专利名称：用于免疫调节的疱疹病毒的制作方法
技术领域：
本发明涉及能有效感染树突细胞的减毒单纯疱疹病毒。还涉及所述病毒在免疫疗法治疗疾病中的用途。
若干疾病都会遇到切实需要产生针对肿瘤抗原或其它疾病相关抗原的治疗性免疫反应。首先，必须确定其表达是肿瘤或疾病特有的(或至少是选择性的)分子，并且它本身可以作为免疫反应的靶的分子。这项工作已经证实对于多数普通肿瘤是非常困难的，但是目前例如对宫颈癌来说得到了解决，因为在大多数情况下存在病毒癌基因E6和E7，而对于其它肿瘤来说，正在开始鉴定好的候选抗原。例如MUC-1基因产物在许多肿瘤(包括90％卵巢癌)中过度表达。还有多种其它肿瘤相关抗原已经被鉴定，其中任何抗原都可以用于免疫疗法治疗癌症。以后必将不断发现其它肿瘤相关抗原。其次，鉴定抗原后，必须将抗原以免疫原性形式传递给免疫系统。为了产生对肿瘤排斥非常重要的细胞免疫反应，这意味着所述蛋白质必须传递到宿主细胞的细胞质内(对于高分子量蛋白抗原来说是一项困难的任务)或者是在基因传递或DNA免疫后宿主细胞自身合成抗原。已经公认用于这一目的病毒载体包括牛痘、腺病毒、或反转录病毒。
目前公认可以提供最适的免疫刺激的细胞类型是树突细胞(DC；例如参见Girolomoni和Ricciardi-Casagnoli，1997)。其实所述DC可认为是在体内能够刺激最初免疫反应的仅有的细胞类型，并且在某些情况下甚至表现出能够打破已经建立的耐受性。许多组织正在研究DC在自体采用的免疫疗法中刺激对肿瘤的免疫反应的用途，希望它们可以表现出治疗效果。所述方案包括培养和/或富集外周血DC，体外用抗原加载处理DC，将该DC再引入患者或直接体内将抗原加载DC。但是这一方法由于缺少将抗原加载到这些细胞的有效手段而受到阻碍。然而近期研究表明，在体内通过肽脉冲DC的抗原提呈产生了抗肿瘤反应(Celluzzi等，1996；Zitvogel等，1996)。关于病毒载体，反转录病毒不能向树突细胞高效传递基因(Reeves等，1996；Aicher等，1997)，并且据我们掌握的其他的不同的研究报道(Arthur等，1997)，腺病毒只能低效传递基因。
我们以前试验并报道过，单纯疱疹病毒(HSV)能有效地感染并将基因传递给树突细胞(Coffin等，1998；WO00/08191)。对于这一目的，与其它载体系统相比HSV具有许多优点，因为它可以有效地感染多种细胞类型(包括一些其它载体系统很难感染的细胞，例如Dilloo等，1997；Coffin等，1998)，它容易操作，并能呈递大的DNA插入，允许多个基因表达(见综述Coffin和Latchman 1996)。体外将多种抗原传递给树突细胞接着再导入体内或直接在体内将抗原导入树突细胞可能为特别有希望的治疗某些癌症和传染性疾病的方法。
WO00/08191指出，野生型单纯疱疹病毒在感染的树突细胞中阻止发生抗原加工，而缺少功能性UL43和vhs基因的疱疹病毒或包含使立即早期基因表达最小化的突变的疱疹病毒能有效地感染树突细胞而不阻止在所述感染细胞中发生抗原加工。
发明概述目前我们惊讶地发现在HSV载体中编码病毒粒体宿主隔绝蛋白(vhs)的基因的破坏能使HSV感染细胞发生有效的树突细胞活化。所述UL43的破坏也不是必须的。以前认为无论是感染本身还是其它刺激，HSV感染的树突细胞通常不能被活化(Salio等1999，Kruse等2000)。
我们已经证实了以前未知的在阻止树突细胞活化中vhs蛋白的功能。树突细胞活化定义为与非活化状态相比某些细胞表面标记正调节。这些标记包括CD83和CD86。树突细胞活化可以通过脂多糖(LPS)处理来刺激。LPS处理HSV感染的树突细胞不会导致CD83或CD86的上调。我们证明了LPS处理突变HSV(其中vhs失活但是具有功能性UL43基因)感染的树突细胞的CD83和CD86都上调了。LPS处理用含有功能性vhs基因的病毒感染的树突细胞没有观察到CD83和CD86的上调。因此我们的结果表明，为了疱疹病毒感染后转导树突细胞最大地刺激免疫反应，应该破坏编码vhs的基因但是不必破坏编码UL43的基因。
