稳定化的能力。用YW211. 31、YW210. 09、或双特异性抗体，或用对照Fzd8CRD_Fc蛋白或抗gD以5 μ g/ml的浓度处理有或无fct3a转染的HEK293细胞18h并通过Western印迹分析测定β -联蛋白蛋白质水平和磷酸化LRP5/6水平。图13Α。在ΗΕΚ293细胞中，该双特异性抗体抑制fct3a诱导的联蛋白蛋白质稳定化，与YW211.31类似，与YW210.09(其提高β-联蛋白水平)不同(图13Α)。双特异性和YW211. 31 二者而非YW210. 09抗体阻断高分子量种类的Wnt3a对磷酸化LRP5/6的诱导。令人惊讶地，虽然YW211. 31和YW210. 09不影响总LRP6蛋白的稳态水平，但是双特异性抗体在有或无fct3a诱导的情况中提高LRP6蛋白。在Wnt刺激缺失下，这种稳定化LRP6可具有略微升高的Serl490磷酸化，尽管该双特异性抗体在Wnt缺失下不影响HEK293细胞中的Wnt报告物活性。测定了该双特异性抗体在体内抑制Wnt信号传导的能力。给具有M14黑素瘤异种移植物肿瘤的SCID-bg小鼠注射30mg/kg LRP6双特异性抗体、Fzd8CRD蛋白(阳性对照)、或抗gD抗体(阴性对照)。处理16小时后，提取RNA并通过qPCR来检查Wnt靶基因的表达。将mRNA水平相对于同一肿瘤内的GAPDH mRNA水平标准化，并另外相对于抗gD处理的肿瘤标准化。根据ANOVA，所有双特异性抗体和Fzd8CRD处理展示与抗gD对照相比的p值〈O. 001。如图13B所示，LRP6双特异性抗体抑制作为异种移植物肿瘤培养的M14黑素瘤细胞中的fct信号传导。自用抗体处理的肿瘤提取的RNA显示出Wnt靶基因轴蛋白2和AP⑶Dl的表达分别降低至用对照抗gD抗体处理的肿瘤中的水平的46-57%和35_38%。这些降低的表达水平与那些注射FzdSCRD蛋白观察到的表达水平类似，而且指示双特异性抗体在体内是稳定的且有活性的。实施例12LRP6E1-Yff210. 09Fab 复合物的结构。通过分子置换测定了与YW210. 09Fab复合的LRP6第一 β -螺旋桨和EGF域(也称 作El)的晶体结构并精制.I I 9 A分辨率，R和R游离(Rfree)分别为O. 175和O. 220。晶体学不对称单元由一个LRP6 Ei域和一个YW210. 09Fab构成。可解读电子密度容许描画El域的残基Ala 20至Lys 324和Fab轻链和重链分别的残基Asp I至Glu 213和Glu I至Lys 214，Fab重链残基Ser 127至Thr 131除外(全部使用Kabat编号方式)。以包含β -螺旋桨模块和表皮生长因子(EGF)样模块的模块结构装配LRP6E1域。β -螺旋桨由放射状排列的六个桨片组成，桨片由四链反平行β -片层形成，N-端边缘面对中央通道且YWTD基序位于每一个桨片的第二链中。LRP6E1 β -螺旋桨结构密切类似LDLr的结构(Jeon, H. , et al. , 2001),在245个C-α原子上叠加时1'1118(1为0.83 A5尽管序列同一性只有36%。大多数保守残基集中在形成片层的YWTD核心基序附近，对β-螺旋桨结构完整性至关重要，而表面残基高度多样，有助于这些受体的功能多样性。LRP6利用它的EGF样域来锁定(lock down)螺旋桨的第一和第六桨片并维持它的机械强度。EGF样模块C端经10个残基的接头自β_螺旋桨延伸出去并折叠回β_螺旋桨的底部，停靠至第三和第四桨片之间的表面。EGF和β-螺旋桨之间的相互作用是广泛的，正如1226 Α2的大的总埋藏表面积和O. 74的形状互补性所指示的。EGF模块的第一 β-链中的三个残基(即Leu 296,Leu 298和Met 299)构成疏水性核心，其压入由一些直接或水介导的极性相互作用围绕的螺旋桨的互补腔。在LDLR结构中也观察到这些特征(Jeon，H. , et al. ,2001 ；Rudenko, G. ,et al. ,2002)。YW210. 09Fab识别β -螺旋桨顶部中央的一个区域，即频繁发现牵涉蛋白质_蛋白质相互作用的一个区域(Springer, Τ. Α. ,1998)。互补位由来自五个⑶R的残基构成,包括二个重链⑶R (HU H2、H3)和两个轻链⑶R (LI和L3)。抗体对β -螺旋桨的结合埋藏1691 A2的总面积，形状互补性得分为O. 76。β-螺旋桨顶面上的一个酸性片粗略占据总面积的三分之一但与YW210表位几乎不交叠。相反，重链和轻链识别离散的区域。由重链⑶R形成的直接接触占埋藏面积的80%，其中⑶R Η3单独占超过50%。这个区段由17个残基构成，其中残基His 98至Lys IOOc与β-螺旋桨形成直接接触。重要的是，抗体的Asn100与LRP6的Asn 185生成一对氢键，形成“握手”相互作用(图16)。另外，Val IOOb和Lys IOOc主链不寻常构象将与LRP6的Arg 28相互作用的一个羰基基团放置在背部，并将经由两个水分子(Watl和Wat2)与酸性片相互作用的两个NH基团放置在前部(图14)。