纳米磁微粒化学发光法检测血清总IgE的试剂盒及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫分析领域，特别是设及一种纳米磁微粒化学发光法定量检测血清 总I姐的试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 免疫球蛋白E(ImmunoglobulinE，I姐）是人体免疫球蛋白的一种，在正常人体 内的含量很低，人体内I姐含量的提高提示I型过敏的发生。过敏性疾病是指患者吸入、摄 入、食入或者注入含有致敏成分的物质（过敏原）后触发机体B细胞产生特异性I姐抗体， I姐与肥大细胞或嗜碱性粒细胞结合从而使机体处于致敏状态。当相同的过敏原再次刺激 机体，就可与I姐抗体结合从而引发过敏反应及相关症状，如过敏性哮喘、枯草热、等麻疹、 过敏性鼻炎、湿疹等I型过敏性疾病。I姐抗体介导的I型过敏反应性疾病相当普遍，世界 各国过敏反应疾病的总发病率约为15%-30%，我国大约有5-10%的人受过敏的袭扰，是当前 世界性的重大卫生学问题，被世界卫生组织（WHO)列为二十一世纪重点防治的Ξ大疾病之 一。因此，临床上，总I姐检测常作为过敏反应性疾病的初筛试验。
[0003] 化学发光免疫分析是目前发展最快、最先进的免疫测定技术，其灵敏度和精确度 与传统的酶联免疫法、放射免疫法、巧光法高出几个数量级。其W灵敏度高、特异性强、试剂 价格低廉、试剂稳定、检测范围宽、操作简单、自动化程度高等优点被广大研究人员所认可， 并正逐渐替代传统的生物检测技术。
【发明内容】
[0004] 本发明主要解决的技术问题是提供一种纳米磁微粒化学发光法检测血清总I姐 的试剂盒及方法，研发和优化了与血清学抗体反应原理相关的各种关键技术，从而提高了 针对临床患者体内总I姐抗体的检测灵敏度和准确性，开发出灵敏、稳定的纳米磁微粒化 学发光诊断试剂。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种纳米磁微粒化学 发光法定量检测血清总I姐的试剂盒，包括的试剂有：生物素标记的鼠抗人I姐抗体溶液、 链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液、碱性憐酸酶标记的鼠抗人I姐抗体溶液、I姐校准 品、I姐质巧品。
[0006] 在本发明一个较佳实施例中，所述生物素标记的鼠抗人I姐抗体溶液的浓度为 0. 1~1.Oug/ml，所述链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液的浓度为0. 1~1.Omg/ml，所述碱 性憐酸酶标记的鼠抗人I姐抗体溶液的浓度为0. 1~2.Oug/ml。
[0007] 在本发明一个较佳实施例中，所述I姐校准品的浓度为：2IU/ml、10IU/ml、50IU/ ml、200IU/ml、1000IU/ml、5000lU/ml，所述I姐校准品是I姐蛋白与0. 1M、抑值为7. 4 的Tris-肥1缓冲液配制得到的；所述I姐质控品的浓度为：10lU/ml、200lU/ml，所述I姐 质控品是I姐蛋白与0. 1M、抑值为7. 4的化is-HCl缓冲液配制得到的。
[0008] 在本发明一个较佳实施例中，所述生物素标记的鼠抗人I姐抗体溶液的制备过程 为：鼠抗人I姐抗体W1:20摩尔比加入到溶于二甲基甲酯胺的生物素中，再用0.IM、抑值 为7. 4的憐酸盐缓冲液透析得到。
[0009] 在本发明一个较佳实施例中，所述链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液的制备过 程为：将链霉亲和素标记的纳米磁微粒用磁分离器沉淀，再用0. 1M、抑值为7. 4的憐酸盐缓 冲液重悬，混匀磁分离沉出，并重复清洗，清洗后的纳米磁微粒分散于0. 1M、pH值为7. 4的 憐酸盐缓冲液。
