定量检测全血中肌钙蛋白i的磁微粒化学发光微流控芯片的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用磁微粒化学发光技术和微流控芯片技术实现全血样本中cTnl高灵敏定量检测的方法，特别公开了一种定量检测全血中肌钙蛋白I的磁微粒化学发光微流控芯片，可实现全血样本中cTnl的准确、高灵敏定量检测，属于微流控芯片化学发光免疫检测技术领域。
【背景技术】
[0002]当前我国心血管疾病的防控形势依然严峻，心血管疾病发病率呈不断上升态势。据统计，心血管病死亡率占人口死亡的40%，因此做好早发现、早预防、早救治，提高心血管病防治水平是关键。心血管疾病传统检测项目大多为心肌酶谱。但存在酶活性升高出现较晚、特异性较差和持续时间短等不足。而心肌肌钙蛋白是唯一存在于心肌的收缩蛋白，对心肌坏死有高度敏感性和特异性。
[0003]心肌肌钙蛋白是由cTnl、cTnC和cTnT三种，在肌肉舒张和收缩过程中起重要调节作用。但cTnC无心肌特异性，一般不用于心肌损伤检测。正常状态下cTnl和cTnT均不能穿透细胞膜进入血液，所以健康人血中cTnl和cTnT极低;如心肌细胞受损，cTnl和cTnT进人细胞间质和血液。在肾衰竭、肺炎和败血症等疾病中，血液中cTnT含量也可升高，所以其特异性不如cTnl ^TnI在发病后3?5小时升高，15?24小时达高峰，持续时间久，5?10天后可降至正常。cTnl是目前最好的心肌损伤标志物之一。
[0004]传统上多用酶联免疫法、化学发光法和免疫层析法(试纸条)等检测cTnl。但酶联免疫法操作复杂，检测时间长;化学发光法需配套大型昂贵仪器，测试时间长，不易实现快速即时检测。胶体金免疫层析法虽简便快速，但重复性差、灵敏度低，容易出现误判。
[0005]中国专利200780015772.0公布了一种肌钙蛋白高灵敏分析系统，采用微量滴定板(微孔板)进行检测，灵敏度高，但操作复杂、测试时间长、检测范围窄。中国专利200610028913.X描述了一种以胶体金免疫层析技术实现对cTnl检测的试剂盒，但只能进行定性检测，而无法定量。中国专利201010619731.6公开了一种全程定量检测cTn I的免疫层析试纸条，以荧光胶乳微粒替代胶体金，实现对cTnl的定量检测，但仍无法解决试纸条重复性差等缺陷。
[0006]因此开发快速、准确、灵敏度高的检测方法，具有巨大发展潜力和应用前景。与荧光和吸收光相比，化学发光没有外来激发光源背景信号干扰，交叉干扰小，灵敏度高、线性范围宽。微流控芯片技术把样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，可完成全过程分析。
[0007]针对现有cTnl检测方法的不足和缺陷，微流控磁微粒化学发光方法利用磁微粒化学发光和微流控技术，可实现对cTnl准确、高灵敏定量检测。
【发明内容】
[0008]本发明要解决的技术问题为针对现有快速诊断方法灵敏度低、重复性差、受干扰明显，以及现有化学发光配套仪器昂贵、检测时间长的问题，提供一种定量检测全血中肌钙蛋白I的磁微粒化学发光微流控芯片，通过集成化芯片(把除测试样本外所有组分均集成到芯片内)并配套小型便携设备，从而实现现场全血样本中CTnI的快速、准确、高灵敏定量检测。
[0009 ]为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为:
[0010]—种定量检测全血中肌钙蛋白I的磁微粒化学发光微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括顶板(I)结构和底板(2)结构，其中顶板(I)上气栗(3)、加样口(4)、样本填充区(12)、标记抗体存储池(5)和样本混合区(13)依次连接;底板上过滤区(6)、磁颗粒包被区(7)、清洗区(14)、检测区(8)、液体释放通道(16)依次连接;底板的检测区(8)分别与清洗液存储池(9)和发光基底液存储池(1)通过液体释放通道(16)连接；