我们的结果还证实了vhs在野生型单纯疱疹病毒的发病机制中的作用。HSV高效感染树突细胞，似乎可能的原因是，其如此进化的自然生活周期的一部分使细胞介导免疫反应最小化，这样可以阻止HSV潜伏感染的有效建立或者导致在潜伏并再活化的重复循环期间清除所述病毒。树突细胞活化对刺激有效的细胞介导免疫反应是重要的。Vhs是病毒粒体蛋白，这样尽管HSV基因在树突细胞中一般不高水平表达，但是vhs蛋白随同侵入的病毒一起传递到树突细胞。因此vhs在阻止感染了HSV的树突细胞活化上的新的功能可能是vhs在HSV感染人类后HSV生活周期中的重要功能。
因此，本发明提供在制造用于刺激免疫反应的方法的药物中减毒疱疹病毒的用途，所述病毒(i)缺少功能性vhs基因或其功能相当的基因；以及(ii)包含功能性UL43基因或其功能相当的基因；所述方法包括用所述病毒感染树突细胞。所述病毒优选人类单纯疱疹病毒。更优选HSV1或HSV2。所述树突细胞可以在体外或体内感染。
所述病毒可以包含一个或多个额外的突变。所述额外的突变优选使所述病毒的毒性最小化。通常所述突变导致立即早期(IE)基因表达降低或最小化。阻止或减少IE基因的表达就阻止或减少病毒复制。所述突变包括例如，编码ICP4、ICP27、ICP0和/或ICP22的基因中的失活突变，优选ICP27和/或ICP4。还可以包括在vmw65-编码基因中除去其反式激活功能的失活突变(例如，象Ace等，1989或Smiley等1997中的vmw65突变)。优选额外的突变还可以使所述病毒的免疫反应-抑制活性最小化。所述突变包括编码ICP47基因的失活。
图2所示测定CD40、CD80、CD83和CD86在未刺激(图2A)和LPS刺激(图2B)的模拟感染细胞和感染17+、1764/27-/4-和1764/27-/4-/pR20.5/vhs病毒株的细胞上的细胞表面表达水平的FACS分析结果。
图3所示测定病毒感染对未感染树突细胞和感染17+、1764/27-/4-和1764/27-/4-/pR20.5/vhs病毒株的树突细胞分泌IL-6和TNFα的影响的ELLSA分析结果。
图4所示接种和未接种乙型肝炎个体的T-细胞在HBS-Ag作用下的增殖反应。从每个个体获取的树突细胞未处理、与重组HBS-Ag蛋白(HBSAg*)混合、与T-细胞混合前感染对照载体(1764/27-/4-/pR20.5/vhs/HBS-Ag)或感染表达HBS-Ag的载体(1764/27-/4-/pR20.5/vhs/HBS-Ag)。
发明详述A.病毒本发明的病毒能感染树突细胞而不阻止所述感染树突细胞活化。以感染复数(MOI)为1感染本发明病毒的优选树突细胞可以通过用LPS处理或其它活化刺激处理活化。
本发明的病毒不阻止树突细胞的活化。为了测定何时病毒允许树突细胞发生活化，用所述病毒以MOI≥1感染树突细胞并且将感染的树突细胞用LPS处理。可以监控随着树突细胞的活化上调的细胞表面标记(如CD83和/或CD86)的水平来测定树突细胞的活化，例如通过FACS分析。如果所述细胞感染的病毒允许树突细胞发生活化，那么在LPS处理的树突细胞中所述细胞表面的这些标记的水平明显高于没用LPS处理的细胞。感染了允许树突细胞发生活化的病毒的树突细胞上的一些或全部这些标记也将高于未感染的树突细胞。如果用不含vhs失活突变的单纯疱疹病毒来感染树突细胞的话，那么观察到这些标记很少上调。
