用于治疗或预防疱疹病毒感染症的医药组合物的制作方法

专利名称：用于治疗或预防疱疹病毒感染症的医药组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗或预防疱疹病毒感染症的医药组合物等。
背景技术：
疱疫病毒(Herpesvirus)是将线状双链DNA作为基因组而具有的DNA病毒,具有正二十面体的核衣壳被囊膜覆盖的结构。分类为α、β、Y三种亚科，但是病毒学上重要的病毒属于α疱疫病毒亚科。
α疱疹病毒亚科分类有单纯疱疹病毒、水痘病毒、马立克病病毒以及传染性喉气管炎病毒。
作为单纯疱疫病毒(Herpes simplex virus,HSV)的重要的例子,可以举出将人作为宿主的单纯疱疹病毒I (HSV-I)以及单纯疱疹病毒2 (HSV-2)。如果HSV通过皮肤或者粘膜而感染人，则会成为皮肤粘膜疾病的病因，还会引起致死性脑炎。
并且，初次感染后，即使病情治愈仍潜伏感染于体内，频繁地再激活而引起复发性感染。
并且，属于水痘病毒且作为重要的例子，可以举出猪水疱疹病毒I。 猪水疱疹病毒 I还被称为伪狂犬病病毒，成为猪奥捷士奇病的病因。
疱疹病毒的向宿主细胞的感染，是通过由病毒侧以及细胞侧的多种因子参与的复杂的过程(process)进行的。
疱疹病毒具有囊膜，从囊膜突出有糖蛋白B以及糖蛋白D(以下，有时分别称为 “gB”以及“gD”。)的两种糖蛋白。向宿主细胞感染时，需要这些糖蛋白与细胞表面的受体结合，在病毒颗粒与细胞之间产生膜融合。
迄今为止，已知晓gD将细胞表面的疱疫病毒侵入介体(Herpes Virus Entry Mediator,HVEM)以及结合素(nectin)作为受体的事实(例如，参照非专利文献I以及2)。
并且，本发明的发明者们发现II型成对免疫球蛋白样受体(Paired Immunoglobulin-like type 2Receptor, PILR)与 gB 特异性结合，并确认出 HSV 感染 PILR 表达细胞、对于PILR表达细胞的HSV感染被抗PILR抗体抑制、以及gB与PILR的缔合 (associate)会诱导HSV与细胞的细胞融合(例如，参照专利文献I)。PILR是在HK细胞、 树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞等的免疫细胞中表达的蛋白。
并且，属于水痘病毒的水痘带状疱疹病毒(VZV)也具有作为囊膜蛋白的gB。本发明的发明者们发现VZV的gB与称为髓鞘相关糖蛋白(Myelin Associated Glycoprotein, MAG)的神经组织特异性分子结合，并确认出VZV感染MAG表达细胞、对于MAG表达细胞的 VZV感染被抗MAG抗体抑制、以及gB与MAG的缔合会诱导VZV与MAG表达细胞的膜融合。 MAG是特异性地分布在脑、脊髓、末梢神经组织的细胞表面分子，已知其控制神经细胞中的轴索的延伸。
并且，进一步研究的结果，发现HSV也通过gB与MAG的结合而与宿主细胞膜融合 (以上例如参照非专利文献3)。
然而，PILR、MAG均只有在极其有限的种类的培养细胞中表达。在体内试验(in vivo),这些gB受体的表达一般也只限于骨髓细胞和神经胶质细胞(glia cell)。
另一方面，疱疹病毒在体外试验(in vitro)能够感染多种培养细胞，在体内试验 (in vivo)，将作为原发感染部位的上皮细胞和用于形成潜伏感染的神经细胞作为最重要的靶标。
因此，可以认为与gB结合而作为疱疹病毒的受体起作用的细胞表面分子不止只有 PILR 和 MAG。
为了抑制gB与其受体的结合，也可以利用使用抗gB抗体等而阻断(block)病毒上的受体结合部位的方法。但是，如果使用例如抗gB抗体等与病毒结合的物质，则病毒自身可能会产生变异而避免受到该物质的阻滞。
另一方面，目前，阿昔洛韦作为抗疱疫病毒药而广为使用。如果阿昔洛韦在疱疫感染细胞中被磷酸化，则会成为活性形式，抑制DNA聚合酶而防止病毒增殖。因此，虽然对于感染细胞，起杀害作用，但是不能防止病毒感染本身。据此，不能从体内排除潜伏 感染病毒， 从而不能阻止复发性感染、不能迅速抑制感染扩散。并且，报道指出还存在对阿昔洛韦表现出抗性的疱疫病毒。
并且，最近，报道有通过给予肌球蛋白轻链激酶抑制剂、或基于RNAi法抑制肌球蛋白轻链激酶的表达，可抑制HSV-I的即早基因(immediate early gene)的表达(参照非专利文献4)。在同文献中，记载有肌球蛋白轻链激酶的抑制不影响病毒与宿主细胞的结合、 以及病毒向宿主细胞的摄取。因此，建立了以下假说肌球蛋白II不参与病毒向宿主细胞的侵入，而HSV-I侵入到细胞的结果，可能导致肌球蛋白II活化，使细胞表面附近的肌动蛋白细胞骨架(actin cytoskeleton)重构,从而使HSV-I容易通过肌动蛋白皮质。
现有技术文献
专利文献
专利文献I :国际公开第W02008/084710号公报
非专利文献
非专利文献I Montgomery, R. I.等，Cell, 1996,87 :427-436
非专利文献2 :Geraghty，R. J.等，Science，1998，280 :1618-1620
非专利文献3 Suenaga, T.,等，Proc. Natl. Acad. Sci. USAdoi 10. 1073/ pnas. 0913351107
非专利文献4:Koithan T.等，The 34th International Herpesvirus Workshop, July 25to 31，2009，Ithaca，New York, USA, Abstract 4. 31发明内容
技术问题
本发明的目的在于，发现在多种细胞中表达且作为疱疹病毒的受体起作用的蛋白，并且提供通过抑制该受体与疱疹病毒的结合而防止病毒向细胞侵入的疱疹病毒感染症的预防剂或者治疗剂。
技术方案
本发明的发明者们为了解决上述问题，反复进行了研究，其结果发现，与上述的非专利文献4的假说不同，如果疱疹病毒开始感染生物个体，则在细胞表面诱导出存在于包括肌细胞的所有细胞中的非肌肉肌球蛋白重链IIA以及非肌肉肌球蛋白重链IIB(以下有时分别称为“NMHC-IIA”、“NMHC-IIB”。)，其C末端突出到细胞外，通过与作为疱疹病毒表面的糖蛋白的gB结合，作为宿主细胞的侵入受体(entry receptor)起作用。
并且，确认出NMHC-IIA以及NMHC-IIB的向细胞表面附近的转移，是由于如果疱疹病毒感染，则控制非肌肉肌球蛋白IIA以及非肌肉肌球蛋白IIB(以下有时分别称为 “NM-IIA”、“NM-IIB”。)的细胞内定位的肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase, MLCK)的功能被增进,其结果,NM-IIA、NM-IIB 的调节轻链(regulatory light chain, RLC) 的磷酸化被增强而引起的。
进一步地，发现通过抑制MLCK、抑制NMHC-IIA或者NMHC-IIB的表达、给予抗 NMHC-IIA抗体、给予MLCK显性负性突变体等，据此能够防止疱疹病毒的向细胞的侵入，由此完成了本发明。
SP，本发明涉及以下[I] [19]。
[I] 一种用于预防或治疗疱疹病毒感染症的医药组合物，该医药组合物作为有效成分而包含抑制糖蛋白B与非肌肉肌球蛋白重链IIA或者非肌肉肌球蛋白重链IIB结合的物质。
[2]如上述[I]所述的医药组合物，所述的抑制糖蛋白B与非肌肉肌球蛋白重链 IIA或者非肌肉肌球蛋白重链IIB结合的物质，是肌球蛋白三磷酸腺苷酶活性抑制剂或者肌球蛋白轻链激酶抑制剂。
[3]如上述[2]所述的医药组合物，所述肌球蛋白轻链激酶抑制剂是ML-7。
[4]如上述[2]所述的医药组合物，所述肌球蛋白轻链激酶抑制剂是肌球蛋白轻链激酶途径抑制剂。
[5]如上述[4]所述的医药组合物，所述肌球蛋白轻链激酶途径抑制剂是从由钙调蛋白拮抗剂、钙螯合物、钙拮抗剂组成的组中选择的。
[6]如上述[2]所述的医药组合物，所述肌球蛋白轻链激酶抑制剂是肌球蛋白轻链激酶的显性负性突变体。
[7]如上述[I]所述的医药组合物，所述的抑制糖蛋白B与非肌肉肌球蛋白重链 IIA或者非肌肉肌球蛋白重链IIB结合的物质，是针对非肌肉肌球蛋白重链IIA或者非肌肉肌球蛋白重链IIB的抗体。
[8]如上述[7]所述的医药组合物，所述抗体与由序列号为I或7中所记载的氨基酸序列构成的肽结合。
[9]如上述[7]所述的医药组合物，所述抗体与非肌肉肌球蛋白重链IIA或者非肌肉肌球蛋白重链IIB中的、当疱疹病毒感染时露出到细胞外的区域结合。
[10]如上述[I]所述的医药组合物，所述的抑制糖蛋白B与非肌肉肌球蛋白重链 IIA或者非肌肉肌球蛋白重链IIB结合的物质，是抑制非肌肉肌球蛋白重链IIA或者非肌肉肌球蛋白重链IIB表达的物质。
[11]如上述[10]所述的医药组合物，所述的抑制非肌肉肌球蛋白重链IIA或者非肌肉肌球蛋白重链IIB表达的物质，是从由具有RNAi效应的双链核酸、反义核酸、核酶以及编码这些的核酸组成的组中选择的。
[12]如上述[I]所述的医药组合物，所述的抑制糖蛋白B与非肌肉肌球蛋白重链 IIA或者非肌肉肌球蛋白重链IIB结合的物质，是可溶性非肌肉肌球蛋白重链IIA或者可溶性非肌肉肌球蛋白重链IIB。
[13]如上述[I]至[12]中任意一项所述的医药组合物，所述疱疹病毒是单纯疱疹病毒、猪水疱疹病毒I型或者巨细胞病毒。
[14] 一种双链RNA，由序列号为3以及序列号为4中所记载的碱基序列构成，对于非肌肉肌球蛋白重链IIA具有RNAi效应。
[15] 一种核酸,包含由序列号为5中所记载的碱基序列构成的DNA,编码对于非肌肉肌球蛋白重链IIA具有RNAi效应的双链RNA。
[16] 一种双链RNA，由序列号为9以及序列号为10中所记载的碱基序列构成，对于非肌肉肌球蛋白重链IIB具有RNAi效应。
[17] 一种核酸,包含由序列号为11中所记载的碱基序列构成的DNA,编码对于非肌肉肌球蛋白重链IIB具有RNAi效应的双链RNA。
[18] 一种筛选用于预防或治疗疱疹病毒感染症的医药的方法，包括以下工序用候选化合物处理表达非肌肉肌球蛋白重链IIA或者非肌肉肌球蛋白重链IIB的细胞；向所述细胞感染疱疹病毒；测定在所述细胞中的非肌肉肌球蛋白重链IIA或者非肌肉肌球蛋白重链IIB的向细胞膜附近的移动、或者向所述细胞的疱疹病毒的侵入中的至少一个。
[19] 一种筛选用于预防或治疗疱疹病毒感染症的医药的方法，包括以下工序在非肌肉肌球蛋白重链IIA或者非肌肉肌球蛋白重链IIB与糖蛋白B能够结合的条件下，使非肌肉肌球蛋白重链IIA或者非肌肉肌球蛋白重链IIB与糖蛋白B和候选化合物接触；测定非肌肉肌球蛋白重链IIA或者非肌肉肌球蛋白重链IIB与糖蛋白B的结合。
有益效果
本发明的医药组合物，由于抑制在多种细胞中作为疱疹病毒的侵入受体(entry receptor)起作用的NMHC-I IA或者NMHC-IIB与疱疹病毒表面的糖蛋白gB的结合，因此可以抑制向机体内的所有细胞的疱疹病毒的感染。
并且，本发明的医药组合物，由于防止病毒向细胞侵入，因此不仅有感染细胞中的病毒的杀害效果，而且还通过预防从某个细胞到其他细胞的感染扩散，由此可以从体内排除潜伏感染病毒而防止复发性感染。
并且，包含于本发明的医药组合物中的、作为抑制NMHC-IIA或者NMHC-IIB与gB 结合的物质，如果使用抗体或核酸等机体来源的物质，则能够获得副作用小、安全性高的医药。
尤其，包含于本发明的医药组合物中的、作为抑制NMHC-IIA或者NMHC-IIB与gB 结合的物质，如果使用NM-IIA或NM-IIB的抑制剂、抗NMHC-IIA抗体或抗NMHC-IIB抗体、 NMHC-IIA或NMHC-IIB的表达抑制物质等，则由于作用于受体(NMHC-IIA或NMHC-IIB)侧而非疱疹病毒，因此也不会发生因病毒变异而失效。


图IA表示向MEF细胞感染YK711，用抗myc抗体以及抗Flag抗体进行免疫沉淀， 对沉淀物进行电泳，并银染的结果。
图IB表示向Vero细胞感染各种HSV-I，用抗Flag抗体或者抗gB抗体进行免疫沉淀，对沉淀物用抗NMHC-IIA抗体进行免疫印迹的结果。
图2A表示通过流式细胞术对可溶性NMHC-IIA的C末端片段与各种HSV-I的结合进行分析的结果。
图2B表示通过流式细胞术对HSV-I的gB转染子或gD转染子与可溶性NMHC-IIA 的C末端片段的结合进行分析的结果。
图3A表示向Vero细胞感染HSV-1，用荧光显微镜观察NMHC-IIA的细胞内定位的结果。
图3B表示使感染了 HSV-I细胞的细胞表面蛋白生物素化，用亲和素珠进行免疫沉淀，接着用抗NMHC-IIA抗体进行免疫印迹的结果。