[0010] 在本发明一个较佳实施例中，所述碱性憐酸酶标记的鼠抗人I姐抗体溶液的制备 过程为：用0. 05M、抑值为6. 0的MES缓冲液对碱性憐酸酶标记的鼠抗人I姐抗体稀释。
[0011] 提供一种纳米磁微粒化学发光法定量检测血清总I姐的方法，包括步骤为： (1) 将待测血清样本与生物素标记的鼠抗人I姐抗体、链霉亲和素标记的纳米磁微粒 共解育得到第一溶液. (2) 在外加磁场作用下，磁分离洗涂去除所述第一溶液中多余的生物素标记的鼠抗人 I姐抗体得到第二溶液； (3) 向所述第二溶液中加入碱性憐酸酶标记的鼠抗人I姐二抗并解育得到第Ξ溶液， 形成抗I姐抗体-I姐-抗I姐二抗的双抗夹屯、结构； (4) 在外加磁场作用下，磁分离洗涂去除所述第Ξ溶液中未结合的酶标抗体和杂质，得 到第四溶液； (5) 向所述第四溶液中加入酶促化学发光底物，测定发光强度； (6) 利用已知浓度的校准品绘制发光强度标准曲线，根据步骤（5)得到的发光强度对照 所述标准曲线，计算得出待测血清样本中总I姐的含量。
[0012] 在本发明一个较佳实施例中，步骤（1)和步骤（3)中所述的解育条件是在37°C下 反应15-30分钟；步骤（2)和步骤（4)中所述的磁分离操作为将溶液置于磁场中静置2分 钟，弃去上清后加入清洗液，之后重复此操作2次。 阳013] 在本发明一个较佳实施例中，所述定量检测方法在全自动化学发光仪Lumiray系 列上进行，所述全自动化学发光仪Lumiray系列为Lumiray1200、Lumiray1220、Lumiray 1260 或Lumiray1280。
[0014] 在本发明一个较佳实施例中，所述定量检测方法包括的步骤为： (1) 将所述试剂盒放入全自动化学发光仪的试剂仓里并进行识别； (2) 将校准品置于所述全自动化学发光仪的仪器样本仓，识别校准品信息，分配校准品 位置； (3) 将质控物或待测样本置于仪器样本仓，编辑检测信息； (4) 启动运行程序，所有校准品/质控物/待测样本自动进行处理得到结果。
[0015] 本发明的有益效果是：本发明的纳米磁微粒化学发光法检测血清总I姐的试剂盒 及方法，在化学发光免疫分析基础上，通过引入具有高比表面积和磁分离作用的纳米磁微 粒作为固相载体，从而提高抗体/抗原包被量的同时，简化了反应过程中的清洗步骤，加快 了检测的速度。
【附图说明】
[0016] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于 本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可W根据运些附图获得其它 的附图，其中： 图1是本发明实施例Ξ中I姐标准曲线图； 图2是本发明实施例四最低检测限实验中AB两点浓度-发光值拟合曲线图； 图3是本发明实施例四方法与化adia化iCAP系统测值结果比对图。
【具体实施方式】
[0017] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施 例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通 技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范 围。 阳0化]实施例一： 提供一种纳米磁微粒化学发光法定量检测血清总I姐的试剂盒，包括如下试剂： (1) 生物素标记的鼠抗人I姐抗体溶液，浓度为0.化g/ml; (2)链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液，浓度为0. 4mg/ml ; (3) 碱性憐酸酶标记的鼠抗人I姐抗体溶液，浓度为0.化g/ml; (4% 个不同浓度水平的I姐校准品：2IU/ml，10IU/ml，50IU/ml，200IU/ml，1000IU/ml，5000lU/ml; (5)2个浓度水平的1姐质控品：10 111/1111，200 11]/1111。