LysIOOc侧链还通过与LRP6的Val 70和Ser 96主链羰基生成氢键来中和酸性片。LRP6的Arg141锚定在中部且与桥接水Wat2、LRP6的Asn 185和YW210. 09的Ala IOOa相互作用。Arg141表现出将两个氢键网络整合到一起。另外，Val IOOb侧链停靠β-螺旋桨中央通道中的疏水腔。因此，YW210. 09Η3序列NAVK展现出特别的与LRP6的β -螺旋桨El的结合样式。其它⑶R与β-螺旋桨顶部上的互补位中的残基相互作用。牵涉Η3结合LRP6的其它残基包括E51、D52、V70、S71、E73、L95、S96、D98和E115。Hl和H2触及第五和第六桨片，而LI和L3触及第六、第一和第二桨片(图15)。别的牵涉YW210. 09结合LRP6的LRP6残基包括R29、W188、K202、P225、H226、S243和F266。晶体压缩相互作用没有直接牵涉YW210. 09接触LRP6表位的区域，指示晶体结构应当反映两种分子在溶液中如何相互作用。独特CDRH3NAVKN (SEQ ID NO :49)基序和LRP6 El β -螺旋桨之间的相互作用与层粘连蛋白和巢蛋白之间报告的相互作用高度类似(Takagi，J.，et al.，2003)。在这两种情况中，均经由上文所述Asn握手和进入由β -螺旋桨中央通道顶部形成的疏水腔(其在两种螺旋桨中均由Phe闸关闭)的分支疏水性残基生成显著的接触。人Dkkl呈现一种基序(氨基酸40至44 :NAIKN(SEQ ID NO :50))，除它的Ile 42之外，该基序与YW210. 09的CDR Η3环中找到的基序相同。这种基序在物种和除Dkk3之外的家族成员间是严格保守的，指向这种基序在Dkk生物学中的特定功能。保守基序是在Dkkl的N端找到的，即从前没有考虑(BiOtt，B. K.，和Sokol，S.Y.，2002)且预测扰乱的一个区域。另外，这种特定基序在另两种经由与LRP5/6的相互作用来调节fct信号传导的蛋白质即Sclerostin (Semenov, Μ.，et al. ,2005)和Wise (Itasaki7N. , et al. , 2003)中也是保守的。这两种蛋白质属于同一半胱氨酸结节蛋白超家族(McDonald，N. Q.，和Hendrickson, ff. A.，1993)且在它们的2号环中展示所鉴定基序，也称作这种保守折叠结构的“跟” (Lintern, K. B. , et al. , 2009 ；Veverka, V. , et al,2009)ο实施例13例示件抗LRP6抗体序列表中提供了某些抗LRP6抗体的氨基酸序列。表2-4提供了序列的说明。图16和17中提供了特定抗LRP6抗体的VH和VL域的氨基酸序列比对。表2重和轻链
权利要求
1.一种结合LRP6的分离的抗体，其中该抗体抑制由第一Wnt同等型诱导的信号传导且强化由第二 fct同等型诱导的信号传导。
2.权利要求I的抗体，其中所述第一fct同等型选自下组Wnt3和Wnt3a。
3.权利要求I的抗体,其中所述第二Wnt同等型选自下组Wnt l、2、2b、4、6、7a、7b、8a、9a、9b、IOa和 10b。
4.权利要求I的抗体，其中所述第一fct同等型选自下组Wnt3和Wnt3a,且所述第二Wnt 同等型选自下组ffnt l、2、2b、4、6、7a、7b、8a、9a、9b、10a 和 10b。
5.权利要求I的抗体,其中所述第一Wnt同等型选自下组Wnt l、2、2b、6、8a、9a、9b和10b。
6.权利要求I的抗体，其中所述第二fct同等型选自下组Wnt3和Wnt3a。
7.权利要求I的抗体,其中所述第一Wnt同等型选自下组Wnt l、2、2b、6、8a、9a、9b和10b,且所述第二 Wnt同等型选自下组Wnt3和Wnt3a。
8.权利要求1-4任一项的抗体，其中该抗体结合LRP6的E3-E4区。
9.权利要求I或5-7任一项的抗体，其中该抗体结合LRP6的E1-E2区。
10.一种分离的抗体，其结合LRP6的两个不同区。
11.权利要求10的抗体，其中该抗体结合LRP6的E1-E2区和LRP6的E3-E4区。
12.权利要求10或11的抗体，其中该抗体抑制由Wntl和Wnt3a的组合诱导的Wnt信号传导。
13.权利要求10、11、或12的抗体，其中该抗体抑制自分泌Wnt信号传导。
14.一种抗体，其与权利要求1-13任一项的抗体竞争对LRP6的结合。
15.—种免疫缀合物，其包含权利要求1-13任一项的抗体和细胞毒剂。
16.一种药物配制剂，其包含权利要求1-15任一项的抗体和药学可接受载体。
17.权利要求1-14任一项的抗体，其用作药物。
18.权利要求1-14任一项的抗体，其用于治疗癌症或骨骼病症。
19.权利要求1-14任一项的抗体，其用于抑制由第一Wnt同等型诱导的信号传导和强化由第二 fct同等型诱导的信号传导。