本发明的允许感染树突细胞发生活化的病毒将缺少编码vhs(在HSV中)的功能性基因或其在其它病毒种类中的同源物或功能等同物。此外，本发明的病毒还具有功能性UL43基因。额外的突变例如在编码ICP47的基因中包含的突变可以使病毒的免疫反应-抑制作用进一步减少。
本发明的减毒病毒优选能够感染树突细胞以至获得最小毒性。优选在感染后一天至少50％感染后存活细胞，更优选在感染后一天至少60％、70％、80％或90％。为了达到降低毒性，本发明的病毒可以包括一个或多个减少病毒复制的突变。例如，可以包括在编码VMW65的基因中的突变(该突变使所述蛋白的反式激活活性最小化)和/或在一个或多个调节立即早期基因如ICP4、ICP27、ICP0和ICP22中的突变。因此，本发明的病毒通常缺少功能性vhs、ICP27、ICP4基因并包含编码不具有转录激活活性的蛋白质的VMW65基因，或通常缺少功能性vhs、ICP47和ICP4基因。
对于体内直接应用，某种程度的可复制性通常对加强所诱导的免疫反应有益。因此在这种情况下，本发明的病毒优选缺少功能性vhs基因并且还可以缺少一个或多个对病毒的完整致病性必须的但对病毒复制不是必须的功能性基因。所述基因包括编码ICP34.5、ICP6、胸苷激酶和糖蛋白如gH的基因。但是优选的编码胸苷激酶的基因是功能性的，因为这一基因突变将致使所述病毒对抗病毒药物如无环鸟苷不敏感。
尽管本发明应用单纯疱疹病毒举例说明，但应理解为疱疹病毒科的其它病毒可以修饰成减少感染的树突细胞的树突细胞活化的阻碍。特别是所述病毒可以包括水痘-带状疱疹病毒、假狂犬病病毒或牛疱疹病毒。
当本发明的病毒是单纯疱疹病毒时，所述病毒可以由例如HSV1或HSV2株或其衍生物获得，优选HSV1。衍生物包括含有HSV1和HSV2株的DNA的型间重组体。所述型间重组体本领域已有介绍，例如Thompson等(1988)和Meignier等(1988)。衍生物优选至少70％序列与HSV1或HSV2基因组同源，更优选至少80％，甚至更优选至少90％或95％，一般通过本文所述方法测定。更优选衍生物具有至少70％序列与HSV1或HSV2基因组相同，更优选至少80％相同，甚至更优选至少90％、95％或98％相同。
衍生物可以具有经核苷酸取代(例如从1、2或3到10、25、50或100个核苷酸取代)修饰的HSV1或HSV2基因组的序列。所述HSV1或HSV2基因组可以二者选一或额外地通过一个或多个插入和/或缺失和/或通过在任一或两个末端延长来修饰。
可以用来获得本发明的病毒的衍生物包括已经在基因中具有本发明病毒想要的功能性失活的突变的病毒株，例如vhs失活病毒株(Jones等1995)、ICP47失活病毒株(Goldsmith等1998)、在ICP4中具有缺失的病毒株d120(DeLuca等，1985)、在ICP27中具有缺失的病毒株d27-1(Rice和Knipe，1990)或在ICP27和ICP4中都有缺失的病毒株d92(Samaniego等，1995)。应用这些病毒株可以减少产生本发明的突变HSV病毒株需要的步骤。
用于描述各种HSV基因的术语可在Coffin和Latchman，1996中找到。
既然上述HSV基因的基因同系物存在于其它疱疹病毒种类中，那么可以修饰这些同系物。由于“同系物”是指功能相当于HSV基因的基因，同系物通常具有同源序列，不是氨基酸序列就是核苷酸序列与相应的HSV基因同源性。通常，HSV基因同系物在氨基酸水平与相应的HSV基因至少15％相同，优选至少20％，更优选至少30％、40％或50％相同。
编码vhs的基因在HSV1和HSV2中是UL41基因。所述UL41基因在HSV1株17+(EMBL登记号HE1CG)中是从核苷酸91,170到核苷酸92,637。所述UL41基因在HSV2株HG52(EMBL登记号z86099)中是从核苷酸91,800到93,275。