图3C是分别向细胞感染gB表达HSV-I和gH表达HSV-I，使细胞表面蛋白生物素化后，用抗Flag抗体进行沉淀的结果。
图4A是通过流式细胞术研究了对于用MLCK抑制剂ML-7进行前处理的细胞的、 HSV-I的感染的结果。
图4B表示通过荧光显微镜对用MLCK抑制剂ML-7经过前处理的细胞中的、HSV-I 侵入时的细胞膜附近的NMHC-IIA浓度进行观察的结果。
图4C表示使用流感病毒进行了与图4A同样的实验的结果。
图5A是通过流式细胞术分析了对于用抗NMHC-IIA血清经过前处理的Vero细胞的、HSV-I的感染的结果。
图5B是通过流式细胞术分析了对于用抗NMHC-IIA血清经过前处理的 CHO-hNectin-Ι细胞的、HSV-1的感染的结果。
图5C是通过流式细胞术分析了对于用抗NMHC-IIA血清经过前处理的CHO-PILRa 细胞的、HSV-I的感染的结果。
图6A是通过流式细胞术分析了对于用shRNA敲减NMHC-IIA的细胞的、HSV-I的感染的结果。
图6B是通过流式细胞术分析了对于用shRNA敲减NMHC-IIA的细胞的、流感病毒的感染的结果。
图6C是敲减NMHC-IIA的细胞与HSV-I的膜融合测试的结果。
图6D是敲减NMHC-IIA的细胞中的、VSV包膜G蛋白介导性的膜融合测试的结果。
图7A表示通过免疫印迹法确认HL60/NMHC-IIA中的NMHC-IIA过表达的结果。
图7B表示通过流式细胞术分析了对于NMHC-IIA过表达细胞的HSV-I的感染的结果O
图7C表示通过荧光显微镜观察了对于NMHC-IIA过表达细胞的HSV-I的感染的结果O
图7D表示通过流式细胞术分析了抗NMHC-IIA血清对于HSV-I感染NMHC-IIA过表达细胞的影响的结果。
图7E表示通过流式细胞术分析了对于NMHC-IIA过表达细胞的伪狂犬病病毒的感染、以及基于抗NMHC-IIA血清的对感染的抑制的结果。
图8为概略性示出YK711以及YK712制造方法的图。
图9A表示通过流式细胞术分析了对于用阿昔洛韦经过前处理的细胞的HSV-I的侵入的结果。
图9B表示通过流式细胞术分析了对于用ML-7经过前处理的细胞的HSV-I的侵入的结果。
图9C表示通过流式细胞术分析了对于用抗NMHC-IIA血清经过前处理的细胞的 HSV-I的侵入的结果。
图10表示向Vero细胞在MLCK抑制剂(ML_7)的存在下或不存在下感染HSV-I，通过免疫印迹测定RLC的磷酸化的结果。
图IlA表示向Vero细胞感染HSV-1，在MLCK抑制剂(BAPTA-AM)存在下或不存在下静置后，通过使用抗NMHC-IIA抗体的免疫荧光法分析了 NMHC-IIA的细胞内定位的结果。
图IIB表示向Vero细胞在MLCK抑制剂(BAPTA-AM)存在下或不存在下感染HSV-I， 通过免疫印迹测定了 RLC的磷酸化的结果。
图IlC表示向Vero细胞在图示的浓度的BAPTA-AM存在下或不存在下感染 HSV-1GFP，通过流式细胞术测定了平均荧光强度的结果。
图IID表示向Vero细胞在图示的浓度的BAPTA-AM存在下或不存在下感染流感病毒，通过流式细胞术测定了平均荧光强度的结果。
图12A表示向利用空表达质粒(Vector)或者MCLK的显性负性突变体的表达质粒 (Dn-MLCK)转染的Vero细胞感染HSV-I，通过使用抗磷酸化RLC抗体或抗RLC抗体的免疫印迹而测定RLC的磷酸化的结果。
图12B表示从上述图12A的结果求出相对于全RLC蛋白量的磷酸化RLC蛋白质的相对量的结果。
图12C表示向利用空表达质粒(Vector)或者MCLK的显性负性突变体的表达质粒 (Dn-MLCK)转染的Vero细胞感染野生型HSV-1GFP，通过流式细胞术测定平均荧光强度的结果O
图12D表示向利用空表达质粒(Vector)或者MCLK的显性负性突变体的表达质粒 (Dn-MLCK)转染的Vero细胞感染野生型流感病毒，通过流式细胞术测定平均荧光强度的结果O
图13是向小鼠角膜感染模型预先给予MLCK抑制剂ML-7后，接种野生型HSV-I，研究泪中的病毒效价、角膜炎症状、生存率的结果。
图14是向小鼠角膜感染模型同时给予MLCK抑制剂ML-7和野生型HSV-1，研究生存率的结果。
图15是向小鼠角膜感染模型预先给予MLCK抑制剂BAPTA-AM后，接种野生型 HSV-I，研究生存率的结果。
图16A是研究Vero细胞以及Cos-I细胞中的NMHC-IIA和NMHC-IIB蛋白的表达的结果。
图16B表示向Cos-I细胞感染YK711或YK712，用抗Flag抗体进行免疫沉淀，对沉淀物用抗NMHC-IIB抗体进行免疫印迹的结果。
图16C表示向Cos-I细胞感染野生型HSV_1 (F)，用抗Flag抗体或抗gB抗体进行免疫沉淀，对沉淀物用抗NMHC-IIB抗体进行免疫印迹的结果。
图17A表示通过流式细胞术分析HSV-I的gB转染子或gD转染子与可溶性 NMHC-IIB的C末端片段的结合的结果。
图17B表示通过流式细胞术分析HSV-I的gB转染子或gD转染子与对照Fe (⑶200)结合的结果。
图18A表示用ML-7进行前处理或者不进行前处理，使感染HSV-I的Cos-I细胞表面生物素化，通过亲和素珠进行免疫沉淀，接着用抗NMHC-IIB抗体进行免疫印迹的结果。
图18B是通过流式细胞术研究对于用MLCK抑制剂ML-7经过前处理的Cos-I细胞的HSV-I感染的结果。
图18C表示使用流感病毒进行与图18B同样的实验的结果。
图19A表示确认Cos-I细胞中的NMHC-IIB的基于shRNA的敲减的免疫印迹的结果O
图19B是通过流式细胞术分析对于用shRNA敲减NMHC-IIB的细胞的HSV-I感染的结果。
图19C是通过流式细胞术分析对于用shRNA敲减NMHC-IIB的细胞的流感病毒感染的结果。
图19D是敲减NMHC-IIB的细胞与HSV-I的膜融合测试的结果。
图19E是敲减NMHC-IIB的细胞中的VSV包膜G蛋白介导性的膜融合测试的结果。
图20A表示通过免疫印迹法确认IC21/NMHC-IIB细胞中的NMHC-IIB的过表达的结果。·
图20B表示通过荧光显微镜观察对于NMHC-IIB过表达细胞的HSV-I的感染的结果O
图20C表示通过流式细胞术分析对于NMHC-IIB过表达细胞的HSV-I的感染的结果O
图21A表示向Cos-I细胞在图示的浓度的BAPTA-AM存在下或不存在下感染 HSV-1GFP，通过流式细胞术测定平均荧光强度的结果。
图21B表示向Cos-I细胞在图示的浓度的BAPTA-AM存在下或不存在下感染流感病毒，通过流式细胞术测定平均荧光强度的结果。
图22是通过流式细胞术研究对于用ML-7经过前処理的细胞的HSV-2的感染的结果O
图23是通过流式细胞术分析对于用抗NMHC-IIArod小鼠血清或抗NMHC-IIBrod 小鼠血清经过前処理的细胞的HSV-I的感染的结果。
图24是通过流式细胞术分析对于用抗NMHC-IIArod小鼠血清或抗NMHC-IIBrod 小鼠血清经过前処理的细胞的HSV-2的感染的结果。
图25是通过荧光显微镜观察对于用抗NMHC-IIArod小鼠血清或抗NMHC-IIBrod 小鼠血清经过前処理的细胞的HCMV的感染的结果。
图26是通过FACS测定对于用抗NMHC-IIArod小鼠血清或抗NMHC-IIBrod小鼠血清经过前処理的细胞的HCMV的感染的结果。
图27是通过流式细胞术测定对于敲减NMHC-IIA的细胞的HSV-2的感染的结果。
图28是通过流式细胞术测定对于敲减NMHC-IIB的细胞的HSV-2的感染的结果。
图29是通过流式细胞术测定对于NMHC-IIA过表达细胞的HSV-2的感染的结果。
图30是通过流式细胞术测定对于NMHC-IIB过表达细胞的HSV-2的感染的结果。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
本发明所涉及的医药组合物，是用于治疗或预防疱疹病毒感染症的医药组合物， 其特征在于，包含抑制糖蛋白B与非肌肉肌球蛋白重链IIA或者非肌肉肌球蛋白重链IIB 结合的物质。
疱疹病毒是指如上所述的动物DNA病毒，疱疹病毒科的病毒被分类成α、β、Y三个亚科。如上所述，α疱疫病毒亚科进一步被分类成单纯疱疫病毒、水痘病毒、马立克病病毒、传染性喉气管炎病毒，作为代表性病毒，可以举出单纯疱疹病毒I (HSV-I)、单纯疱疹病毒2 (HSV-2)、水痘/带状疱疹病毒、猪水疱疹病毒I (伪狂犬病病毒)、牛疱疹病毒等。
作为属于β疱疹病毒亚科的病毒，已知有人类巨细胞病毒(HCMV)等，而作为属于 Y疱疹病毒亚科的病毒，已知有EB病毒、卡波西肉瘤相关疱疹病毒等。
作为属于Y疱疫病毒亚科的病毒，具有代表性的是淋巴隐病毒 (Lymphocryptovirus)属的爱泼斯坦-巴尔病毒(EB病毒)等。
本发明所涉及的医药组合物，可以用于任何α、β、Υ亚科的疱疹病毒感染症。例如，可用于α疱疫病毒的HSV-I、HSV-2、猪水疱疫病毒I (伪狂犬病病毒)，β疱疫病毒的 HCMV, Y疱疹病毒的EB病毒的感染症。
单纯疱疹病毒是指疱疹病毒的一种，如上所述分类成HSV-l、HSV-2。HSV-1主要引起口唇疱疹，可成为疱疹性口腔炎、疱疹性角膜炎、单纯疱疹性脑炎等的病因，潜伏感染于三叉神经节。HSV-2主要可以成为生殖器疱疹、新生儿疱疹、疱疹性髓膜炎、疱疹性脊髓炎等的病因，潜伏感染于脊神经节。
巨细胞病毒在出生时或哺乳期的感染，大多属于隐性感染，在儿童和成人中，也多数属于隐性感染，但是还会引起肝炎或单核细胞增多症。在诸如AIDS患者或恶性肿瘤患者等患有免疫不全的患者中，症状会加重。在该病毒引起的肺炎或视网膜炎的治疗中，使用更昔洛韦。
猪水疱疹病毒I还被称为伪狂犬病病毒，其感染症属于申报传染病。感染例如猪等多种动物，对于猪主要是隐性感染，但是在猪以外的动物中表现出神经症状，经过急性病程至于死亡。
对于EB病毒而言，多数人在婴儿期隐性感染，成为病原携带者。成人的感染成为传染性单核细胞增多症的病因，认为是伯基特氏淋巴瘤或鼻咽癌的病因。
在本说明书中，感染作为指病毒通过皮肤或粘膜而侵入到机体的过程、或者病毒表面的糖蛋白与细胞表面的受体(侵入受体)缔合而通过膜融合侵入细胞内的过程的任意一个的用语而使用。并且，本说明书中，疱疹病毒的感染症是指病毒侵入机体内的状态，而与症状无关，包含持续感染、隐性感染、潜伏感染。
在本说明书中，疱疹病毒感染症的治疗或预防，以其最为广义的意思使用，具体而言，是指使以下情况发生缓解与疱疹病毒的感染有关的一种或多种症状、或者阻止与疱疹病毒的感染有关的一种或多种症状恶化；抑制感染后症状的发生；阻止(迟延或停止)机体内的病毒向细胞感染；减少机体内的病毒数等。
糖蛋白B(gB)是指存在于疱疹病毒表面的一种糖蛋白。作为同样的糖蛋白，有gD、 gH以及gL，其中gB以及gD与细胞表面的受体结合。为了使膜融合发生，因而病毒感染细胞，这需要gB以及gD这两个蛋白与细胞表面的受体结合。
非肌肉肌球蛋白重链IIA(NMHC-IIA)是指作为非肌肉肌球蛋白II(NM-II)的一种重链异构体(heavy chain isoform)的非肌肉肌球蛋白IIA(NM-IIA)的重链亚型 (subunit)ο
并且，非肌肉肌球蛋白重链IIB(NMHC-IIB)是指作为NM-II的一种重链异构体的非肌肉肌球蛋白IIB(NM-IIB)的重链亚型。
NM-II存在于包括肌肉细胞的所有细胞，是在细胞质分裂、细胞的移动、细胞的形态变化等细胞运动中，起重要的作用的蛋白。NM-II如肌肉的肌球蛋白一样，由各两条的重链、必需轻链以及调节轻链的六个亚基构成，由两个球状的头部和细长的尾部(Rod Domain (杆状结构域))构成。头部由包含ATPase (三磷酸腺苷酶)活性部位以及肌动蛋白结合部位的马达结构域(motor domain)、作为轻链结合部位的颈(neck)构成。杆状结构域呈α-螺旋型卷曲螺旋(a-helical coiled-coil)构型,NM-II缔合而参与双极性蛋白丝的形成。C末端(杆状结构域前端)不呈卷曲螺旋(coiled-coil)构型。
对于脊椎动物的NM-II而言，如果调节轻链的Serl9因Ca2+-钙调蛋白依赖性的肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)而被磷酸化,则会增强ATPase活性， 以能够形成蛋白丝。
在脊椎动物中，存在三种NM-II重链异构体，分别形成同源二聚体(Homodimer)而成为NM-IIA,NM-IIB,NM-IIC0其中，对于NM-IIA和NM-IIB而言，其氨基酸序列以及性质非常相似，报道有NM-IIA和匪-IIB的重链的基因敲除小鼠均导致胚胎死亡。并且，NMHC- IIA 与NMHC-IIB具有约80%的同源性。