20.权利要求1-14任一项的抗体在制备药物中的用途。
21.权利要求20的用途，其中所述药物治疗癌症或骨骼病症。
22.权利要求20的用途，其中所述药物用于抑制由第一Wnt同等型诱导的信号传导和强化由第二 fct同等型诱导的信号传导。
23.一种治疗具有癌症的个体的方法，包括对个体施用有效量的权利要求1-15任一项的抗体。
24.权利要求23的方法，其中所述癌症选自下组非小细胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肾癌和前列腺癌。
25.一种治疗具有癌症的个体的方法，包括对个体施用有效量的 a)一种分离的抗体，其结合LRP6且抑制由选自Wnt3和Wnt3a的Wnt同等型诱导的信号传导，和b)一种分离的抗体，其结合LRP6且抑制由选自Wnt l、2、2b、6、8a、9a、9b和IOb的Wnt同等型诱导的信号传导。
26.一种治疗具有癌症的个体的方法，包括对个体施用有效量的 a)一种分离的抗体，其结合LRP6且抑制由Wnt3和Wnt3a诱导的信号传导，和 b)一种分离的抗体，其结合LRP6且抑制由Wnt l、2、2b、6、8a、9a、9b和IOb诱导的信号传导。
27.一种治疗具有癌症的个体的方法，包括对个体施用有效量的 a)一种分离的抗体，其结合LRP6且抑制由Wnt3和Wnt3a诱导的信号传导，和 b)一种分离的抗体，其结合LRP6且抑制由Wnt l、2、2b、4、6、7a、7b、8a、9a、9b、IOa和IOb诱导的信号传导。
28.一种治疗具有骨骼病症的个体的方法，包括对个体施用有效量的权利要求1-14任一项的抗体。
29.权利要求28的用途，其中所述骨骼病症选自下组骨质疏松、骨关节炎、骨折和骨损伤。
30.一种在个体中强化由一种Wnt同等型诱导的Wnt信号传导的方法，包括对个体施用有效量的权利要求1-14任一项的抗体和该Wnt同等型以强化由该Wnt同等型诱导的Wnt信号传导。
31.一种结合LRP6的分离的抗体，其中该抗体包含选自下组的VH :SEQ ID NO:9、SEQID NO:11、SEQ ID NO:13 和 SEQ ID NO:15。
32.一种结合LRP6的分离的抗体，其中该抗体包含选自下组的VL :SEQ ID N0:10和SEQID NO:12。
33.一种结合LRP6的分离的抗体，其中该抗体包含VH和VL，该VH选自来自重链SEQID NO:9、SEQ ID NO: IUSEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 15 的 VH，该 VL 选自来自轻链 SEQ IDNO: 10 和 SEQ ID NO: 12 的 VL。
34.一种结合LRP6的分离的抗体，其中该抗体包含VH，该VH包含与氨基酸序列SEQ IDNO:9, SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 15具有至少90%同源性的氨基酸序列。
35.一种结合LRP6的分离的抗体，其中该抗体包含VL，该VL包含与选自SEQ ID NOilO和SEQ ID NO: 12的氨基酸序列具有至少90%同源性的氨基酸序列。
36.一种结合LRP6的分离的抗体，其中该抗体包含VH和VL，该VH包含与选自SEQ IDN0:9、SEQ ID NO: IUSEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 15的氨基酸序列具有至少90%同源性的氨基酸序列，该VL包含与选自SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 12氨基酸序列的具有至少90%同源性的氨基酸序列。
37.一种结合LRP6的两个不同区的分离的双特异性抗体，其中该抗体包含VH，该VH包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 15。
38.权利要求37的双特异性抗体，其中该抗体包含第一VH和第二 VH，该第一 VH包含氨基酸序列SEQ ID NO: 9，该第二 VH包含氨基酸序列SEQ ID N0:15。
39.权利要求37的双特异性抗体，其中该抗体包含第一VH和第二 VH，该第一 VH包含氨基酸序列SEQ ID NO: 11，该第二 VH包含氨基酸序列SEQ ID N0:15。
40.权利要求37的双特异性抗体，其中该抗体包含第一VH和第二 VH，该第一 VH包含氨基酸序列SEQ ID NO: 13，该第二 VH包含氨基酸序列SEQ ID NO: 15。
41.权利要求37-40任一项的双特异性抗体，其中该抗体进一步包含VL，该VL包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 12。