[0019] 实施例二： 本发明提供的一种纳米磁微粒全自动化学发光法定量检测血清总I姐试剂盒的制备 包括如下步骤：血清总I姐试剂盒的制备： (1)配制缓冲液： 配制0. 1M、抑值为7. 4的憐酸盐缓冲液，0. 1M、抑值为7. 4的Tris-肥1缓冲液，0. 05M、 抑值为6. 0的MES缓冲液。
[0020] 0. 1M、抑值为7. 4的憐酸盐缓冲液的配制：取容量1L的烧杯，加入800ml去离子 水，称取2. 56g胞2册〇4，12&0、0. 44g胞&口〇4,2&0和9g化C1，加入到烧杯中，揽拌使其充 分溶解，用肥1或化0H调节抑值至7. 4 + 0. 05,加入质量分数为2%的甘露醇、质量分数为 1〇/〇的甘油，揽拌0.化至完全溶解，加去离子水定容至1L。
[0021] 0. 1M、抑值为7. 4的Tris-HCl缓冲液的配制：取容量1L的烧杯，加入800ml去 离子水，称取12.llgTris(Ξ径甲基氨基甲烧）加入到烧杯中，揽拌使其充分溶解，用肥1 或化0H调节抑值至7. 4 + 0. 05,加入质量分数为2%的BSA、质量分数为0. 3%的Proclin 300,揽拌0.化至完全溶解，加去离子水定容至1L。
[0022] 0. 05M、抑值为6.0的MES缓冲液的配制：取容量1L的烧杯，加入800ml去离子水， 称取9.76gMES(2-(N-吗嘟代）乙横酸)、9g化C1加入到烧杯中，揽拌使其充分溶液，用肥1 或化0H调节抑值至6.0+0. 05,加入质量分数为1%的BSA、质量分数为0. 1%的Tween-20， 揽拌0.化至完全溶解，加去离子水定容至1L。
[0023] (2)制备生物素标记的鼠抗人I姐抗体溶液 将鼠抗人I姐抗体W1:20的比例加入到溶于二甲基甲酯胺的生物素中，室溫条件下充 分混合反应30分钟，反应后的溶液用0. 1M、抑值为7. 4的憐酸盐缓冲液透析。BCA法测定 生物素标记的鼠抗人I姐抗体溶液的浓度，并调整其浓度到0.化g/ml。
[0024] (3)制备链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液 将链霉亲和素标记的纳米磁微粒用磁分离器沉淀出来，用0. 1M、pH值为7. 4的憐酸盐 缓冲液重悬，充分混匀15分钟后磁分离沉出，弃去上清，再用0. 1M、抑值为7. 4的憐酸盐缓 冲液重悬，如此重复清洗5次，清洗后的纳米磁微粒分散于0. 1M、抑值为7. 4的憐酸盐缓冲 液，浓度为〇.4mg/ml。 阳0巧](4)制备碱性憐酸酶标记的鼠抗人I姐抗体溶液； 用0. 05M、抑值为6. 0的MES缓冲液将碱性憐酸酶标记的鼠抗人I姐抗体稀释到0.化g/mlο
[0026] (5)制备I姐校准品 取I姐蛋白，用0. 1M、抑值为7.4的Tris-肥1缓冲液配制成2、10、50、200、1000、 5000IU/ml的校准点。
[0027] (6)制备I姐质控品； 取I姐蛋白，用0. 1M、抑值为7. 4的化is-肥1缓冲液配制成10、200IU/ml的质控品。
[0028] (7)试剂盒组装； 将生物素标记的鼠抗人I姐抗体溶液、链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液、碱性憐 酸酶标记的鼠抗人I姐抗体溶液、I姐校准品和质控品组装成试剂盒。
[0029] 实施例S: 提供了一种纳米磁微粒全自动化学发光法定量检测血清总I姐试剂盒的检测方法， 检测在全自动化学发光仪Lumiray系列化umiray1200、Lumiray1220、Lumiray1260、 Lumiray1280等）上进行，具体仪器操作步骤如下： (1)将试剂盒放入全自动化学发光分析/测定仪试剂