如后述的实施例所示，机体内存在富含(dominant)NMHC-IIA的细胞(例如上皮细胞)、富含(dominant) NMHC-IIB的细胞(例如神经细胞)、以及只表达NMHC-IIA或NMHC-IIB 的任意一种蛋白重链的细胞，也可以从这一事实认为，是具有相似的功能的蛋白(例如， 参照 Bresnik AR, Curr Opin Cell Biol. 1999Feb ；11 (I) :26-33. ；Sellers JR, Biochim Biophys Acta. 2000Mar 17; 1496 (I) :3-22 等)。
如上所述，迄今为止也有过关于NM-II和HSV-I感染的关系的报道，但是其内容是，NM-II不参与HSV-I向宿主细胞的侵入，NM-II在HSV-I侵入到细胞后被活化(非专利文献4)。
然而，如后述的实施例所示，本发明的发明者们证实了如果疱疹病毒开始感染生物个体，则Ca2+-钙调蛋白复合物使MLCK活化，据此NMHC-IIA以及NMHC-IIB被诱导在细胞表面。并且，确认出如果NMHC-IIA或NMHC-IIB与病毒表面的gB结合，则会引起病毒与细胞的膜融合，从而病毒侵入到细胞。
该结合可以通过将包含NM-IIA的C末端的片段作为抗原制备的抗体而被抑制，由此可以认为如果疱疹病毒感染，则NMHC-IIA或NMHC-IIB移动到细胞表面而其C末端露出到细胞外，作为疱疫病毒的侵入受体起作用。
需要说明的是，在本说明书中，侵入受体(entry receptor)是指因疱疹病毒与该受体结合而引起其后的疱疹病毒与细胞的膜融合的受体。、
在本说明书中，抑制gB与NMHC-IIA或NMHC-IIB结合的物质(以下，有时仅称为 “结合抑制物质”。)，只要是直接或间接抑制gB与NMHC-IIA或NMHC-IIB结合的物质，没有特别限制，可以使用低分子化合物、核酸、肽、蛋白等所有物质。具体而言，可以举出NM-IIA 或NM-IIB的ATPase活性抑制剂、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)的抑制剂、抗NMHC-IIA抗体、 抗NMHC-IIB抗体、NMHC-IIA或NMHC-IIB的表达抑制物质等。以下，对于这些物质进行说明。
(NMHC-IIA或NMHC-IIB的ATPase活性抑制剂、或者MLCK的抑制剂)
本发明的NMHC-IIA或NMHC-IIB的ATPase活性抑制剂、或者MLCK的抑制剂改变细胞内的NMHC-IIA或NMHC-IIB的定位，当疱疹病毒感染时，防止NMHC-IIA或NMHC-IIB移动到细胞表面。
作为ATPase活性抑制剂,例如可以举出Blebbistatin。
作为MLCK的抑制剂，只要选择性地抑制肌球蛋白轻链激酶，而且还抑制肌球蛋白轻链激酶的活性，贝1J可以使用苏氨酸/丝氨酸激酶(Ser/Thrkinase)抑制剂、穿膜蛋白激酶抑制剂等。
具体而言，可以举出A3、卡弗他丁 C(Calphostin C)、Goe6976、Goe7874、HA1077、 金丝桃素(Hypericin)、K_252a、KT5823、ML-7、ML_9、白皮杉醇(Piceatannol)、星形孢菌素 (Staurosporine)、W-5、W-7、W_12、W-13、渥曼青霉素(Wortmannin)等，但不限于此。其中， 优选为对MLCK的选择性高的ML-7。
并且，由于MLCK为Ca2+-钙调蛋白依赖性的，因此作为MLCK的抑制剂，还可以使用抑制MLCK途径的物质。在本说明书中，MLCK途径是指，表示Ca2+与钙调蛋白形成复合物， 通过该复合物的结合使MLCK活化，MLCK使RLC磷酸化的一系列反应。因此，作为抑制MLCK 途径的物质，可以举出抑制Ca2+和钙调蛋白的复合物形成的物质、或抑制Ca2+-钙调蛋白复合物与MLCK结合的物质(例如，钙调蛋白拮抗剂、钙螯合物、钙拮抗剂等)。
作为I丐螯合物，例如可以举出 ΒΑΡΤΑ(0, O ' -Bis (2-aminophenyl) ethyleneglycol-N,N,N' ,N' -tetraacetic acid tetraacetoxy ester :0,0'-双(2-氨苯基)乙二醇-N，N，N'，N'-四乙酸四(乙酰氧基酯))、BAPTA-AM(将所有的BAPTA的羧基进行乙酰甲酯化，由此容易使细胞吸收)，但是不限于此。
并且，作为抑制MLCK的功能的物质，还可以使用MLCK的显性负性突变体。优选地,给予编码显性负性突变体的基因的载体,因而在机体内表达该突变体。该载体可以根据本领域的技术人员的常规方法制备。例如，可以举出以下等方法在质粒等的克隆位点插入编码MLCK的显性负性突变体的DNA的方法；向细胞或大肠杆菌导入具有腺病毒载体的主干 (backbone)序列的质粒以及将与其相同的序列设置在编码MLCK的显性负性突变体的DNA 的两端的穿梭质粒的这两种质粒，通过同源重组而制备病毒载体的方法。
(抗NMHC-IIA 抗体、抗 NMHC-IIB 抗体)
本发明的抗NMHC-IIA抗体与NMHC-IIA特异性结合，其结果抑制NMHC-IIA与gB 结合。并且，本发明的抗NMHC-IIB抗体与NMHC-IIB特异性结合，其结果抑制NMHC-IIB与 gB结合。
本发明的发明者们确认出将包含NMHC-IIA的C末端的片段(相当于NMHC-IIA的第1665-1960位的肽，序列号1)作为抗原制备的抗体，抑制NMHC-IIA与疱疹病毒gB结合。 这一事实说明，如果NMHC-IIA因病毒感染而移动到细胞表面附近，则其C末端突出到细胞膜外，与gB结合。同样地，对于因病毒感染而移动到细胞表面附近并C末端突出于细胞膜外的NMHC-IIB，也可以通过将包含其C末端的片段作为抗原制备的抗体，抑制与gB的结合。
对于本发明的抗NMHC-IIA抗体而言，只要抑制NMHC-IIA与gB结合，没有特别限制，例如优选，与NMHC-IIA上的当疱疹病毒感染时露出到细胞外的区域结合的抗体。只要是这种抗体，通过与NMHC-IIA上的与gB的结合区域结合，能够抑制NMHC-IIA与gB结合。
更加具体而言，例如可以举出，在NMHC-IIA的C末端附近(例如从C末端到1000 氨基酸)，与约I 约500氨基酸、优选约100 约400氨基酸左右、更优选约200 300氨基酸左右的区域结合的抗体。作为一种例子，可以举出与相当于NMHC-IIA的第1665位 I960位的区域结合的抗体。
并且，本发明的抗NMHC-IIB抗体而言，只要抑制NMHC-IIB与gB结合，没有特别限制，例如优选，与NMHC-IIB上的当疱疹病毒感染时露出到细胞外的区域结合的抗体。只要是这种抗体，通过与NMHC-IIA上的与gB的结合区域结合，能够抑制NMHC-IIB与gB结合。
更加具体而言，例如可以举出，在NMHC-IIB的C末端附近(例如从C末端到1000 氨基酸)，与约I 约500氨基酸、优选约100 约400氨基酸左右、更优选约200 300氨基酸左右的区域结合的抗体。作为一种例子，可以举出与相当于NMHC-IIB的第1672位 1976位的区域结合的抗体。
在本说明书中，“抗体”还包括抗体片段，本发明的抗NMHC-IIA抗体或抗 NMHC-IIB抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体，重组抗体、人源抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab 段(fragment of antigen binding :抗原结合段)、F(ab ' )2 抗体、 scFv (single-chain variable fragment :单链Fv)、双重特异性抗体、合成抗体等。
这些抗体可以通过本领域的技术人员的公知的方法而制备。例如，单克隆抗体可以通过以下方法而获得。即，从用NMHC-IIA或NMHC-IIB致敏的非人哺乳动物分离抗体产生细胞，将该细胞与骨髓瘤细胞等融合，制备杂交瘤细胞，纯化该杂交瘤细胞产生的抗体， 由此获得抗体。并且，多克隆抗体可以从用NMHC-IIA或NMHC-IIB致敏的动物的血清等获得。
在此，用于免疫的NMHC-IIA或NMHC-IIB,可以是人源的，也可以是其他动物来源的，并且，可以使用全长，也可以使用片段，本领域的技术人员可以适宜决定。如果使用片段，例如可以使用在NMHC-IIA或NMHC-IIB中的、当疱疹病毒感染时露出到细胞外的区域的片段。并且，例如，可以是NMHC-IIA或NMHC-IIB的C末端附近(例如从C末端到1000氨基酸)的、约I 约500氨基酸、优选约100 约400氨基酸左右、更优选约200 300氨基酸左右的片段。例如，还可以使用由记载于序列号1的氨基酸序列构成的NMHC-IIA的由第1665位 1960位的296氨基酸构成的片段(以下，有时还称为“NMHC-IIA的C末端片段”。)、或者由记载于序列号-J的氨基酸序列构成的NMHC-IIB的由第1672位 1976位的305氨基酸构成的片段(以下，有时还称为“NMHC-IIB的C末端片段”。)。
并且，一旦获得有效抑制NMHC-IIA或NMHC-IIB与疱疹病毒的结合的非人源单克隆抗体,则也可以通过基因重组法合成该抗体。例如,从产生该抗NMHC-IIA单克隆抗体的杂交瘤细胞通过标准操作规程制备总RNA，使用市场销售的试剂盒而制备编码抗NMHC-IIA抗体的mRNA，然后使用反转录酶合成cDNA，则可以获得编码抗NMHC-IIA抗体的DNA。将包含该DNA的表达载体转染到适当的宿主细胞，在适当的条件下进行培养，由此可以使其表达抗NMHC-IIA抗体。也可以通过同样的方法表达抗NMHC-IIB抗体。
并且，也可以通过将上述cDNA作为模板的PCR法，获得编码⑶R区域的DNA。也可以利用编码该CDR区域的DNA，根据常规方法，并通过基因重组法而制备人源抗体或人源化抗体。例如，利用PCR法，合成编码来源于非人源抗体的CDR区域的DNA以及设计成连接人源抗体的构架区的DNA，进一步地，连接编码人源抗体恒定区的DNA，由此可以获得编码人源抗体的DNA。
将该DNA通过公知的方法(利用限制酶的方法等)插入到表达载体(例如，质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、花椰菜花叶病毒或烟草花叶病毒等植物病毒、 粘粒、YAC、EBV来源附加体)内，将该表达载体转染到适当的宿主细胞，获得转染子。需要说明的是，表达载体还可以包括调控抗体基因的表达的启动子、复制起始点、选择标记基因等。启动子以及复制起始点可以根据宿主细胞和载体的种类而适宜选择。
接着，可以通过将转染子在适当的条件下培养，表达抗NMHC-IIA抗体或抗 NMHC-IIB抗体的人源抗体。
作为宿主细胞，例如可以使用诸如哺乳动物细胞(CH0细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞、HeLa细胞、Vero细胞等)、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞(曲霉属、酵母属等)等真核细胞，或者大肠杆菌(E. Coli)、枯草菌等原核细胞。
对于表达出的抗体，可以通过适宜组合公知的方法(例如，使用蛋白A等的亲和柱、其他的层析柱、过滤器、超过滤、盐析、透析等)，进行分离纯化。
当本发明的抗NMHC-IIA抗体或抗NMHC-IIB抗体为Fab段、F(ab' )2抗体、scFv 等低分子抗体时，还可以使用编码低分子抗体的DNA，通过上述的方法进行表达，并且，还可以用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等酶处理并制备抗体。
(NMHC-I IA 或 NMHC-IIB 的表达抑制剂)
对于本发明的NMHC-IIA或NMHC-IIB的表达抑制剂而言，只要是在细胞内抑制 NMHC-IIA或NMHC-IIB的表达的物质，没有特别限制，例如可以举出具有RNAi效应的双链核酸、反义核酸、核酶(ribozyme)以及编码这些的核酸。通过抑制NMHC-IIA或NMHC-IIB的表达本身，由此减少被疱疹病毒感染时作为受体起作用的NMHC-IIA或NMHC-IIB，从而能够防止疱疹病毒侵入到细胞内。
RNAi效应，是由双链核酸诱导的序列特异性基因表达抑制机制。因为是目标特异性非常高的、且利用原本在机体内存在的基因表达抑制机制的方法，因此安全性高。