42.—种结合LRP6的两个不同区的分离的双特异性抗体，其中该抗体包含VH，该VH包含与选自下组的氨基酸序列具有至少90%同源性的氨基酸序列SEQ ID NO:9, SEQ IDNO: 11，SEQ ID NO: 13，或 SEQ ID NO: 15。
43.权利要求42的双特异性抗体，其中该抗体包含第一VH和第二 VH，该第一 VH包含与 氨基酸序列SEQ ID NO:9具有至少90%同源性的氨基酸序列，该第二 VH包含与氨基酸序列SEQ ID NO: 15具有至少90%同源性的氨基酸序列。
44.权利要求42的双特异性抗体，其中该抗体包含第一VH和第二 VH，该第一 VH包含与氨基酸序列SEQ ID NO: 11具有至少90%同源性的氨基酸序列，该第二 VH包含与氨基酸序列SEQ ID NO: 15具有至少90%同源性的氨基酸序列。
45.权利要求42的双特异性抗体，其中该抗体包含第一VH和第二 VH，该第一 VH包含与氨基酸序列SEQ ID NO: 13具有至少90%同源性的氨基酸序列，该第二 VH包含与氨基酸序列SEQ ID NO: 15具有至少90%同源性的氨基酸序列。
46.权利要求42-45任一项的双特异性抗体，其中该抗体进一步包含VL，该VL包含与选自下组的氨基酸序列具有至少90%同源性的氨基酸序列SEQ ID N0:10和SEQ ID NO:12。
47.一种结合LRP6的两个不同区的分离的双特异性抗体，其中该抗体包含第一VH域和第二 VH域，该第一 VH域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VH HVR序列(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 17的HVR-Hl ； (b)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 18的HVR-H2 ；和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19的HVR-H3，该第二 VH域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VH HVR序列(d)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 22的HVR-Hl ； (e)包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-H2 ;和(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO:24的HVR-H3。
48.一种结合LRP6的两个不同区的分离的双特异性抗体，其中该抗体包含第一 VH域且包含第二 VH域，该第一 VH域包含所有三个来自下述的VHHVR序列(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 17的HVR-Hl ； (b)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 18的HVR-H2 ； (c)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19的HVR-H3，该第二 VH域包含所有三个来自下述的VH HVR序列(d)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 22的HVR-Hl ； (e)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 23的HVR-H2 ;和(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO:24的HVR-H3。
49.一种结合LRP6的两个不同区的分离的双特异性抗体，其中该抗体包含第一 VH域且包含第二 VH域，该第一 VH域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VH HVR序列(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 17的HVR-Hl ； (b)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 18的HVR-H2 ； (c)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 21的HVR-H3，该第二 VH域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VH HVR序列(d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:22的HVR-Hl ； (e)包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-H2 ;和(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 24的HVR-H3。