测定核苷酸和蛋白质同源性的方法在本领域是众所周知的。例如UWGCG程序包提供可以用于计算同源性的BESTFIT程序(例如应用其设置默认值)(Devereux等(1984)Nucleic Acids Research 12，第387-395页)。所述PILEUP和BLAST运算法则可以用于计算同源性或排列序列(通常应用其设置默认值)，例如在Altschul(1993)J.Mol.Evol.36290-300；Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-10中所述。
执行BLAST分析的软件可以通过国家生物技术信息中心(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。该运算法则包括首先通过确定当与数据库序列中相同长度的字节(word)排比时匹配或满足一定的正值阈值T的查询序列中长度W的短字节(short words)来测定高分序列对(HSP)。T是指邻近字节分数阈值(Altschul等，1990)。这些起始邻近字节命中数(hits)作为开始寻找包含它们的HSP的开端。所述累积排列分数能增加多少，所述字节命中数沿着每个序列的两个方向延长多少。所述字节命中数在每个方向的延长在下列时候停止所述累积排列分数从其达到的最大值下降X数量；由于一个或多个负数-计分残基排列的积累使所述累积分数变为0或0以下时；或达到任一序列的末端时。所述BLAST运算法则参数W、T和X决定排列对比的灵敏度和速度。所述BLAST程序设置默认值字节长度(W)为11，BLOSUM62计分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910915-10919)排列(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝4，并且比较两条链。
所述BLAST运算法则进行两个序列之间相似性的统计分析；参见例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA905873-5787。一种BLSAT运算法则提供的相似性测量是最小总概率(P(N))，它提供两个核苷酸或氨基酸序列之间发生偶然匹配的概率。例如，如果比较第一序列与第二序列的最小总概率低于大约1，优选低于大约0.1，更优选低于大约0.01，最优选低于大约0.001，那么认为这一序列与另一序列相似。
HSV基因的同系物可以通过多种方法测定，例如通过用包含全部或部分HSV基因的探针在中到高严格条件下(例如0.03M氯化钠和0.03M柠檬酸钠，温度大约50-60℃)探测由其它病毒制备的基因组或cDNA文库。另外，也可以应用简并PCR获得种同系物，所述PCR应用的引物针对变异体中的目标序列和编码保守氨基酸序列的同系物。所述引物可以包含一个或多个简并位置，并且在严格条件下应用，所述条件低于用对已知序列的单一序列引物来克隆序列所用的条件(例如0.03M氯化钠和0.03M柠檬酸钠，温度大约40℃)。
如果疱疹病毒的同系物与HSV蛋白共享一个或多个功能特性，那么它是HSV蛋白的功能等同物。例如，vhs蛋白在感染的细胞中通过降低mRNA的稳定性起到降低蛋白质表达水平的作用。因此，vhs蛋白功能等同物优选通过降低mRNA的稳定性起到终止宿主细胞基因表达的作用。更优选vhs功能等同物阻止树突细胞对刺激应答(它可以活化未感染的树突细胞)的活化。