作为具有RNAi效应的双链核酸，例如可以举出siRNA。siRNA是当用在哺乳动物细胞时，通常为19 30个碱基左右、优选为21 25个碱基左右的双链RNA。但是，作为本发明的NMHC-IIA或NMHC-IIB的表达抑制剂，也可以是与通过酶(Dicer)切割而可成为 siRNA的长度相比更长的双链RNA。具有RNAi效应的双链核酸一般在其一侧具有与部分目标核酸互补的碱基序列，另一侧具有与其互补的序列。具有RNAi效应的双链核酸一般具有相互在3'末端突出的两个突出碱基(overhang :悬端)，但也可以是不具有悬端的平末端 (blunt end)型。例如，25个碱基的平末端RNA具有以下优点使干扰素应答基因的活化最小化、防止正义链引起的脱靶(off-target)效应、在血清中稳定性非常高，并且还可适用于体内试验(in vivo)。
具有RNAi效应的双链核酸可以基于靶标基因的碱基序列，根据公知的方法而设计。并且，具有RNAi效应的双链核酸可以是双链RNA，可以是DNA-RNA嵌合双链核酸，也可以是人工核酸或者经过各种修饰的核酸。
作为本发明的具有RNAi效应的双链核酸，优选为将含有在编码NMHC-IIA的基因中的记载于序列号2的碱基序列的区域为靶标的双链核酸。作为这种双链核酸，例如，可以举出，由具有记载于序列号3的碱基序列的RNA以及具有记载于序列号4的碱基序列的RNA构成的双链RNA。
并且，作为本发明的具有RNAi效应的双链核酸，优选为将含有在编码NMHC-IIB的基因中的记载于序列号8的碱基序列的区域为靶标的双链核酸。作为这种双链核酸，例如，可以举出，由具有记载于序列号9的碱基序列的RNA以及具有记载于序列号10的碱基序列的RNA构成的双链RNA。
反义核酸，是具有与靶标基因(基本上为转录产物的mRNA)互补的碱基序列的核酸，一般具有10个碱基长 100个碱基长、优选具有15碱基长 30个碱基长的单链核酸。 通过将反义核酸导入到细胞内，并与靶标基因杂交，由此抑制基因的表达。对于反义核酸而言，只要获得对靶标基因的表达抑制效果，则可以是不完全与靶标基因互补的核酸。对于反义核酸而言，本领域的技术人员可以使用公知的软件等而适宜设计。反义核酸可以是DNA、 RNA、DNA-RNA嵌合体中的任意个，并且也可以被修饰。
核酶是将靶标RNA进行催化水解的核酸分子，由具有与靶标RNA互补的序列的反义区域以及承担剪切反应的催化中心区域构成。对于核酶而言，本领域的技术人员可以通过公知的方法而适宜设计。核酶一般是RNA分子，但是也可以使用DNA-RNA嵌合分子。
编码上述的具有RNAi效应的双链核酸、反义核酸、核酶中的任意个的核酸，也可以作为本发明的NMHC-IIA或者NMHC-IIB表达抑制剂使用。如果将包含这种核酸的载体导入到细胞内，则在细胞内表达具有RNAi效应的双链核酸、反义核酸以及核酶，分别起 NMHC-IIA或者NMHC-IIB的表达抑制效果。
作为编码具有RNAi效应的双链核酸的核酸，可以使用分别编码双链的DNA，也可以使用编码通过环介导而连接形成双链核酸的单链核酸的DNA。如果是后者，通过在细胞内转录而获得的单链RNA其互补的部分在分子内杂交，呈发夹(Hairpin)结构。该RNA称为 shRNA (short hairpin RNA :短发夹RNA)。shRNA如果转移到细胞质,则环部分因酶(Dicer) 而被切割，成为双链RNA，引起RNAi效应。
上述的将记载于序列号2的碱基序列为靶标的双链RNA，还可以通过使用记载于序列号5的DNA在细胞内表达shRNA而获得。并且，将记载于序列号8的碱基序列为靶标的双链RNA，还可以通过使用由记载于序列号11的碱基序列构成的DNA在细胞内表达 shRNA而获得。
(可溶性NMHC-IIA或者可溶性NMHC-IIB)
本发明的可溶性NMHC-IIA在细胞外与疱疹病毒gB结合，其结果，抑制细胞表面的 NMHC-IIA与gB的结合。
可溶性NMHC-IIA具有与gB结合的功能，是含有全部或者部分的NMHC-IIA或者其突变体的分子。
当可溶性NMHC-IIA包含部分的NMHC-IIA时，只要具有与gB结合的功能，则无论包含哪一部分均可，但是，例如可以是NMHC-IIA的杆状结构域或者C末端片段。
可溶性NMHC-IIA还可以是全部或者部分的NMHC-IIA与其他可溶性蛋白的融合蛋白。作为该可溶性蛋白，例如，可优选使用IgG蛋白或者其Fe段。
对于可溶性NMHC-IIA而言，本领域的技术人员可以通过基因重组方法而制备。
另一方面，本发明的可溶性NMHC-IIB在细胞外与疱疹病毒gB结合，其结果，抑制细胞表面的NMHC-IIB与gB结合。
可溶性NMHC-IIB具有与gB结合的功能，是含有全部或者部分的NMHC-IIB或者其突变体的分子。
当可溶性NMHC-IIB包含部分的NMHC-IIB时，只要具有与gB结合的功能，则无论包含哪一部分均可，但是，例如可以是NMHC-IIB的杆状结构域或者C末端片段。
可溶性NMHC-IIB还可以是全部或者部分的NMHC-IIB与其他可溶性蛋白的融合蛋白。作为该可溶性蛋白，例如，可优选使用IgG蛋白或者其Fe段。
对于可溶型NMHC-IIB而言，本领域的技术人员可以通过基因重组方法而制备。
(医药组合物)
本发明的医药组合物可以通过经口或者非经口、全身或者局部给药。例如，可以选择点滴等静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射、坐药、灌肠、经口性肠溶剂等，并且可以根据患者的年龄、症状而选择适宜的给药方法。
并且，在本发明的医药组合物中，还可以添加有防腐剂或稳定剂等制剂上可接受的载体。作为制剂上可接受的载体，是指可以与抑制gB与NMHC-IIA或者NMHC-IIB结合的物质(有效成分)一同给药的材料。在制剂上可接受的载体，只要是在药理学以及制剂学上可接受的物质，没有特别限制。例如，可以举出水、生理盐水、磷酸缓冲液、葡萄糖、甘油、 乙醇等药学上可接受的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合·物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、双甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、表面活性齐IJ、赋形齐U、芳香剂、防腐齐U、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、促流动剂、矫味剂等，但是不限于这些载体。
本发明的医药组合物，可以制成通常的医疗制剂的形态。该医疗制剂可以使用上述的载体适宜地制备。作为医疗制剂的形态，没有特别限制，可以根据治疗目的适宜选择而使用。作为其代表性的制剂，可以举出片剂、丸剂、粉剂、液剂、悬浮剂、乳剂、颗粒剂、胶囊齐U、栓剂、注射剂(液剂、悬浮剂、乳剂)等。这些制剂通过通常使用的方法制造即可。
并且，本发明的医药组合物包含核酸时，可以在脂质体、聚合物胶束、阳离子载体等载体中包封核酸而制成药剂。并且，也可以利用如鱼精蛋白等核酸载体。还优选地，通过在这些载体上结合抗体等而使病灶靶标化。并且，还可以在核酸上结合胆固醇等而提高血中滞留性。并且，当本发明的医药组合物为包含编码siRNA等的核酸且给药后在细胞内表达的物质时，还可以将该核酸插入到逆转录病毒、腺病毒、仙台病毒等病毒载体、或者脂质体等非病毒载体上，给予细胞内。
并且，对于包含于本发明的医药组合物的有效成分的量，本领域的技术人员可以根据有效成分的种类而适宜决定。例如，如果是抗NMHC-IIA抗体或者抗NMHC-IIB抗体，则给药量可以为O. 025 50mg/kg,优选为O. I 50mg/kg,更优选为O. I 25mg/kg,尤其优选为O. I 10mg/kg或者O. I 3mg/kg,但并不限于此。
本发明的医药组合物可以以预防或者治疗疱疹病毒感染症为目的，向人或人以外的哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猪、牛、马、猴)等给药。
(治疗方法)
本发明还包括预防或治疗疱疹病毒感染症的方法，其特征在于将上述的本发明所涉及的医药组合物以治疗有效量给药。在本说明书中，治疗有效量是指使以下情况发生的量缓解与疱疫病毒的感染有关的一种或多种症状、或者阻止与疱疫病毒的感染有关的一种或多种症状恶化；抑制感染后症状的发生；阻止(迟延或停止)机体内的病毒向细胞感染；减少机体内的病毒数等。
本发明的治疗方法以人或人以外的哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猪、牛、 马、猴)为对象而使用。
(筛选方法)
本发明还提供一种筛选用于预防或治疗疱疹病毒感染症的医药的方法。
本发明所涉及的筛选方法的一种实施方式，包括以下工序用候选化合物处理表达NMHC-IIA或者NMHC-IIB的细胞；向所述细胞感染疱疹病毒；测定在所述细胞中的 NMHC-IIA或者NMHC-IIB向细胞膜附近的移动或者疱疹病毒向所述细胞的侵入中的至少一个。
表达NMHC-IIA或者NMHC-IIB的细胞可以是原本表达这些蛋白重链的细胞，也可以将原本不表达的细胞或者表达量少的细胞通过用包含编码NMHC-IIA或者NMHC-IIB的基因的表达载体转染而使其表达。作为原本表达NMHC-IIA的细胞，例如可以使用Vero细胞， 作为原本表达NMHC-IIB的细胞，可以使用VeiO细胞或者Cos-I细胞。并且，作为几乎没有发现原本表达NMHC-IIA的细胞，可以使用HL60细胞，作为几乎没有发 现原本表达NMHC-IIB 的细胞，可以使用IC21细胞。
候选化合物可以是诸如低分子化合物、高分子化合物、肽、蛋白质、核酸等任何物质。用候选化合物的处理可以在感染之前进行，也可以与感染工序并行，或者还可以在感染后进行，本领域的技术人员可以根据候选化合物的性质而决定其方法。
对于NMHC-IIA或者NMHC-IIB向细胞膜附近的移动而言，如后述的实施例所述的那样，通过将荧光标记的抗NMHC-IIA抗体或者抗NMHC-IIB抗体与NMHC-IIA、NMHC-IIB结合，并用荧光显微镜检测，由此可以进行观察。并且，对于疱疹病毒向细胞内的侵入而言，如后述的实施例所述的那样，具有绿色荧光蛋白(GFP)或者增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达盒(expression cassette)的基因重组疱疫病毒作为疱疫病毒进行感染，由此可以通过荧光显微镜容易观察。
由此选择的医药抑制NMHC-IIA或者NMHC-IIB作为疱疹病毒的gB受体发挥作用， 作为疱疫病毒的预防或治疗药物有用。
并且，本发明所涉及的筛选方法的另一种实施形态，包括以下工序在NMHC-IIA 或者NMHC-IIB与gB能够结合的条件下，使NMHC-IIA或者NMHC-IIB与gB和候选化合物接触；测定NMHC-IIA或者NMHC-IIB与gB的结合。
对于NMHC-IIA或者NMHC-IIB而言，可以使用提纯的物质，也可以使用表达 NMHC-IIA或者NMHC-IIB的细胞。并且，也可以使用包含与gB的结合部位的部分肽或者可溶性肽。并且，对于gB而言，可以使用表面具有gB的病毒，或者如后述的实施例I所述的那样，也可以使用感染了病毒的细胞。
对于测定NMHC-IIA或者NMHC-IIB与gB结合的工序而言，本领域的技术人员可以适宜选择诸如免疫沉淀法、流式细胞术(flow cytometry)等检测蛋白之间的相互作用的公知的方法而进行。
实施例
以下，基于实施例具体说明本发明，但是本发明并不受这些实施例的任何限制。
[病毒]
在以下的实施例中所使用的各种病毒如下。
YK711 以及 YK712
分别是表达用Myc-TEV-Flag(MEF) tag标记的gB(MEF-gB)或者用 Myc-TEV-Flag(MEF) tag 标记的 gH(MEF-gH)的重组 HSV-1。根据 Kato 等人的方法(Kato, A.等 J Virol 82,6172-6189(2008))，使用含有 pYEbacl02 的 E. coli GS1783 (Jarosinski, K.等 J Virol 81,10575-87.),并通过两步式 Red 重组法(two-step Red-mediated mutagenesis ；Jarosinski, K.等 J Virol 81,10575-87.)而制备。
调整方法概略地示出在图8。
野生型HSV-1 (F)、rB缺失病毒以及其回复突变病毒缺失病毒中缺失的姐序列被复原的病毒)
根据Satoh等人以及Kawaguchi等人的方法，做了准备(Kawaguchi, Y.等J Virol 73,4456-60. , Satoh, T.等 Cell 132，935-44.)。