50.一种结合LRP6的两个不同区的分离的双特异性抗体，其中该抗体包含第一 VH域且包含第二 VH域，该第一 VH域包含所有三个来自下述的VHHVR序列(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 17的HVR-Hl ； (b)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 18的HVR-H2 ； (c)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 21的HVR-H3，该第二 VH域包含所有三个来自下述的VH HVR序列(d)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 22的HVR-Hl ； (e)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 23的HVR-H2 ;和(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO:24的HVR-H3。
51.一种结合LRP6的两个不同区的分离的双特异性抗体，其中该抗体包含第一 VH域且包含第二 VH域，该第一 VH域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VH HVR序列(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-Hl ； (b)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 18的HVR-H2 ； (c)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19的HVR-H3，该第二 VH域包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VH HVR序列(d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:22的HVR-Hl ； (e)包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-H2 ;和(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 24的HVR-H3。
52.一种结合LRP6的两个不同区的分离的双特异性抗体，其中该抗体包含第一 VH域且包含第二 VH域，该第一 VH域包含所有三个来自下述的VHHVR序列(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20的HVR-Hl ； (b)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 18的HVR-H2 ； (c)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19的HVR-H3，该第二 VH域包含所有三个来自下述的VH HVR序列(d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:22的HVR-Hl ； (e)包含氨基酸序列SEQ IDNO:23的HVR-H2 ;和(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO:24的HVR-H3。
53.权利要求47-52任一项的双特异性抗体，其中该抗体进一步包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VL HVR序列(a)包含氨基酸序列SEQ ID N0:25的HVR-Ll ； (b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:26的HVR-L2 ； (c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的HVR-L3。
54.权利要求47-52任一项的双特异性抗体，其中该抗体进一步包含所有三个选自下述的VL HVR序列(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 25的HVR-Ll ； (b)包含氨基酸序列SEQID NO:26 的 HVR-L2 ； (c)包含氨基酸序列 SEQ ID NO:27 的 HVR-L3。
