一种使用磁微粒化学发光定量检测抗Scl-70抗体IgG的试剂盒及其制备方法和检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫学检测技术领域，具体涉及一种使用磁微粒化学发光定量检测抗 Scl-70抗体IgG的试剂盒及其制备方法和检测方法。
【背景技术】
[0002] 抗Scl-70抗体靶抗原为碱性非组蛋白，为DNA局部异构酶I，亦称拓扑异构酶I 的降解产物，因最初仅在系统性硬化病患者中发现该抗体，且其抗原分子量为70000,故称 抗Scl-70抗体。抗Scl-70抗体被视为系统性硬化的血清标记性抗体，阳性常与弥漫性皮 肤病变、近端皮肤累及、心脏受累、并发肿瘤及肺间质纤维化密切相关，被认为是预后不良 的指标。
[0003] 目前临床上抗Scl-70抗体IgG的检测有的膜条免疫法和酶联免疫吸附法。膜条免 疫法应用的是膜条显色技术，其特点为固定几个项目在同一膜条测定，一般通过手工或者 半自动膜条仪进行实验操作，最终通过肉眼进行定性判定，该技术灵敏度低，反应时间长， 检测项目只能固定搭配组合，灵活性差。酶联免疫吸附法的灵敏度在膜条免疫法基础上有 所提升，但仍然较低，并且线性范围窄，重复性差，反应时间也较长，仍然不能很好满足临床 的应用。
[0004] 磁微粒化学发光免疫分析法，较以前的膜条免疫法和酶联免疫吸附法，在检测灵 敏度、检测范围、检测时间及自动化操作上有了大大提高，且没有污染，临床应用广。目前， 使用磁微粒化学发光分析法在抗Scl-70抗体IgG免疫分析产品的应用仍未见。
[0005] 中国专利CN102937648B公开了一种检测多种自身免疫性种检测自身免疫疾病 相关抗核抗体谱的试剂盒，解决了同时检测17种抗核抗体的诊断的技术问题。该试剂盒 包括膜条、酶标液、底物和浓缩洗涤孵育液，膜条由载片和依次固定在载片上的抗原条带、 临界质控带、功能质控线构成，抗原条带由dsDNA、核小体、SmDU核糖体PO蛋白、组蛋白、 UIsnRNP、Ro/SS-A(52KD)、Ro/SS-A(60KD)、La/SS-B、Sc1-70、CENP-B、Jo-1、AMA-M2、PM-Sc1、 PCNA、Mi-2和Ku中的至少两个彼此独立的划线到硝酸纤维素膜或尼龙膜上形成。该专利公 开的是一种膜条免疫法，更能说明膜条免疫法存在的灵敏度较低、线性范围窄、重复性差、 操作麻烦和反应时间长的问题。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供一种使用磁微粒化学发光定量检测抗 Scl-70抗体IgG的试剂盒，能够低成本制备得到，且能够实现抗Scl-70抗体IgG准确和高 精确地定量测定。
[0007] 本发明是通过如下技术方案来实现的：一种使用磁微粒化学发光定量检测抗 Scl-70抗体IgG的试剂盒，所述试剂盒包括：Anti-Scl-70 IgG校准品、Anti-Scl-70 IgG 试剂 1 号、Anti-Scl-70 IgG 试剂 2 号、Anti-Scl-70 IgG 磁分离试剂、Anti-Scl-70 IgG 质 控品和清洗液。
[0008] 所述Anti-Scl-70 IgG校准品包括6个液体校准瓶，所述液体校准瓶内目标浓度 分别为0、5、20、50、100、200肋/11^的厶11衍-3(31-70 186和牛血清白蛋白的1^8缓冲液；
[0009] 所述Anti-Scl-70 IgG试剂1号为1个含有生物素标记的Anti-Scl-70抗原和牛 血清白蛋白的Tris缓冲液的瓶；
[0010] 所述Anti-Scl-70 IgG试剂2号为1个含有碱性磷酸酶标记的羊抗人多克隆抗体 和牛血清白蛋白的Tris缓冲液的瓶；
[0011] 所述Anti-Scl-70 IgG磁分离试剂为1个含有链霉亲和素标记的磁微粒和牛血清 白蛋白的Tris缓冲液瓶；
[0012] 所述Anti-Scl-70 IgG质控品包括2个质控瓶，所述质控瓶内的浓度的范围分别 为：16-24RU/mL和 80-120RU/mL。
[0013] 所述试剂盒检测原理为将待测样品、所述Anti-Scl-70 IgG试剂1号混合温育，样 品中的抗Scl-70抗体IgG与Scl-70抗原特异性结合，再加入所述Anti-Scl-70 IgG磁分 离试剂，抗Scl-70抗体IgG与Scl-70抗原的免疫复合物被吸附到磁微粒表面，洗涤去除未 结合的抗体和杂质，加入Anti-Scl-70 IgG试剂2号并混合温育。碱性磷酸酶标记（ALP) 的羊抗人IgG抗体与已经结合在磁珠上的抗Scl-70抗体IgG特异性结合。洗涤去除未结 合的抗体和杂质后加入化学发光底物，ALP催化底物发光，测定相对发光强度（RLU)。在一 定范围内RLU与样品中抗Scl-70抗体IgG浓度呈正比，通过RLU就可以从标准曲线上计算 出待测样品的抗Scl-70抗体IgG含量。
[0014] 本发明米取的又一技术方案是：一种抗Scl-70抗体IgG的磁微粒化学发光定量检 测试剂盒的制备方法，所述试剂盒的制备方法包括以下步骤：
[0015] 步骤1.制备所述Anti-Scl-70 IgG校准品包括：Anti-Scl-70 IgG校准品稀释液 配制步骤和Anti-Scl-70 IgG校准品配制步骤：
[0016] 所述Anti-Scl-70 IgG校准品稀释液的配制步骤包括：