HSV-1 GFP
是在UL3基因以及UL4基因的基因间区，在Egr-I启动子的调控下，具有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达盒的基因重组HSV-I。
HSV-2 GFP
是在UL50基因以及UL51基因的基因间区，在巨细胞病毒启动子的调控下，具有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达盒以及杆状病毒质粒(bacmid)的基因重组HSV-2 (J. Virol. 83 :11624-11634,2009.)。
PRY GFP
是在gG位点，在人类巨细胞病毒启动子的调控下，具有EGFP的重组伪狂犬病病毒 PRV151。从 Dr. L. ff. Enquist 得到提供。
HSV-IGFP以及PRV GFP在培养细胞中如同野生型病毒一样地成长，只在感染的细胞内表达荧光蛋白。
HCMV ADsubU21. 5
GFP 表达 HCMV(Wang D.等，PNAS 101 :16642-16647，2004)是从 Dr. T. Shenk 获得的。
[融合蛋白、肽等]
在实施例中所使用的融合蛋白和肽，是通过以下的质粒而表达的。
DGEX-NMHC-IIArod
是用于产生谷胱苷妝疏基转移酶(Glutathion-S-transferase)和NMHC-IIA的C 末端片段(序列号1)的融合蛋白(GST-NMHC-IIArod)的质粒。从pEGFP_ARF296 (Sato， Μ.等Mol Biol Cell 18，1009-17.)通过PCR扩增而构建NMHC-IIA的C末端片段的编码区域，将获得的DNA片段向pGEX-4T3 (GE Healthcare公司)，与GST —同克隆到框内 (in-frame)。
pGEX-NMHC-IIBrod
是用于产生谷胱苷肽巯基转移酶和NMHC-IIB的C末端片段的融合蛋白 (GST-NMHC-IIBrod)的质粒。从pEGFP_BRF305 (Sato，M.等 Mol Biol Celll8,1009-17.)通过PCR扩增而构建NMHC-IIB的C末端片段的编码区域，将获得的DNA片段向pGEX_4T3 (GE Healthcare公司),与GST —同克隆到框内。
pME-Ig-NMHC-IIArod 以及 dME-Ig-NMHC-IIBrod
是用于产生作为可溶性NMHC-IIA、可溶性NMHC-IIB的、Ig与NMHC-IIA或者 NMHC-IIB的C末端片段的融合蛋白(分别为NMHC-IIArod-Ig以及NMHC-IIBrod-Ig)的质粒。
pME-Ig-NMHC-IIArod可以通过与pGEX-NMHC-IIArod同样的方法而制备。但是,用改造的PME18S表达载体而代替了 pGEX-4T-3。改造的pME18S表达载体在N末端包含小鼠 ⑶150前导片段(leader segment),在C末端包含人IgGl的Fe段。对于Fe段,为了降低细胞的与Fe受体的结合亲和性，将第266位以及第267位的亮氨酸分别突变为丙氨酸和谷氨酰胺，为了降低HSV-I的与Fe受体(gE)的结合亲和性，将第467位的组氨酸突变为精氨酸。
pME-Ig-NMHC-IIBrod 也用同样的方法而制备。但是，在 pME-Ig-NMHC-IIBrod 中， NMHC-IIB的C末端 片段(序列号7)的编码区域是从pEGFP_BRF305 (Sato，M.等Mol Biol Cell 18，1009-17.)通过PCR扩增而构建的。
pMxs-NMHC-IIA-puro
质粒11347 (Addgene 公司)来源的 NMHC-IIA 的开放读码框(Open Reading Frame)被克隆到 pMxs-puro (Morita, S.等 Gene Ther 7,1063-6·)。该质粒称为 pMxs-NMHC-IIA-puro。
Flag-MYHlO 表汰载体
根据Uchiyama Y等 Proc Natl Acad Sci U S A. 2010Mayl8 ； 107 (20) :9240-5.的方法而制备。
DEP98-gB、DPEP99-gD、pPEP101-gL、以及 pPEP100-gH(HSV-l 糖蛋白表汰质粒)
是用于表达HSV-1 的 gB、gD、gL、以及 gH 的质粒。从 Northwestern University 获得(Pertel, P. E.等 Virology 279，313-24)。
pT7EMCLuc
用于定量融合效率。是编码T7RNA聚合酶的pCAGT7以及T7启动子调控下具有萤火虫突光素酶(firefly luciferase)基因的质粒(Okuma, K.等 Virology 254,235-44·)。
dSSSP-NMHC-IIA、dSSSP-NMHC-IIB 以及 DSSSP-Cre
为了产生表达针对NMHC-IIA、NMHC-IIB的shRNA的稳定的细胞系(cell line)，通过以下方法构建了 pSSSP-NMHC-IIA以及pSSS-NMHC-IIB。
将编码针对NMHC-IIA的shRNA的DNA (序列号5)克隆到pmU6的BbsI位点以及EcoRI位点。将获得的质粒的BamHI-Ec0RI片段(fragment)(包含U6启动子以及编码针对NMHC-IIA的shRNA的序列)克隆到pSSSP的BamHI以及EcoRI位点，获得了 pSSSP-NMHC-IIA。pSSSP是包含嘌呤霉素抗性基因的逆转录病毒载体pMX的衍生载体。
pSSSP-NMHC-IIB也通过与pSSSP-NMHC-IIA同样的方法制备。但是，作为编码针对 NMHC-IIB的shRNA的DNA，使用了由记载于序列号11中的碱基序列构成的DNA。
作为对照，根据(Haraguchi，T.，等FEBS Lett 581，4949_54·)准备了编码针对 Cre 重组酶的 shRNA 的 pSSSP-Cre。
[细胞以及培养基]
在实施例中所使用的细胞如下。
CHO-hPILR α细胞以及CHO-hNectin-l细胞分别为稳定表达人PILR α或人 Nectin-I 的转染子(Arii, J.等 J Virol. 83，4520-7.)。
HL60/NMHC-IIA 细胞以及 HL60/puro 细胞是用包含 pMXs-NMHC-IIA 或者 pMxs-puro的重组逆转录病毒转染的具有嘌呤霉素抗性的HL60细胞。具体而言，用 pMxs-NMHC-I IA-puro或者pMxs-puro与pMDG共转染plat-GP细胞。两天后，回收上清。 向HL60细胞感染包含逆转录病毒的转染plat-GP细胞的上清，由此进行转导，在维持液 (maintenance media)中加入O. 5yg/ml的嘌呤霉素，选择转染的细胞。
IC21/NMHC-IIB细胞以及IC21/puro细胞是用包含Flag-MYHlO表达载体或者pMxs-puro的重组逆转录病毒转染的具有嘌呤霉素抗性的IC21细胞。具体而言,用 Flag-MYHlO表达载体或者pMxs-puro转染IC21细胞，两天后，在含有O. 25 μ g/ml的嘌呤霉素(puromycin)的维持液中培养,选择转染的细胞。
病毒向各种Vero细胞、CHO细胞、HL60细胞、IC21细胞、HEL细胞的感染中，使用了 199培养基、Ham F-12培养基、加入1% FCS的RPMI1640培养基、加入1% FCS的199培养基。
[抗体]
实施例中所使用的抗体如下。
针对gB (1105)、Flag (M2)以及Myc(PL14)的小鼠单克隆抗体分别从Goodwin Institute公司、Sigma公司以及MBL公司购入。
针对NMHC-IIA的C末端的兔多克隆抗体从Sigma公司购入。该抗体将NMHC-IIA 的C末端的11氨基酸(序列号6)作为表位识别。
实施例4中所使用的针对NMHC-IIA的C末端的兔多克隆抗体(抗NMHC-IIA血清):用使上述的pGEX-NMHC-IIArod在E. coli中表达的GST-NMHC-IIArod，对兔进行了免疫，并根据通常的方案(protocol) (MBL公司)做了纯化。将免疫的兔的血清作为抗 NMHC-IIArod多克隆抗体使用。从MBL公司购入了成为对照的兔血清。
针对NMHC-IIB的C末端片段的兔多克隆抗体从Sigma公司购入。该抗体将 NMHC-IIB的C末端(第1965位到1976位)的12氨基酸(序列号12)作为表位识别。
针对NMHC-IIA以及NMHC-IIB的C末端的小鼠多克隆抗体用GST-NMHC-IIArod, GST-NMHC-IIBrod对小鼠进行了免疫，将免疫的小鼠血清分别作为抗NMHC-IIArod小鼠血清、MNHC-IIBrod小鼠血清使用。
抗磷酸化RLC抗体以及抗RLC抗体从Cell signaling Technology公司购入。
实施例I :与姐结合的新型HSV侵入受体的研究
<小鼠胚胎成纤维细胞(MEF细胞)中的侵入受体的研究>
向MEF细胞或IC21细胞(小鼠巨噬细胞样细胞)，在4°C下，感染YK711两个小时，然后将细胞转移到37°C，两分钟后，进行了回收。在包含2mM的DTSSP(Piers公司)的磷酸缓冲生理盐水(PBS)中，在4°C下，处理了两小时，然后溶解在RIPA缓冲液(1%ΝΡ-40， O. I %脱氧胆酸钠(Sodium Deoxycholat), O. I % SDS, 150mM NaCl, IOmM Tris-HCl [ρΗ7· 4]， ImM EDTA)中。
将离心分离后获得的上清液提供到使用了抗myc单克隆抗体(MBL公司)的第一免疫沉淀中，将免疫沉淀物与AcTEV蛋白酶(Invitrogen公司)进行反应。并且，将上述上清液提供到使用了抗Flag单克隆抗体(Sigma公司)的第二免疫沉淀中，将免疫沉淀物在变性凝胶中通过电泳进行分离，并通过银染可视化。
据此，在称为成纤维细胞的、在机体内广为分布的细胞中，能够检测出与gB结合的蛋白。
将结果示出在图1A。
接着，截出只在MEF细胞观察到的条带(箭头)，在凝胶中用胰蛋白酶进行了消化， 供于质谱分析。质谱分析结 果，一个条带鉴定为NMHC-IIA。
〈NMHC-I IA 和 NMHC-IIB 的表达 >
在Vero细胞以及Cos-I细胞中，分别用抗NMHC-IIA抗体、抗NMHC-IIB抗体检测 NMHC-IIA以及具有与NMHC-IIA类似功能的NMHC-IIB的表达。结果示出在图16A。虽然在 Vero细胞中两个均表达，但在Cos-I细胞中只表达NMHC-IIB。
<免疫沉淀>
为了找到除了 PILR和MAG以外的HSV的侵入受体，使用了将使用不具有膜通透性的交联剂的串联亲和纯化法与使用质谱分析法的蛋白质组学技术结合的方法(Oyama， Μ.等 Mol Cell Proteomics 8,226-31·)。具体方法如下。
向￥61*0细胞，在41下，感染了￥1(711、￥1(712或肥￥-1$)两小时。将细胞转移到 37°C,两分钟后回收并用PBS清洗,溶解于包含蛋白酶抑制剂混合物(Protease Inhibitor Cocktail)的 TNE 缓冲液(1% NP-40,150mM NaCl, IOmM Tris-HCl [pH7. 8], ImM EDTA)中。 将离心分离后的上清与琼脂糖蛋白A在4°C下温育30分钟，进行净化。短时间离心分离后， 使上清与抗Flag抗体或抗gB抗体在4°C下反应2小时。接着，加入琼脂糖蛋白A,旋转的同时在4°C下再反应I小时。免疫沉淀物通过短时间离心分离而回收，用TNE缓冲液清洗干净后，通过使用了抗NMHC-IIA抗体的免疫印迹进行分析。
结果示出在图IB中。
感染了表达MEF-gB的YK711或者野生型HSV-1 (F)的Vero细胞的细胞溶解物中， NMHC-IIA与MEF-gB或野生型gB —同发生了沉淀。
并且，用Cos-I细胞代替Vero细胞而进行了同样的实验，最后通过使用了抗 NMHC-IIB抗体的免疫印迹进行了分析，其结果示出在图16B以及C。图16B为感染了 YK711 或YK712的结果，图16C为感染了野生型HSV-1 (F)的结果。
与NMHC-IIA时的结果同样地，感染了表达MEF-gB的YK711或者野生型HSV-1 (F) 的Cos-I细胞的溶解物中，NMHC-IIB与MEF-gB或野生型gB —同发生了沉淀，确认出 NMHC-IIB也与gB结合的事实。
<野生型HSV-1 (F)、gB缺失病毒或回复突变病毒与可溶性NMHC-IIA的C末端片段的结合>
