一种使用磁微粒化学发光定量检测抗Sm抗体IgG的试剂盒及其制备方法和检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫学检测技术领域，具体涉及一种使用磁微粒化学发光定量检测抗 Sm抗体IgG的试剂盒及其制备方法和检测方法。
【背景技术】
[0002] Sm是一位病人名字的缩写，在这位诊断为红斑狼疮的病人血清中，首次找到了这 种抗体，因此命名。以后大量的报道证实在红斑狼疮病人血清中，存在此种抗体，属于一类 抗核抗体。Sm系统中的主要蛋白质抗原为8、8 /、04蛋白，分子量11~291^)，此外还有六、八\ B"、C、F、G以及68kD、150kD等蛋白质。这些蛋白质与含鸟苷十分丰富的小核RNAs(snRNAs)即 UsnRNAs形成复合物。目前在哺乳动物中发现至少有13种UsnRNAs，即U1~U13snRNAS(3Sm抗 原由1]1、1]2、1]5、1]4/1]6与上述蛋白质构成小核核糖核蛋白〇]1、1]2、1]5、1]4/1]68111?^)，它在异 质性核RNA(hn RNA)向成熟信使RNA(mRNA)的转化中起重要作用。
[0003] 抗Sm抗体I gG是系统性红斑狼疮(SLE)的特异性抗体，与抗dsDNA、抗核小体、抗核 糖体P蛋白抗体I gG-起可用于SLE的诊断。抗Sm抗体可在5 %~40 %的SLE患者中检出。系统 性红斑狼疮(SLE)是一种发病率较高的慢性多系统疾病，伴有多种血清自身抗体，为典型的 自身免疫性疾病。但到目前为止其确切病因和发病机制仍不清楚，这对SLE诊断、治疗和预 防的进展造成了很大障碍。患者血清中自身抗体检测己成为SLE实验诊断的主要临床指标。 近年来，已在病人血清中检出抗ΕΝΑ抗体、抗ds-DNA抗体、ANA和抗心磷脂抗体等多种自身抗 体。ΕΝΑ可分为3111、1?^、334、338、1^13和组蛋白等已知和未知成分共十几种，其中3111、1?^和 Rib三者与SLE关系密切。抗Sm抗体阳性被认为是SLE标记性抗体，对SLE诊断意义很大目前， 使用磁微粒化学发光分析法在抗Sm抗体IgG免疫分析产品的应用仍未见。
[0004] 中国专利CN103105489A公开了检测自身免疫性疾病抗体的免疫印迹试剂盒及其 制备方法，涉及一种检测多种自身免疫性疾病相关抗体的免疫印迹试剂盒，解决目前尚无 用于多种自身免疫性疾病体检筛查的免疫印迹产品技术上的不足:在所述的硝酸纤维素膜 或尼龙膜上含有：分别由(^0ΝΑ、5ι?/ΚΝΡ、(ΧΡ、55Α，55Β，6Α0、ΚΑ、ΙΑ-2Α、Τ6，ΑΜΑ-Μ2,1(^Φ* 的至少两种天然或重组抗原包被而成的两条以上平行的检测线，1条高浓度质控带，1条中 浓度质控带及1条低浓度质控带。该专利公开的是一种膜条免疫法，更能说明膜条免疫法存 在的灵敏度较低、线性范围窄、重复性差和反应时间长的问题。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供一种使用磁微粒化学发光定量检测抗Sm 抗体I gG的试剂盒，其能够以较低的成本制备得到，且能够实现抗Sm抗体I gG准确和高精确 地定量测定。
[0006] 本发明是通过如下技术方案来实现的：一种使用磁微粒化学发光定量检测抗Sm抗 体IgG的试剂盒，所述试剂盒包括:Anti-Sm IgG校准品、Anti-Sm IgG试剂1号、Anti-Sm IgG 试剂2号、Anti-Sm IgG磁分离试剂、Anti-Sm IgG质控品和清洗液。
[0007]所述Anti-Sm IgG校准品包括6个液体校准瓶，所述液体校准瓶内目标浓度分别为 0、5、20、50、100、200RU/mL的抗Ant i-Sm抗体IgG和牛血清白蛋白的Tr is缓冲液；
[0008] 所述Anti-Sm IgG试剂1号为1个含有5mL的生物素标记的Sm抗原和牛血清白蛋白 的Tris缓冲液的瓶；
[0009]所述Anti-Sm IgG试剂2号为1个含有15mL的碱性磷酸酶标记的羊抗人多克隆抗体 和牛血清白蛋白的Tris缓冲液的瓶；
[0010] 所述Anti-Sm IgG磁分离试剂为1个含有5mL的链霉亲和素标记的磁微粒和牛血清 白蛋白的Tris缓冲液瓶;所述Anti-Sm IgG质控品包括2个质控瓶，所述质控瓶内的浓度的 范围分别为：16_24RU/mL 和80-120RU/mL。
[0011]所述试剂盒检测原理为将待测样品、所述Anti-Sm IgG试剂1号混合温育，样品中 的抗Sm抗体IgG与Sm抗原特异性结合，再加入所述Anti-Sm IgG磁分离试剂，抗Sm抗体IgG与 Sm抗原的免疫复合物被吸附到磁微粒表面，洗涤去除未结合的抗体和杂质，加入Anti-Sm IgG试剂2号并混合温育。碱性磷酸酶标记(ALP)的羊抗人IgG抗体与已经结合在磁珠上的抗 Sm抗体IgG特异性结合。洗涤去除未结合的抗体和杂质后加入化学发光底物，ALP催化底物 发光，测定相对发光强度(RLU)。在一定范围内RLU与样品中抗Sm抗体IgG浓度呈正比，通过 RLU就可以从标准曲线上计算出待测样品的抗Sm抗体IgG含量。