[0017] 加800mL纯化水和11. 2g的Tris到容器中，搅拌混合均匀，再加8. 5g的氯化钠和 2mL的Proclin300,搅拌至完全溶解，将pH值调为7. 0-7. 5,加40g的牛血清白蛋白到容器 中，搅拌至完全溶解，再将pH值调为7. 0-7. 5,用纯化水定容至1L，使用0.2 μπι滤器过滤， 将获得的所述校准品稀释液保存在2-8°C待用；
[0018] 所述Anti-Scl-70 IgG校准品的配制步骤包括：
[0019] 用上述Anti-Scl-70 IgG校准品稀释液将抗Scl-70抗体IgG分别配制为0、5、20、 50、100、200RU/mL 共 6 个浓度点；
[0020] 步骤2.制备所述Anti-Scl-70 IgG试剂1号包括：Anti-Scl-70 IgG试剂1号稀 释液配制步骤和Anti-Scl-70 IgG试剂1号配制步骤：
[0021] 所述Anti-Scl-70 IgG试剂1号稀释液的配制步骤：
[0022] 加800mL纯化水、12. Ig的Tris和5. 8g的NaCl于IL容器中，搅拌至完全溶解， 再加入2mL的Proclin300,搅拌至完全溶解，再加入5g的牛血清白蛋白，搅拌至完全溶解， 将pH值调为7. 0-7. 5,用纯化水定容至1L，使用0. 2 μ m滤器过滤，将获得的所述试剂1号 稀释液保存在2-8 °C待用；
[0023] 所述Anti-Scl-70 IgG试剂1号的配制步骤：
[0024] 用0. 2mol/L的pH9. 0碳酸盐缓冲液配制0. 5mg/mL的生物素溶液，按照Scl-70抗 原与生物素溶液质量比为10:1的比例在Scl-70抗原溶液中加入到上述0. 5mg/mL的生物 素溶液，混合均匀，室温静置18h，反应生成Scl-70抗原-生物素连接物的反应液，将得到 的Scl-70抗原-生物素连接物反应液通过G-25凝胶柱进行分离，除去未反应的生物素，得 到Scl-70抗原-生物素连接物，再用所述试剂1号稀释液将Scl-70抗原-生物素连接物 稀释到0. 1-0. 3 μ g/mL，得到所述的试剂1号；
[0025] 步骤3.制备所述Anti-Scl-70 IgG试剂2号包括：Anti-Scl-70 IgG试剂2号稀 释液配制步骤和Anti-Scl-70 IgG试剂2号的配制步骤：
[0026] 所述Anti-Scl-70 IgG试剂2号稀释液的配制步骤：
[0027] 加800mL纯化水、6. 06g的4-羟乙基哌嗪乙磺和8. 5g的NaCl到容器中，搅拌至完 全溶解，再加入5g的牛血清白蛋白、0.1 g的ZnCl2、0. 2mL的Proclin 300和0.1 g的MgCl2， 搅拌至完全溶解，将pH值调为7. 5-8. 0,用纯化水定容至1L，使用0. 2 μ m滤器过滤，将获得 的所述试剂2号稀释液保存在2-8 °C待用；
[0028] 所述Anti-Scl-70 IgG试剂2号的配制步骤：
[0029] 将Img的羊抗人抗体和2-4 μ L的10mg/mL的偶联剂为2-亚胺四氢噻吩溶液，室 温静置20min，加入0. lmol/L的甘氨酸溶液10 μ L，室温静置5min，用G-25凝胶柱除盐， 收集活化后抗体，将活化后的抗体保存在2-8°C备用，取I. 5mg的碱性磷酸酶，加入5mg/ mL的4-(N-马来酰亚胺基甲基）环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液10-20 μ L，室温静置 30min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后碱性磷酸酶，将活化后的碱性磷酸酶保存在2-8°C 备用，再将上述活化的羊抗人抗体与活化的碱性磷酸酶混合，在2-8°C条件下静置12-24h， 用Supperdex200凝胶纯化柱纯化，获得羊抗人抗体-碱性磷酸酶连接物浓溶液，置于 2_8°C保存备用，将羊抗人抗体-碱性磷酸酶连接物浓溶液用所述试剂2号稀释液稀释到 0. 02-0. 1 μ g/mL，得到所述的试剂2号；
[0030] 步骤4.制备所述Anti-Scl-70 IgG磁分离试剂包括：Anti-Scl-70 IgG磁分离试 剂稀释液配制步骤和Anti-Scl-70 IgG磁分离试剂配制步骤：
[0031] 所述Anti-Scl-70 IgG磁分离试剂稀释液配制步骤：
[0032] 加800mL纯化水、12. Ig的Tris和8. 5g的NaCl到容器中，搅拌至完全溶解，再加 5g的牛血清白蛋白、50mL的新生牛血清和0. 2mL的Proclin300,搅拌至完全溶解，将pH值 调为7. 9-8. 1，用纯化水定容至1L，使用0. 2 μ m滤器过滤，将获得的所述磁分离试剂稀释液 保存在2-8 °C待用；
[0033] 所述Anti-Scl-70 IgG磁分离试剂配制步骤：
[0034] 取IOOmg磁微粒，磁分离去上清，取用0· 025mol/L的pH值为4. 5-6的2-吗啉乙磺 酸缓冲液IOmL重悬，室温下混勾2~3h，加入0. 5-1. OmL新配制的浓度为10mg/mL的碳二 亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的吗啉乙磺酸缓冲液，室温振荡混悬30-60min，使磁珠充分 活化，磁分离，去上清，用0. 〇25mol/L的pH值为4.