为了安全，本发明的病毒是减毒的，因此它们一般不能引起疾病，为了减毒而改变的病毒区域可以是去处(完全或部分)、或使其失去功能、或通过其它序列(尤其是通过异源基因序列)取代。减毒突变对于所有用作病毒载体的病毒组都有描述。例如，可以通过在ICP34.5和/或必需基因如ICP4、ICP27和/或vhs基因本身突变致使HSV无毒性。
特别优选的减毒病毒包括除了缺少编码vhs的功能性基因和任选缺少功能性ICP47基因之外，缺少功能性ICP34.5基因和功能性ICP27基因以及任选缺少功能性ICP4基因和/或编码具有转录激活活性的蛋白的VMW65基因的病毒；以及具有功能性ICP27基因但是缺少功能性ICP4基因和功能性ICP34.5基因以及任选缺少编码具有转录激活活性的蛋白的VMW65基因的病毒。所述病毒描述于WO98/04726和WO99/60145中，其公开的内容通过引用结合到本文中。
当本发明的单纯疱疹病毒缺少特定功能必须基因(例如编码ICP4或ICP27的基因)时，所述病毒用表达所述必须基因的细胞系来繁殖。例如，当病毒缺少功能性ICP27基因时，所述病毒可以应用V27细胞(Rice和Knipe，1990)、2-2细胞(Smith等，1992)或B130/2细胞(WO98/30707)来繁殖，优选B130/2细胞。当病毒缺少功能性ICP4基因时，所述病毒可以应用表达ICP4的细胞系如E5细胞(DeLuca等，1985)来繁殖。当病毒缺少功能性ICP4基因和功能性ICP27基因时，所述病毒应用表达ICP4和ICP27(如E26细胞；Samaniego等，1995)的细胞系来繁殖，当病毒还缺少功能性vmw65基因时，所述病毒可以应用还包含vmw65的非HSV同系物(例如马疱疹病毒基因12或牛疱疹病毒的BTIF)的细胞系来繁殖。B.突变方法所述多种病毒基因可以通过本领域众所周知的几种技术致使其功能失活。例如，可以通过缺失、取代或插入，优选缺失来致使它们功能失活。缺失可以除去一部分基因或全部基因。例如，仅仅一个核苷酸缺失可以导致移码。但是优选大的缺失，例如从2、3或5到10、20、30、50、100或200个核苷酸的取代。优选缺失或取代总编码和非编码序列的至少25％，更优选至少50％(或者以绝对量表示，至少10个核苷酸、更优选至少100个核苷酸、最优选至少1000个核苷酸)。特别优选去除整个基因和一些侧翼序列。插入序列可以包括以下所述异源基因。突变可以包括缺失和插入。例如可以在缺失位点中插入。因此异源基因在病毒基因中的插入可以替代部分或全部所述病毒基因。特别优选在vhs、ICP47、ICP27或ICP4中插入异源基因。就VMW65基因来说，不能缺失全部基因，因为它编码重要的结构蛋白，但是通常进行失活突变，完全破坏VMW65活化转录IE基因的能力(例如，Ace等，1989或Smiley等，1997)。
可以通过本领域技术人员众所周知的同源重组方法使疱疹病毒突变。例如，用载体(优选质粒载体)包含同源HSV序列侧翼的突变序列一起转染HSV基因组DNA。所述突变序列可以包括缺失、插入或取代，所有这些都可以通过常规技术构建。插入可以包括选择性标记基因例如lacZ或GFP，例如通过β-半乳糖苷酶活性或荧光来筛选重组病毒。C.异源基因和启动子本发明的病毒可以修饰为携带异源基因。术语“异源基因”包括任何基因。尽管异源基因是通常不存在于疱疹病毒的基因组中的基因，但是只要所述编码序列不是有效连接到与其自然相连的病毒控制序列上就可以应用疱疹基因。所述异源基因可以是野生型基因的任何等位基因变异体或突变基因。术语“基因”包括至少能够转录产生RNA分子的核酸序列，所述RNA分子优选能够翻译产生多肽或通过反义作用下调基因表达水平。本发明的病毒可以任选包括部分或全部5’和/或3’转录但不翻译的自然侧翼序列，或者与异源基因的翻译编码序列相连。它还可以任选包括通常与转录序列相连的转录控制序列，例如转录终止信号、聚腺苷酸化位点和下游增强子元件。