使NMHC-IIArod-Ig产生在Cos-I细胞。向293T细胞感染HSV-1，12小时后，回收感染细胞(A)。并且，向其他293T细胞使用Iipofectamine而导入HSV-I糖蛋白表达质粒， 18小时后回收细胞(B)。使细胞与NMHC-IIArod-Ig在冰上反应30分钟。将细胞用加入有 2% FCS的PBS清洗，然后与二抗(PE标记anti-human IgG抗体)在冰上反应30分钟。将细胞再次用加入有2% FCS的PBS清洗,通过流式细胞仪(flow cytometer)进行了分析。
(A)以及⑶结果分别示出在图2A以及B。
gB 缺失病毒感染细胞(YK701 (dgB)-感染)没有被 NMHC-IIArod-Ig(NMHC-IIA 的 C末端片段与Ig的融合蛋白)识别出(图2A的中间图)。另一方面，野生型HSV-1 (F)感染细胞(F-感染)以及表达野生型gB的gB缺失病毒的回复突变病毒感染细胞(YK702 (回复)-感染)被NMHC-IIArod-Ig识别(图2A的上面图以及下面图)。
与该结果一致地，HSV-I的gB转染子被NMHC-IIArod-Ig识别，但是HSV-I的gD转染子没有被识别(图2B)。
从这些结果，得到了如下启示NMHC-IIA的C末端区域与HSV-I的gB相互作用。
接着，使NMHCIMrod-Ig产生在Cos-Ι细胞，向293T细胞使用Iipofectamine而导入HSV-I糖蛋白表达质粒，对于NMHC-IIB，进行了与上述(B)同样的实验。结果示出在图 17A以及B。在表面表达gB的细胞被NMHC-IIBrod-Ig染色，得到了如下启示=NMHC-IIB其 C末端区域也与HSV-I的gB相互作用。
实施例2 HSV-1停入时的NMHC-IIA的细胞内的移动
在4°C下向Vero细胞感染野生型HSV-1 (F)两小时，转移到37°C，然后O分钟后、 2分钟后以及15分钟后，通过使用了抗NMHC-IIA抗体的免疫荧光法(使用FITC标记的二抗)，分析了 NMHC-IIA的细胞内的定位。
模拟(Mock)感染的细胞和在4°C下感染了 HSV-I(F)的细胞(O分钟后)中， NMHC-IIA分布在整个细胞质中。如果HSV-I开始侵入(转移到37°C而经过2分钟后以及 15分钟后)，则NMHC-IIA在细胞膜附近的浓度有意地提高(图3A)。
并且，使模拟感染的细胞、或在4°C下感染野生型HSV-1 (F)两小时后转移到37°C 并经过15分钟的细胞的细胞表面蛋白生物素化,进行利用亲和素珠(avidin-beads)的免疫沉淀，接着进行利用抗NMHC-IIA抗体的免疫印迹。
更加具体而言，向Vero细胞在4°C下感染MOI = 5的HSV-1 (F)两小时。将细胞转移到37 °C，经过2分钟后以及15分钟后，用冰冷的BPS清洗4次，使用可裂解的 sulfo-NHS-SS-Biotin (Pierce公司)进行了生物素化两次，每次15分钟。
用加入O. 2 % BSA的冰冷的DMEM清洗I次，用加入10 % FCS的PBS清洗2次，然后将细胞提供于模拟处理，或者用新准备的还原溶液(15. 5mg谷胱甘肽/ml、75mM NaCl, O. 3% Na0H、10%小牛血清)在4°C下对细胞处理20分钟，进行2次，以从细胞表面的蛋白去除残留的生物素标记。
用加入O. 2 % BSA的DMEM清洗2次，用加入I % BSA的5mg/ml碘乙酰胺 (iodoacetamide) (PBS中)，抑制(quench)自由SH基，然后回收细胞，在包含蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液中进行溶解。用亲和素珠进行沉淀，用NMHC-IIA抗体进行免疫印迹。
结果示出在图3B。
确认出，正常Vero细胞的细胞表面表达有NMHC-IIA，以及伴随病毒的侵入而 NMHC-IIA的在细胞表面的量上升。
进一步地，感染了表达MEF-gB的HSV-1 (YK711)的细胞中，与抗Flag抗体一同沉淀的NMHC-IIA被生物素化，但是感染了表达MEF-gH的HSV-1 (YK712)的细胞中，没有检测出具有与被生物素化的NMHC-IIA相同的分子量的蛋白(图3C)
从这些结果表明，因HSV-I的侵入，NMHC-IIA的在细胞表面的浓度增大，·细胞表面的NMHC-IIA与gB相互作用。
从HSV-I侵入到15分钟以内细胞表面上的表达上升这一 NMHC-IIA的性质，是迄今为止被报道的HSV-I的侵入受体中未发现的NMHC-IIA特有的性质。该性质与HSV-I向细胞附着到侵入为止存在10分钟到15分钟的时间间隔(time lag)这一过去的报道相符， 用于说明该现象。这种时间间隔在牛痘病毒或流感病毒中没有被发现。
实施例3-1 :某于NMHC-IIA的细朐内定位的控制的HSV-I感染的抑制
NM-IIA的细胞内定位通过作为NM-IIA的亚型的调节轻链(Regulatory light chain,RLC)被肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)磷酸化而被部分控制。
因此，研究了作为MLCK的特异性抑制剂的ML-7对NMHC-IIA的重构引起的影响。 具体而言，将Vero细胞用各种浓度的ML-7进行30分钟前处理，在与上述浓度相同的浓度的ML-7存在下，在24孔板中，将HSV-IGFP以MOI = I接种。去除接种材料，然后向细胞给予包含与上述浓度相同的浓度的ML-7的培养基。
感染5小时、6小时或12小时后，通过荧光显微镜(Olympus 1X71)观察细胞，或者使用 Cell Quest 软件(Becton Dickinson)用 FACSCalibur 进行分析。
并且，使用流感病毒进行了同样的实验。
结果示出在图4。
病毒侵入时的、细胞膜附近的NMHC-IIA的浓度的上升，因ML-7而被抑制(图4B)。
HSV-IGFP的感染也被ML-7而得到剂量依赖性抑制(图4A)，但是ML-7不影响流感病毒的感染(图4C)。
从这些结果表明，有效的HSV-I感染，需要包括在HSV-I侵入时NMHC-IIA移动到细胞表面的NM-IIA的控制。
可以认为NMHC-IIA的移动，是根据病毒刚侵入后引起的信号通路的调节而控制的。HSV-I的侵入引起细胞膜以及细胞内的钙浓度的急剧上升(CheShenk0，N.等Mol Biol Cell 18，3119-30)，这引起由MLCK介导的NM-II RLC的磷酸化。
使NM-II RLC磷酸化而控制NM-II的定位的MLCK的特异性抑制剂抑制病毒侵入时的NMHC-IIA的移动以及HSV-I的感染，这一这次表明的事实，对以下假说提供依据基于 HSV-I侵入的钙信号通道的活化，引起NMHC-IIA的移动，介导基于与gB的相互作用的病毒侵入。
接着，通过与实施例2同样的方法，向用ML-7进行前处理的Cos-I细胞、或者没有进行前处理的Cos-I细胞感染野生型HSV-1 (F)，活化细胞表面的蛋白，进行利用亲和素珠的免疫沉淀，然后进行使用抗NMHC-IIB抗体的免疫印迹。
结果示出在图18A。如果感染HSV-I，则细胞膜附近的NMHC-IIB浓度上升，但是用 ML-7处理，该浓度显著降低。
并且，与实施例3同样地，将Cos-I细胞用各种浓度的ML-7进行30分钟前处理， 在与上述浓度相同的浓度的ML-7存在下，在24孔板中，将HSV-IGFP以MOI = I接种，去除接种材料，然后向细胞给予包含与上述浓度相同的浓度的ML-7的培养基。进一步地，利用流感病毒而代替HSV-1GFP，进行了同样的实验。
结果示出在图18B以及C。如图18B所示，HSV-I的感染被ML-7而得到剂量依赖性抑制，但是流感病毒的感染没有受到ML-7的影响(图18C)。在只表达有NMHC-IIB的Cos-I 细胞中，也观察到了这种现象，从这一事实可以表明，NMHC-IIB也在HSV-I侵入时移动到细胞表面，作为用于HSV-I侵入的受体发挥作用。
实施例3-2 :某于NMHC-IIA的细朐内定位的控制的HSV-2感染的抑制
对于HSV-2GFP，使用Vero细胞进行了与实施例3_1同样的实验。
结果示出在图22。HSV-2GFP的感染也被ML-7而得到剂量依赖性抑制。
聿施例4-1 :某于杭NMHC-IIA杭体的HSV-I感染的抑制
对于Vero 细胞、CHO-hNectin-Ι 细胞、CHO-hPILR α 细胞以及 HL60/NMHC-·IIA 细胞用各种浓度的抗NMHC-IIA血清或对照血清进行了 30分钟前处理。
在24孔板中，分别向Vero细胞、CHO-hNectin-Ι细胞以MOI = I接种了 HSV-1GFP。 进行了 I小时病毒附着后，去除接种材料，向细胞给予适宜的培养基。
并且，在24 孔板中，向 CHO-hPILR α 细胞以 MOI = I 接种 HSV-1GFP，在 32°C、IlOOg 条件下，进行了离心分离I小时。进行了 I小时病毒附着后，去除接种材料，清洗细胞，给予适宜的培养基。
感染5小时、6小时或12小时后，通过荧光显微镜(Olympus 1X71)观察细胞，或者使用 Cell Quest 软件(Becton Dickinson)用 FACSCalibur 进行分析。
结果示出在图5。
抗NMHC-IIA 血清抑制了向 CHO-hNectin-l 细胞的 HSV-1 的感染。CHO-hNectin-l 细胞，是对原本对于HSV-I感染具有抗性的CH0-K1细胞，通过转导gD受体的nectin-Ι，由此变成HSV-I敏感细胞的细胞。相反地，抗NMHC-IIA血清不抑制向CHO-hPILR α细胞的 HSV-I的感染。这认为是，CH0-K1细胞通过过表达另外一个gB受体的PILRa，由此获得了对于HSV-I充分的敏感性而引起的结果。
CHO-hNectin-l 以及CHO-hPILRa 细胞均内源性表达NMHC-IIA。在该CHO-hPILRa 细胞中的竞争性结果，进一步支持NMHC-IIA为对于HSV-I发挥作用的gB受体的这一结论。
实施例4-2 :基于抗NMHC-IIA抗体以及抗MNHC-IIB抗体的HSV-I感染的抑制
根据实施例4-1的方法，作为抗体，使用抗NMHC-IIArod小鼠血清以及抗NMHC-IIB 小鼠血清而进行了实验。使用Vero细胞,抗体稀释为I : 20。
结果示出在图23。抗NMHC-IIArod小鼠血清以及抗NMHC-IIBrod小鼠血清均抑制 HSV-I的感染。
实施例4-3 :某于杭NMHC-IIA杭体以及杭MNHC-IIB杭体的HSV-2感染的抑制
根据实施例4-1的方法，作为病毒而使用HSV-2GFP，作为抗体，使用抗 NMHC-IIArod小鼠血清以及抗NMHC-IIB小鼠血清而进行了实验。使用Vero细胞，抗体稀释为 I : 20。
结果示出在图24。抗NMHC-IIArod小鼠血清以及抗NMHC-IIBrod小鼠血清均抑制 HSV-2的感染。
实施例5-1 :某于NMHC-IIA或者NMHC-IIB的敲减(knockdown)的HSV-1感染的抑制
根据RNAi法敲减(knockdown)NMHC-IIA的表达，研究了对于病毒感染引起的影响。
具体而言，将Vero细胞用pSSSP-NMHC-IIA或pSSSP_Cre进行转染，在维持液中加入2. 5 μ g/ml嘌呤霉素而选择转染的细胞。将用PSSSP-Cre转染的嘌呤霉素抗性细胞称为 Vero-ShCre0分别分离用pSSSP-NMHC-IIA转染的菌落群，通过基于抗NMHC-IIA抗体的免疫印迹，筛选了稳定表达针对NMHC-IIA的shRNA的细胞。
在24 孔板中，向 Vero-shCre 或 Vero-NMHC-IIA 细胞以 MOI = I 接种了 HSV-1GFP 或流感病毒。病毒附着I小时后，去除接种材料，向细胞给予适宜的培养基。
感染6小时后(HSV-I)或7小时后(流感病毒)，使用Cell Quest软件(Becton Dickinson)用 FACSCalibur 进行分析。
结果示出在图6A、B。
HSV-IGFP的敏感性，在敲减了 NMHC-IIA的细胞(Vero-shNMHC-IIA)中，与表达无关的shRNA的细胞(Vero-shCre)相比低下(图6A)。另一方面，NMHC-IIA的敲减，对流感病毒的感染几乎没有产生影响(图6B)。
实施例4以及5的结果表示，在内源性表达NMHC-IIA的细胞中，HSV-I将NMHC-IIA 作为功能性受体而利用。
并且，Vero细胞内源性表达作为NMHCII-A以及gD受体的Nectin-1 (Milne， R. S.等 Virology 281, 315-328(2001).)