55.权利要求47-52任一项的双特异性抗体，其中该抗体进一步包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下述的VL HVR序列(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 25的HVR-Ll ； (b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:26的HVR-L2 ； (c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的HVR-L3。
56.权利要求47-52任一项的双特异性抗体，其中该抗体进一步包含所有三个选自下述的VL HVR序列(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 25的HVR-Ll ； (b)包含氨基酸序列SEQID NO:26 的 HVR-L2 ； (c)包含氨基酸序列 SEQ ID NO:28 的 HVR-L3。
57.一种结合LRP6的两个不同区的分离的双特异性抗体，其中该抗体包含第一 VH和第二 VH，该第一 VH包含氨基酸序列SEQ ID NO: 15，该第二 VH选自下组包含氨基酸序列SEQID NO:9, SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID 勵13的乂!1。
58.权利要求57的双特异性抗体，进一步包含VL，该VL包含氨基酸序列SEQID NO: 10或 SEQ ID NO:12。
59.权利要求57的双特异性抗体，包含氨基酸序列SEQID NO: 15的第一 VH和包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的第二 VH，和包含氨基酸序列SEQ ID NO: 10的VL。
60.权利要求37-59任一项的双特异性抗体，其中该抗体抑制由选自Wnt3和Wnt3a的Wnt同等型诱导的信号传导且抑制由选自Wnt l、2、2b、6、8a、9a、9b和IOb的Wnt同等型诱导的信号传导。
61.权利要求37-59任一项的双特异性抗体，其中该抗体抑制由选自Wnt4、7a、7b和IOa的Wnt同等型诱导的信号传导。
62.权利要求37-59任一项的双特异性抗体，其中该抗体抑制自分泌Wnt信号传导。
63.一种分离的双特异性抗体，其结合LRP6且抑制由选自Wnt3和Wnt3a的Wnt同等型诱导的信号传导且抑制由选自Wnt l、2、2b、6、8a、9a、9b和IOb的Wnt同等型诱导的信号传导。
64.权利要求62的双特异性抗体，其中该抗体抑制由选自Wnt4、7a、7b和IOa的Wnt同等型诱导的信号传导。
65.一种抗体，其与权利要求37-64任一项的双特异性抗体竞争对LRP6的结合。
66.一种抗体，其与权利要求37-64任一项的双特异性抗体结合相同的两种表位。
67.权利要求66的抗体，其中所述两种表位之一包含LRP6的R28、E51、D52、V70、S71、E73、L95、S96、D98、E115、R141 和 N185。
68.权利要求67的抗体，其中所述两种表位之一包含LRP6的R28、E51、D52、V70、S71、E73、L95、S96、D98、E115、R141、N185、R29、W188、K202、P225、H226、S243 和 F266。
69.一种分离的核酸，其编码权利要求1-14或31-68任一项的抗LRP6抗体或双特异性抗体。
70.一种宿主细胞，其包含权利要求69的核酸。
71.一种药物配制剂，其包含权利要求31-68任一项的抗体或双特异性抗体和药学可接受载体。
72.权利要求31-68任一项的抗体或双特异性抗体，其用作药物。
73.权利要求31-68任一项的抗体或双特异性抗体，其用于治疗癌症。
74.权利要求31-68任一项的抗体或双特异性抗体在制备药物中的用途。
75.一种治疗具有癌症的个体的方法，包括对个体施用有效量的权利要求31-68任一项的抗体或双特异性抗体。
76.权利要求75的方法，其中所述癌症选自下组非小细胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肾癌和前列腺癌。
全文摘要
本发明提供了抗LRP6抗体及其使用方法。本发明的一个特别方面提供了抑制多种Wnt同等型的信号传导的双特异性抗LRP6抗体。
文档编号C07K16/28GK102906117SQ201180025965
公开日2013年1月30日 申请日期2011年3月23日 优先权日2010年3月24日
发明者E.博里斯, R.卡拉诺, A.科克伦, M.科斯塔, V.德阿尔梅达, J.厄恩斯特, 巩岩, R.汉努什, P.波拉基斯, B.鲁宾菲尔德, M.索罗韦, 吴雁, T.C.曹 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司