通过HSV病毒株与例如携带侧翼为HSV序列的异源基因/基因们的质粒载体的同源重组，可以将所述异源基因/基因们插入到病毒基因组中。应用本领域众所周知的克隆技术可将异源基因/基因们插入到合适的包含疱疹病毒序列的质粒载体中。只要病毒仍然可以繁殖，可将异源基因/基因们插入到病毒基因组的任何位置。优选异源基因/基因们插入到基因中导致病毒减毒。异源基因可以插入到病毒基因组许多位点中。
异源基因/基因们的转录序列优选有效连接到允许在树突细胞(优选哺乳动物树突细胞、更优选人类树突细胞)中表达异源基因/基因们的控制序列。术语“有效连接”是指并列其中所述成分的关系允许它们以它们想要的方式作用。控制序列“有效连接”到编码序列是以这样的方式连接在与控制序列一致的条件下完成编码序列的表达。
所述控制序列包含允许表达异源基因/基因们的启动子和转录终止信号。所述启动子选自哺乳动物优选人类树突细胞中起作用的启动子。所述启动子/启动子们可以得自真核基因的启动子序列。例如，启动子可以得自发生异源基因表达的细胞的基因组，优选哺乳动物树突细胞或更优选人类树突细胞。关于真核启动子，它们可以是以遍在方式(如β-肌动蛋白、微管蛋白的启动子)或树突细胞特异性方式作用的启动子。也可以使用病毒启动子，例如莫洛尼鼠类白血病毒长末端重复序列(MMLV LTR)启动子或其它逆转录病毒启动子，人类或小鼠巨细胞病毒(CMV)IE启动子。
可以应用本领域技术人员已知的常规克隆技术制备表达盒和其它合适的包含异源基因/基因们和控制序列的构建物(参见例如，Sambrook等，1989，分子克隆-实验指南；Cold Spring Harbor Press)。
此外，任何这些启动子都可以通过增加更多的调节序列例如增强子序列(包括HSV LAT区域元件)来修饰。也可以使用包含两个或多个上述不同的启动子的序列元件的嵌合启动子，例如MMLV LTR/LAT融合启动子(Lokensgard等，1994)或包含LAT区域元件的启动子(WO98/30707)。
异源基因通常编码治疗用途的多肽。例如，为了促进对特定肿瘤的特异性免疫反应，最好用控制表达肿瘤抗原/抗原们的本发明的病毒转染树突细胞。肿瘤抗原可以是对肿瘤细胞特异性的，即存在于肿瘤细胞但是在非肿瘤细胞中没有，或者例如由于抗原表达的上调，它以高于相同类型非肿瘤细胞中的水平存在于肿瘤细胞中。这将有助于癌症治疗，因为本发明的感染的树突细胞可以用于刺激宿主免疫系统，以与肿瘤-特异的或肿瘤-优势的抗原/抗原们反应，导致肿瘤缩小/退化。特别优选在肿瘤细胞表面表达的肿瘤抗原/抗原们，例如细胞表面受体或细胞粘着蛋白。肿瘤抗原的实例包括在多种肿瘤包括卵巢癌中过度表达的MUC-1基因产物(Gendler等，1990)；与宫颈癌有关的人乳头瘤病毒蛋白E6和E7。黑素瘤中的MART-I、MAGE-I、gp100和酪氨酸酶；前列腺癌中的PSA；多种不同类型的肿瘤中的CEA和多种癌症包括乳癌中的Her2neu。
异源基因也可以编码能够增进免疫反应的多肽，例如细胞因子(如α-、β-或γ-干扰素，白细胞介素(包括IL-1、IL-2)，肿瘤坏死因子，或胰岛素样生长因子I或II)或其它免疫调制蛋白，包括趋化因子如RANTES和共同刺激分子如CD80、CD86、CD40和CD40配体。
所述异源基因还可以编码致病源的多肽/多肽们，使得例如感染本发明病毒的树突细胞可用于在宿主感染所述病原前或感染后，刺激宿主免疫系统引起对病原的免疫反应。用于疫苗的病毒通常包含编码抗原多肽的异源基因。优选的所述致病源多肽得自病原微生物，例如寄生物、细菌或病毒。所述抗原性多肽的实例包括丙型肝炎病毒抗原、乙型肝炎病毒表面或核心抗原、乳头瘤病毒抗原、HIV抗原和疟疾抗原。包含病原微生物的异源基因的病毒可用于治疗和/或预防。