已知Vero细胞上的gD受体也介导HSV-I感染，并且在这里已经证实了向Vero细胞的HSV-I感染需要gB与NMHC-IIA结合，因此表明HSV-I向Vero细胞的侵入需要针对gD 以及gB这两者的受体的假说是正确的。
接着，通过RNAi法敲减(knockdown) 了在Cos-Ι细胞中的NMHC-IIB的表达。 具体而言，将Cos-I细胞用pSSSP-NMHC-IIB或pSSSP-Cre进行转染，在维持液中加入2.5 μ g/ml嘌呤霉素而选择转染的细胞。将用pSSSP-Cre转染的嘌呤霉素抗性细胞称为 Cos-1-shControlo分别分离用pSSSP-NMHC-IIB转染的菌落群,通过基于抗NMHC-IIB抗体的免疫印迹，筛选了稳定表达针对NMHC-IIB的shRNA的细胞。
在24 孔板中，向 Cos-1-shControl (图中 sh 对照)或 Cos-I-NMHC-IIB 细胞(图中shNMHC-IIB)以MOI = I接种了 HSV-IGFP或流感病毒。病毒附着I小时后，去除接种材料，向细胞给予适宜的培养基。
感染6小时后(HSV-I)或7小时后(流感病毒)，使用Cell Quest软件(Becton Dickinson)用 FACSCalibur 进行分析。
结果示出在图19A C。因NMHC-IIB的敲减(图19A)而导致HSV-1的感染低下 (图19B)，但流感病毒的感染没有发生变化。
实施例5-2 :某于NMHC-IIA或NMHC-IIB的敲减的HSV-2感染的抑制
根据实施例5-1的方法，向敲减了 NMHC-IIA表达的Vero细胞以MOI = I接种了 HSV-2GFP。在对照中使用了 Vero-shCre。
结果示出在图27。确认出敲减了 NMHC-IIA的细胞中HSV-2的感染得到了抑制。
并且，同样地，根据实施例5-1的方法，向敲减了 NMHC-IIB表达的Cos-Ι细胞以 MOI = I 接种了 HSV-2GFP。
结果示出在图28。确认出敲减了 NMHC-IIB的细胞中HSV-2的感染得到了抑制。
实施例6 :膜融合测定
对于包括HSV-I的包膜病毒而言，为了病毒感染，需要包膜与宿主细胞的细胞膜的融合。为了研究与HSV-I的膜融合中NMHC-IIA的作用，进行了膜融合测定。
具体而言，在24 孔板中，向 Vero 细胞转染了 pEP98_gB、pPEP99_gD、pPEP101-gL、 pPEP100-gH(6C)或者pMD (VSV-G表达载体)、以及pCAGT7，将转染子作为效应细胞使用。
并且，在24 孔板中，对 Vero-shCre 或 Vero-shNMHC-IIA 1-3 细胞用 pT7EMCLuc 进行转染，将转染子作为靶向细胞使用。
作为内部对照，用编码由CMV启动子调控的肾荧光素酶(Renilla luciferase)基因的pRL-CMV (Promega公司)进行了共转染。
转染6小时后，用O. 04% EDTA (PBS中)分离效应细胞，用维持液清洗一次，与靶向细胞共培养18小时 。然后,通过双萤光素酶报告基因检测系统(Dual-Luciferase Reporter Assay System, Promega公司)和光度计(luminometer, Promega公司)分别对萤火虫突光素酶以及肾荧光素酶活性进行定量。萤火虫荧光素酶活性通过肾荧光素酶标准化。
结果示出在图6C、D。
当将敲减了 NMHC-IIA的Vero细胞与暂时表达HSV_lgB、gD、gH、以及gL的Vero 细胞共培养时，与表达对照shRNA的Vero细胞和表达HSV-I的糖蛋白的Vero细胞共培养时相比，膜融合明显减少(图6C)。
可对照地，NMHC-IIA的敲减对于VSV包膜G蛋白介导性的膜融合，几乎没有产生影响(图6D)。这些结果表明，NMHC-IIA是在介导与HSV-I包膜的G蛋白结合的有效膜融合中所必需的。并且,可以得到如下启示gB与NMHC-IIA的相互作用参与HSV-I感染中的膜融合。
同样地，为了研究与HSV-I的膜融合中NMHC-IIB的作用，进行了膜融合测定。
具体而言，在24 孔板中，向 Cos-I 细胞转染了 pEP98-gB、pPEP99-gD、pPEP101_gL、 pPEP100-gH(6C)或者pMD (VSV-G表达载体)、以及pCAGT7，将转染子作为效应细胞使用。
并且，在24 孔板中，对 Cos-1-shControl 或 Cos-l-shNMHC-IIB 1-3 细胞用 pT7EMCLuc进行转染，将转染子作为靶向细胞使用。
作为内部对照，用编码由CMV启动子调控的肾荧光素酶基因的pRL-CMV(Promega 公司)进行了共转染。
转染6小时后，用O. 04% EDTA (PBS中)分离效应细胞，用维持液清洗一次，与靶向细胞共培养18小时。此后,通过双萤光素酶报告基因检测系统(Dual-Luciferase ReporterAssay System, Promega公司)和光度计(luminometer, Promega公司)分别对萤火虫突光素酶以及肾荧光素酶活性进行定量。萤火虫荧光素酶活性通过肾荧光素酶标准化。
结果示出在图19D、E。当将敲减了 NMHC-IIB的Cos-I细胞与共表达HSV_lgB、gD、 gH、以及gL的Cos-I细胞共培养时，与对照相比，膜融合显著减少(图19D)。另一方面， NMHC-IIB的敲减对于VSV G依赖性细胞融合没有产生影响。这些结果表明，NMHC-IIB在介导与HSV-I包膜的G蛋白结合的有效膜融合中也是必需的。并且，可以得到如下启示gB与 NMHC-IIB的相互作用参与HSV-I感染中的膜融合。
实施例7-1 :对于HSV-I向细朐停入的NMHC-IIA的参与的确认
建立高水平且稳定表达NMHC-IIA的HL60细胞(HL60/NMHC-IIA)。已报道有，人前髓细胞(promyelocyte)株 HL60 细胞低水平表达 NMHC-IIA(Toothaker, L. Ε·等 Blood 78, 1826-1833 (1991).)，并且对于 HSV-I 的感染较具有耐性(Pientong，C.等· Virology 170， 468-476(1989).)。
在24 孔板中，向 HL60/NMHC-IIA 细胞以 MOI = I 接种 HSV-1GFP，在 32°C、IlOOg 条件下，离心分离I小时。进行病毒附着I小时后，去除接种材料，清洗细胞，给予适宜的培养基。
感染5小时、6小时或者12小时后，用荧光显微镜(Olympus 1X71)观察细胞，或者使用 Cell Quest 软件(Becton Dickinson)用 FACSCalibur 进行分析。
结果示出在图7。
图7A表示通过免疫印迹法确认HL60/NMHC-IIA中的NMHC-IIA过表达的结果。
HL60细胞中的NMHC-IIA过表达导致感染HSV-IGFP的HL60/NMHC-IIA细胞的比例与对照的HL60/puix)细胞相比显著增加(图7B以及C)。
向HL60/NMHC-IIA细胞的HSV-IGFP的感染被抗NMHC-IIA血清而得到剂量依赖性抑制，而对照血清对HSV-IGFP的向同样细胞的感染仅产生微小影响(图7D)。
进一步地，NMHC-IIA的过表达还增强对猪α疱疹病毒的敏感性，GFP表达伪狂犬病病毒(PRV GFP)的感染、以及HL60/NMHC-IIA中的PRV GFP的感染因抗NMHC-IIA血清而得到特异性抑制(图7Ε)。
这些结果表明，NMHC-IIA介导HSV-I感染，并且可以得到如下启示由NMHC-IIA 介导的病毒的向细胞的侵入，在其他α疱疹病毒中也被保留。
实施例7-2 :对于HSV-I向细胞停入的NMHC-IIB的参与的确认
在原本低水平表达NMHC-IIB的IC21细胞中，使NMHC-IIB细胞过表达(图20Α)。 向该IC21/NMHC-IIB细胞通过与HL60/NMHC-IIA同样的方法接种HSV-1GFP，进行观察。
结果示出在图20Β。在IC21细胞中的NMHC-IIB的过表达导致感染HSV-IGFP的细胞的比例与对照(IC21/puro细胞)相比显著增加(图20B以及C)。这些结果表明，NMHC-IIB 也介导HSV-I感染。
实施例7-3 :对于HSV-2向细胞停入的NMHC-IIA的参与的确认
HSV-2GFP作为病毒，进行了与实施例7-1同样的实验。结果示出在图29。NMHC-IIA 的过表达导致感染HSV-2GFP的细胞的比例增加。该结果表明，NMHC-IIA也介导HSV-2感染。
实施例7-4 :对于HSV-2向细胞停入的NMHC-IIB的参与的确认
HSV-2GFP作为病毒，进行了与实施例7_3同样的实验。结果示出在图30。NMHC-IIB 的过表达导致感染HSV-2GFP的细胞的比例增加。该结果表明，NMHC-IIB也介导HSV-2感染。
实施例8:与阿昔洛韦(aciclovi^ACC)的作用点的比较
将24孔板的Vero细胞分别用抗NMHC-IIA血清或对照血清、ML_7 (20 μ Μ)、 ACC (40 μ Μ)处理30分钟，以MOI = I接种HSV-1GFP。I小时后去除病毒液，换成维持液。 ML-7以及ACC处理细胞分别在加入有药剂的维持液中培养。感染6小时后回收细胞，用流式细胞仪(fIowcytometer)分析了突光强度。图中示出的均是相对突光强度。
虽然向Vero细胞的HSV侵入没有因HSV复制抑制剂的ACC而被抑制(图9A)，但是被MLCK抑制剂ML-7 (图9B)或NMHC-IIA抗血清(图9C)而抑制。虽然ACC是已被广为使用的抗疱疹病毒药，但是可以说，以NMHC-IIA为靶标的药剂、抗体具有与ACC完全不同的作用点。
实施例9 :某于HSV-I感染的RLC的磷酸化
将Vero细胞用20 μ M的ML-7进行模拟(mock)处理或处理30分钟，在ML-7存在下或不存在下、以MOI = 50、在4°C下、模拟(mock)暴露或暴露在野生型HSV-1，2小时。转移到37°C经过15分钟后，通过使用抗磷酸化RLC抗体或抗RLC抗体的免疫印迹，测定了 RLC 的磷酸化。
结果示出在图10。确认出，因HSV-I的感染而导致RLC的磷酸化被增进，并且该增进因MLCK的选择性抑制剂的ML-7而被抑制。
实施例10 :基于钙螯合物的HSV-I感染的抑制
将Vero细胞用50 μ M的BAPTA-AM进行模拟(mock)处理或处理30分钟，在ML_7 存在下或不存在下、以MOI = 50、在4°C下、模拟(mock)暴露或暴露在野生型HSV-1，2小时。 转移到37°C经过15分钟后，通过使用抗NMHC-IIA抗体的免疫荧光法进行分析。
结果示出在图11A。BAPTA-AM是MLCK活化所必需的Ca2+螯合物。确认出，在 BAPTA-AM的存在下，即使HSV-I感染NMHC-IIA也不转移到细胞膜附近。
并且，将Vero细胞用50 μ M的BAPTA-AM进行模拟(mock)处理或处理30分钟，在 ML-7存在下或不存在下、以MOI = 50、在4°C下、模拟(mock)暴露或暴露在野生型HSV-I，2 小时。转移到37°C经过15分钟后，通过免疫印迹，测定了 RLC的表达以及磷酸化。
结果示出在图11B。确认出，在BAPTA-AM的存在下，RLC的表达量没有变化，但是基于HSV-I感染的RLC的磷酸化的增进得到了抑制。
接着，向Vero细胞在图示的浓度的BAPTA-AM的存在下或不存在下以MOI = I感染了 HSV-1GFP。从感染经过5小时后，通过流式细胞术测定了平均荧光强度(MFI)。数据表示平均值和标准误差(η = 3)。数据根据BAPTA-AM不存在下的测定值进行了标准化。
结果示出在图11C。MFI以BAPTA-AM的浓度依赖性地减少。这表明，如果MLCK的活性因钙螯合物而被抑制，则向细胞内侵入的HSV-I减少。