[0011]所述标记抗体存储池(5)存储预封装酶或发光剂标记抗cTnl抗体，磁颗粒包被区
(7)包被预封装磁颗粒标记抗cTnl抗体，清洗液存储池(9)和发光基底液存储池(1)存储预封装清洗液和发光基底液;所述微流控芯片测试流程中，用磁铁操控磁颗粒移动或聚集;所述标记抗体存储池、清洗液存储池和发光基底液存储池为液体密封池，可通过外力挤压而局部破裂，释放液体;所述过滤区包含滤血膜所述顶板(I)与底板(2)用胶带(19和20)密封。
[0012]具体地，本发明所述的微流控芯片，发光基底液保质期少于I年时应分开，用发光基底液存储池A(23)和发光基底液存储池B(24)替代发光基底液存储池(10)，所述发光基底液存储池A( 23)和发光基底液存储池B (24)通过预混合通道(25)连接。
[0013]具体地，本发明所用磁颗粒包含铁、钴、镍的化合物，主要包含但不限于三氧化二铁和四氧化三铁化合物。优选磁颗粒为聚苯乙烯为壳，三氧化二铁为核的颗粒，磁颗粒尺寸和磁铁的磁感应强度对检测结果有明显的影响。
[00?4] 具体地，所述磁颗粒标记抗cTn I抗体使用的磁颗粒尺寸为0.1?ΙΟμπι ；与磁珠匹配的磁铁磁感应强度为500?30000高斯。
[0015]优选地，所述磁颗粒标记抗cTnl抗体使用的磁颗粒尺寸为0.5?3μηι，与磁珠匹配的磁铁磁感应强度为1000?8000高斯。
[0016]具体地，所述酶或发光剂标记cTnl抗体溶液、磁颗粒标记cTnl抗体溶液和清洗液均包含缓冲液、蛋白质、表面活性剂和防腐剂，且发光剂标记cTnl抗体溶液还包含甘油，磁颗粒标记cTnl抗体溶液还包含糖类。
[0017]具体地，所述酶标记cTnl抗体溶液包含牛血清白蛋白(BSA)、吐温-20和Procl in300的硼酸缓冲液；磁颗粒标记cTnI抗体溶液包含BSA、葡萄糖、吐温-20和Proc I in300的硼酸缓冲液;所述清洗液包含BSA、吐温-20和Proc I in300的硼酸缓冲液。
[0018]具体地，所述发光剂标记cTnl抗体溶液包含BSA、甘油、吐温-20、曲拉通X-100和叠氮钠的磷酸盐缓冲液;所述磁颗粒标记cTnl抗体溶液包含BSA、酪蛋白、蔗糖、吐温-20、曲拉通X-100和叠氮钠的磷酸盐缓冲液;所述清洗液包含BSA、吐温20、曲拉通X-100、聚乙二醇和叠氮钠的磷酸盐缓冲液。
[0019]具体地，所述发光基底液包含与酶对应的底物及发光增强液，可合并后注入发光基底液存储池(10)，或分别注入发光基底液存储池A(23)和发光基底液存储池B(24)。
[0020]具体地，所述发光基底液包含发光剂对应的双氧水溶液和碱性溶液，可合并后注入发光基底液存储池(10)，或分别注入发光基底液存储池A( 23)和发光基底液存储池B(24)。
[0021 ]本发明所述微流控芯片制备方法如下:
[0022]步骤I)酶或发光剂标记抗cTnl抗体，磁颗粒标记抗cTnl抗体，这两种抗体可相同或不同；
[0023]步骤2)将酶或发光剂标记抗体溶液放入顶板的标记抗体存储池中，密封，将磁颗粒标记抗体溶液放入底板的包被区中，干燥，将清洗液和发光基底液分别注入清洗液存储池和发光基底液存储池中，密封，将顶板和底板组装成微流控芯片。
[0024]本发明提供的一种定量检测全血中肌钙蛋白I的磁微粒化学发光微流控芯片是一种以化学发光为基础、在微流控芯片上实现cTnl快速、准确、高灵敏检测的微流控芯片。
[0025]这种芯片是将抗cTnl抗体修饰酶，抗cTnl抗体修饰在磁颗粒上，利用抗原抗体作用，如双抗体夹心法原理结合磁颗粒富集、化学发光检测全血样本中是否含有cTnl，并准确分析其含量。
[0026]本发明中所述酶，包含但不限于过氧化氢酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)。发光基底液为酶对应的发光底物(如鲁米诺或金刚烷)和发光增强液(如苯衍生物等增强剂)，其中发光底物和发光增强液可合并，如图1所示混合均匀后注入一个发光基底液存储池(10);但当混合液保质期少于I年时应分开，如图3所示分别注入发光基底液存储池A(23)和发光基底液存储