[0012]本发明采取的又一技术方案是:一种抗Sm抗体IgG的磁微粒化学发光定量检测试 剂盒的制备方法，所述试剂盒的制备方法包括以下步骤：
[0013] 步骤1.制备所述Anti-Sm IgG校准品包括:Anti-Sm IgG校准品稀释液配制步骤和 Anti-Sm IgG校准品配制步骤：
[0014] 所述Anti-Sm IgG校准品稀释液的配制步骤包括：
[0015] 加800mL纯化水和11.2g的Tris到容器中，搅拌混合均匀，再加8.5g的氯化钠和2mL 的Proclin300，搅拌至完全溶解，将pH值调为7.0-7.5，加40g的牛血清白蛋白到容器中，搅 拌至完全溶解，再将pH值调为7.0-7.5,用纯化水定容至1L，使用0.2μπι滤器过滤，将获得的 所述校准品稀释液保存在2_8°C待用；
[0016] 所述Anti-Sm IgG校准品的配制步骤包括：
[0017] 用上述Ant i-Sm IgG校准品稀释液将抗Sm抗体IgG分别配制为0、5、20、50、100、 200RU/mL共6个浓度点；
[0018] 步骤2.制备所述Anti-Sm IgG试剂1号包括:Anti-Sm IgG试剂1号稀释液配制步骤 和Anti-Sm IgG试剂1号配制步骤：
[0019] 所述Anti-Sm IgG试剂1号稀释液的配制步骤：
[0020] 加800mL纯化水、12.1g的Tris和5.8g的NaCl于1L容器中，搅拌至完全溶解，再加入 2mL的Proclin300，搅拌至完全溶解，再加入5g的牛血清白蛋白，搅拌至完全溶解，将pH值调 为7.0-7.5,用纯化水定容至1L，使用0.2μπι滤器过滤，将获得的所述试剂1号稀释液保存在 2_8°C待用；
[0021] 所述Anti-Sm IgG试剂1号的配制步骤：
[0022]用0.2mol/L的pH9.0碳酸盐缓冲液配制0.5mg/mL的生物素溶液，按照Sm抗原与生 物素溶液质量比为10:1的比例在Sm抗原溶液中加入到上述0.5mg/mL的生物素溶液，混合均 匀，室温静置18h，反应生成Sm抗原-生物素连接物的反应液，将得到的Sm抗原-生物素连接 物反应液通过G-25凝胶柱进行分离，除去未反应的生物素，得到Sm抗原-生物素连接物，再 用所述试剂1号稀释液将Sm抗原-生物素连接物稀释到0.1-0.3yg/mL，得到所述的试剂1号； [00 23] 步骤3.制备所述Anti-Sm IgG试剂2号包括:Anti-Sm IgG试剂2号稀释液配制步骤 和Anti-Sm IgG试剂2号的配制步骤：
[0024] 所述Anti-Sm IgG试剂2号稀释液的配制步骤：
[0025] 加800mL纯化水、6.06g的4-羟乙基哌嗪乙磺和8.5g的NaCl到容器中，搅拌至完全 溶解，再加入5g的牛血清白蛋白、0. lg的ZnCl2、0.2mL的Proclin 300和0. lg的MgCh，搅拌至 完全溶解，将pH值调为7.5-8.0，用纯化水定容至1L，使用0.2um滤器过滤，将获得的所述试 剂2号稀释液保存在2-8°C待用；
[0026] 所述Anti-Sm IgG试剂2号的配制步骤：
[0027]将lmg的羊抗人抗体和2-4yL的10mg/mL的偶联剂为2-亚胺四氢噻吩溶液，室温静 置20min，加入0. lmol/L的甘氨酸溶液10yL，室温静置5min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后 抗体，将活化后的抗体保存在2_8°C备用，取1.5mg的碱性磷酸酶，加入5mg/mL的4-(N-马来 酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液10-20yL，室温静置30min，用G-25凝胶柱 除盐，收集活化后碱性磷酸酶，将活化后的碱性磷酸酶保存在2-8°C备用，再将上述活化的 羊抗人抗体与活化的碱性磷酸酶混合，在2_8°C条件下静置12-24h，用Supperdex200凝胶纯 化柱纯化，获得羊抗人抗体-碱性磷酸酶连接物浓溶液，置于2-8°C保存备用，将羊抗人抗 体-碱性磷酸酶连接物浓溶液用所述试剂2号稀释液稀释到0.02-0. lyg/mL，得到所述的试 剂2号；
[0028] 步骤4.制备所述Anti-Sm IgG磁分离试剂包括:Anti-Sm IgG磁分离试剂稀释液配 制步骤和Anti-Sm IgG磁分离试剂配制步骤：
[0029] 所述Anti-Sm IgG磁分离试剂稀释液配制步骤：
[0030] 加800mL纯化水、12.1g的Tris和8.5g的NaCl到容器中，搅拌至完全溶解，再加5g的 牛血清白蛋白、50mL的新生牛血清和0.2mL的Proclin300,搅拌至完全溶解，将pH值调为 7.9-8.1，用纯化水定容至1L，使用0.2um滤器过滤，将获得的所述磁分离试剂稀释液保存在 2_8°C待用；