另一方面，向Vero细胞在50 μ M的BAPTA-AM的存在下或不存在下以MOI = I感染了流感病毒。从感染经过7小时后，通过流式细胞术测定了 MFI。数据表示平均值和标准误差(η = 3)。对BAPTA-AM不存在下的平均值，用100%相对MFI进行了标准化。
结果示出在图11D。确认出，相对MFI不受BAPTA-AM存在或不存在的影响，流感病毒的感染不被钙螯合物而抑制。
接着，用Cos-I细胞代替VeiO细胞，在各种浓度的BAPTA-AM的存在下或不存在下，以MOI = I感染了 HSV-1GFP。与Vero细胞时的同样的方法，测定了荧光强度。结果示出在图21A。MFI以BAPTA-AM的浓度依赖性地减少。这表明，如果MLCK的活性因钙螯合物而被抑制，则在仅表达NMHC-IIB的细胞中，也同样地向细胞内侵入的HSV-I减少。并且，代替HSV-I感染流感病毒时，没有观察到钙螯合物对感染引起的影响。
实施例11 :基于MLCK的显性负性突变体的HSV-I感染的抑制
将用空表达质粒(Vector)或MCLK的显性负性突变体的表达质粒(Dn-MLCK)转染的Vero细胞，在4°C下，模拟(mock)温育2小时，或者向野生型HSV-I以MOI = 50暴露2 小时。
接着转移到37°C，15分钟后，通过使用抗磷酸化RLC抗体或抗RLC抗体的免疫印迹测定了 RLC的表达以及磷酸化。结果示出在图12A。数据表示独立的3个实验的代表性例子。
空表达质粒(Vector)为pCI-neo,从Promega购入。显性负性突变体表达质粒使用了 J. Physiol 570 :219-235,2006 的质粒。
在用空表达质粒(Vector)转染的细胞中，因HSV-1的感染而增加了 RLC的磷酸化，但是通过显性负性突变体转染的细胞中，该增加得到了抑制。
图12B中表示从上述图12A的结果求出相对于全RLC蛋白量的磷酸化RLC蛋白质的相对量的结果。相对量是在通过空表达质粒(Vector)转染后模拟(mock)感染的细胞 (Mock+Vector)中的RLC的磷酸化量作为100,求出通过空表达质粒(Vector)或Dn-MLCK转染后感染了 HSV-I的细胞(分别为HSV-l+Vector、HSV-l+Dn-MLCK)中的RLC的磷酸化量的结果。数据表示平均值和标准误差(n = 3, two-tailed Student' s t-test (学生双尾t 检验))。在HSV-1+Vector中确认出，RLC的磷酸化显著增进，并且该磷酸化的增进因MCLK 的显性负性突变体而大体 上被抑制。
接着，向用空表达质粒(Vector)或Dn-MLCK转染的Vero细胞以MOI = I感染野生型HSV-IGFP (图12C)或者流感病毒(图12D)，从感染经过5或7小时后，分别通过流式细胞术进行分析，求出平均荧光强度(MFI)。数据表示平均值和标准误差(n = 3, two-tailed Student' s t-test) 感染空表达质粒(Vector)的细胞中的平均值根据100%相对MFI 进行标准化。
确认出，与向用空表达质粒(Vector)转染的细胞感染HSV-I时相比，用Dn-MLCK 转染的细胞中的HSV-I侵入为60%左右，显著抑制HSV-I的侵入。另一方面，感染流感病毒的情况下，当用Dn-MLCK转染时，反而增加流感病毒的侵入。
以上，实施例9 10的结果进一步表明，根据MLCK信号，控制NMHC-IIA的细胞内定位的变化或HSV感染，因此可以通过抑制该MLCK信号而抑制HSV-I的感染。
实施例12 :对于小鼠角膜感染樽型的MLCK抑制剂的效果(感染前给药)
用注射针头对ICR小鼠(雌性，5周龄)的角膜引起轻伤后，以10分钟间隔2次滴眼加入有20 μ M的ML-7的培养基或不包含ML-7的培养基。进一步地，10分钟温育后，以 5X IO5PFU/眼，接种HSV-1 (F)株，然后研究泪中的病毒效价、角膜炎症状、小鼠的生存。
结果示出在图13。对于病毒接种2天后的病毒效价(图13Α)、5天后的角膜炎症状(图13B)而言，进行ML-7处理的小鼠与未处理的小鼠相比较，均有意地低下(A ；p<0. 001， B ；p < O. 05)。进一步地，ML-7处理群中小鼠的生存率也有意地上升(图13C)。
这些结果表明，在生物机体内也发生HSV-I对NMHC-IIA的利用，同时启示以下的可能性诸如ML-7等与NMHC-IIA的控制有关的药剂，可以作为新的疱疹病毒治疗、预防药， 尤其作为预防药使用。
实施例13 :对于小鼠角膜感染模型的MLCK抑制剂(ML-7)的效果(感染同时给药)
用注射针头对分别为28只的ICR(雌性，5周龄)的角膜引起伤口后，同时滴眼加入有20 μ M的ML-7的培养基或不包含ML-7的培养基、以及在199培养基(Mediuml99)中稀释的5 X IO5HSV-I (F)，观察21天。
结果示出在图14。与图13相比，ML-7处理群中小鼠的生存率进一步有意地上升。
实施例14 :对于小鼠角膜感染模型的MLCK抑制剂(BAPTA-AM)的效果
用注射针头对分别为28只的ICR(雌性，5周龄) 的角膜引起伤口后，以10分钟间隔2次滴眼50 μ M的ΒΑΡΤΑ-ΑΜο进一步地，10分钟温育后，滴眼在199培养基(Mediuml99) 中稀释的5 X IO5HSV-I (F)，观察21天。模拟处理(Mock-treat)群使用了加入有O. 2% DMSO 的 199 培养基(O. 2% DMSOin Mediuml99)而代替 50 μ M 的 ΒΑΡΤΑ-ΑΜ。
结果示出在图15。BAPTA-AM处理群的生存率与模拟处理(Mock-treat)群相比有意地上升。该结果进一步表明，MLCK抑制剂作为疱疹病毒感染症的治疗、预防药而有用。
实施例15 :某于杭NMHC-IIA杭体以及杭MNHC-IIB杭体的人类巨细朐病毒(HCMV) 感染的抑制
HEL细胞用抗NMHC-IIArod小鼠血清、抗NMHC-IIBrod小鼠血清以及对照血清前处理30分钟，在抗体存在下以MOI = O. I感染HCMV ADsubU21. 5。通过荧光显微镜、FACS分析24、46、72小时后的GFP表达。
将从病毒感染经过48小时后的GFP表达细胞的荧光显微镜照示出在图25。并且， 将通过FACS分析从病毒感染经过24、46、72小时后的GFP表达细胞的结果示出在图26。
抗NMHC-IIA抗体以及抗NMHC-IIB抗体抑制HCMV感染的事实得到明确。从这一事实得到以下启示=NMHC-IIA以及NMHC-IIB介导的感染方法，不仅限于诸如HSV-1、HSV_2 以及PRV等属于α疱疫病毒亚科的病毒,在属于其他亚科的疱疫病毒中，也是广为共同适用的方法。
序列表自由内容
序列号1是NMHC-IIA的C末端区域(第1665位 1960位)的氨基酸序列。
序列号'2是针对NMHC-IIA的siRNA的靶序列的一种例子。
序列号3是针对NMHC-IIA的siRNA的一种例子的单链。
序列号4是针对NMHC-IIA的siRNA的一种例子的单链。
序列号5是编码针对NMHD-IIA的shRNA的一种例子的DNA。
序列号6是实施例中所使用的针对NMHC-IIA的C末端的兔多克隆抗体所识别的表位。
序列号7是NMHC-IIB的C末端区域(第1672位 1976位)的氨基酸序列。
序列号8是针对NMHC-IIB的siRNA的靶序列的一种例子。
序列号9是针对NMHC-IIB的siRNA的一种例子的单链。
序列号10是针对NMHC-IIB的siRNA的一种例子的单链。
序列号11是编码针对NMHD-IIB的shRNA的一种例子的DNA。
序列号12是实施例中所使用的针对NMHC-IIB的C末端的兔多 克隆抗体所识别的表位。
权利要求
1.一种用于预防或治疗疱疹病毒感染症的医药组合物，该医药组合物作为有效成分而包含抑制糖蛋白B与非肌肉肌球蛋白重链IIA或者非肌肉肌球蛋白重链IIB结合的物质。
2.如权利要求I所述的医药组合物，所述的抑制糖蛋白B与非肌肉肌球蛋白重链IIA 或者非肌肉肌球蛋白重链IIB结合的物质，是肌球蛋白三磷酸腺苷酶活性抑制剂或者肌球蛋白轻链激酶抑制剂。
3.如权利要求2所述的医药组合物，所述肌球蛋白轻链激酶抑制剂是ML-7。
4.如权利要求2所述的医药组合物，所述肌球蛋白轻链激酶抑制剂是肌球蛋白轻链激酶途径抑制剂。
5.如权利要求4所述的医药组合物，所述肌球蛋白轻链激酶途径抑制剂是从由钙调蛋白拮抗剂、钙螯合物以及钙拮抗剂组成的组中选择的。
6.如权利要求2所述的医药组合物，所述肌球蛋白轻链激酶抑制剂是肌球蛋白轻链激酶的显性负性突变体。
7.如权利要求I所述的医药组合物，所述的抑制糖蛋白B与非肌肉肌球蛋白重链IIA 或者非肌肉肌球蛋白重链IIB结合的物质，是针对非肌肉肌球蛋白重链IIA或者非肌肉肌球蛋白重链IIB的抗体。
8.如权利要求7所述的医药组合物，所述抗体与由序列号为I或7中所记载的氨基酸序列构成的肽结合。
9.如权利要求7所述的医药组合物，所述抗体与非肌肉肌球蛋白重链IIA或者非肌肉肌球蛋白重链IIB中的、当疱疹病毒感染时露出到细胞外的区域结合。
10.如权利要求I所述的医药组合物，所述的抑制糖蛋白B与非肌肉肌球蛋白重链IIA 或者非肌肉肌球蛋白重链IIB结合的物质，是抑制非肌肉肌球蛋白重链IIA或者非肌肉肌球蛋白重链IIB表达的物质。
11.如权利要求10所述的医药组合物，所述的抑制非肌肉肌球蛋白重链IIA或者非肌肉肌球蛋白重链IIB表达的物质，是从由具有RNAi效应的双链核酸、反义核酸、核酶以及编码这些的核酸组成的组中选择的。
12.如权利要求I所述的医药组合物，所述的抑制糖蛋白B与非肌肉肌球蛋白重链IIA 或者非肌肉肌球蛋白重链IIB结合的物质，是可溶性非肌肉肌球蛋白重链IIA或者可溶性非肌肉肌球蛋白重链IIB。
13.如权利要求I至12中任意一项所述的医药组合物，所述疱疹病毒是单纯疱疹病毒、 猪水疱疹病毒I型或者巨细胞病毒。
14.一种双链RNA，由序列号为3以及序列号为4中所记载的碱基序列构成，对于非肌肉肌球蛋白重链IIA具有RNAi效应。
15.—种核酸,包含由序列号为5中所记载的碱基序列构成的DNA,编码对于非肌肉肌球蛋白重链IIA具有RNAi效应的双链RNA。
16.一种双链RNA，由序列号为9以及序列号为10中所记载的碱基序列构成，对于非肌肉肌球蛋白重链IIB具有RNAi效应。
17.—种核酸,包含由序列号为11中所记载的碱基序列构成的DNA,编码对于非肌肉肌球蛋白重链IIB具有RNAi效应的双链RNA。
18.—种筛选用于预防或治疗疱疹病毒感染症的医药的方法，包括以下工序用候选化合物处理表达非肌肉肌球蛋白重链IIA或者非肌肉肌球蛋白重链IIB的细胞；向所述细胞感染疱疹病毒；测定在所述细胞中的非肌肉肌球蛋白重链IIA或者非肌肉肌球蛋白重链IIB的向细胞膜附近的移动、或者向所述细胞的疱疹病毒的侵入中的至少一个。
19.一种筛选用于预防或治疗疱疹病毒感染症的医药的方法，包括以下工序在非肌肉肌球蛋白重链IIA或者非肌肉肌球蛋白重链IIB与糖蛋白B能够结合的条件下，使非肌肉肌球蛋白重链IIA或者非肌肉肌球蛋白重链IIB与糖蛋白B和候选化合物接触；测定非肌肉肌球蛋白重链IIA或者非肌肉肌球蛋白重链IIB与糖蛋白B的结合。
全文摘要
本发明的目的在于发现在多种细胞中表达且作为疱疹病毒的受体起作用的蛋白，并且提供通过抑制该受体与疱疹病毒的结合而防止病毒向细胞侵入的疱疹病毒感染症的预防剂或者治疗剂。本发明提供一种用于预防或治疗疱疹病毒感染症的医药组合物，该医药组合物作为有效成分而包含抑制糖蛋白B与非肌肉肌球蛋白重链IIA或者非肌肉肌球蛋白重链结合的物质。
文档编号C07K16/18GK102985112SQ20118002606
公开日2013年3月20日 申请日期2011年3月25日 优先权日2010年3月26日
发明者川口宁, 有井润, 荒濑尚 申请人:国立大学法人东京大学