治疗应用有充分的理由需要给予多基因。多基因的表达有利于治疗多种疾病。疱疹病毒是唯一适当的，因为它们没有其它病毒载体系统的限制包装能力。因此多个异源基因可以容纳在它的基因组中。例如2-6个基因可以插入到基因组中。
这可以通过至少两种方法完成。例如可以将一个以上的异源基因和相关控制序列在病毒基因组的单位点或多位点导入到特殊的HSV病毒株中。也可以用两个启动子(相同或不同的启动子)在彼此相反的方向面对，这些启动子分别驱动如上所述的异源基因(相同或不同的异源基因)的表达。D.树突细胞树突细胞可以通过多种方法分离/制备，例如它们可以从外周血直接纯化，或由例如通过G-CSF处理转移到外周血后由CD34+前体细胞产生，或直接由骨髓产生。外周血的贴壁前体细胞可以用GM-CSF/IL-4混合物(Inaba等，1992)处理，或者骨髓的非贴壁CD34+细胞可以用GM-CSF和TNF-α(Caux等，1992)处理。树突细胞可以应用与Sallusto和Lanzavecchia，1994相似的方法由人类自愿者的外周血常规制备，应用纯化的外周血单核细胞(PBMC)并用GM-CSF和IL-4处理贴壁细胞2小时。然后用磁珠除去CD19+B细胞和CD3+、CD2+T细胞(参见Coffin等，1998)。其它方法也可以用于树突细胞的制备。E.治疗应用本发明的病毒和感染本发明病毒的树突细胞可以用在治疗的方法中。尤其是表达肿瘤抗原的本发明的病毒和感染本发明病毒的树突细胞可以用在治疗癌症的方法中。本发明的病毒和感染本发明病毒的树突细胞特别可以用于抑制哺乳动物包括人的各种肿瘤的生长，例如卵巢、宫颈、子宫内膜的肿瘤和癌，例如乳癌、肺癌、膀胱癌和结肠癌。可以抑制其生长的其它肿瘤包括肉瘤(例如软组织和骨肉瘤)和血液癌(如白血病)。可以用表达肿瘤抗原的本发明病毒和/或感染本发明病毒的树突细胞治疗的癌症的特别实例包括黑素瘤、白血病、宫颈癌和卵巢癌。用于治疗癌症的病毒通常包含编码肿瘤抗原的异源基因。所述病毒或感染所述病毒的树突细胞的给予通常可以导致产生对肿瘤抗原的免疫反应。
本发明的病毒和感染本发明病毒的树突细胞可以用在治疗和预防病原性感染(例如寄生物、细菌或病毒的感染)的方法中。用于治疗病原性感染的病毒通常包含编码致病微生物的抗原的异源基因。所述病毒和感染所述病毒的树突细胞的给予通常导致产生对致病微生物抗原的免疫反应。所述病毒感染包括疱疹病毒感染。因此本发明的病毒可以用于引起对所述病毒本身的免疫反应，例如在HSV1或HSV2感染的治疗或接种疫苗中。如果病毒打算用于治疗HSV1或HSV2，那么所述病毒可以任选包含异源基因，该异源基因编码HSV抗原(它不受其自身启动子控制)或免疫调制分子。在感染前给予所述病毒/树突细胞可以刺激宿主的保护性免疫反应，在感染后给予可以刺激宿主免疫系统抵抗感染。F.给药因此，本发明的疱疹病毒可以用于将治疗基因传递给需要治疗的人或动物。应用本发明的疱疹病毒传递治疗基因可以用于治疗例如恶性肿瘤和/或病原性感染。
本发明的病毒可以用于需要治疗的患者，优选人类患者。需要治疗的患者是患有癌症的个体或病原体感染的患者。治疗的目的是改善患者的病情。应用本发明病毒常规性治疗可以减轻癌症的症状。按照本发明治疗癌症的方法包括给予患有癌症的患者治疗有效量的具有功能性UL43基因并缺少功能性vhs基因的病毒，因此所述病毒存在于患者的树突细胞中。给予患有肿瘤的个体本发明病毒通常可以杀死肿瘤细胞，因此减小肿瘤大小和/或预防肿瘤恶性细胞扩散。
应用本发明病毒对病原性感染的治疗通常减轻感染的症状，优选杀死致病生物。按照本发明治疗病原性感染的方法包括给予病原感染的患者治疗有效量的缺少功能性vhs基因的病毒。优选所述病毒进入患者的树突细胞或者给予患者体外感染所述病毒的树突细胞。应用本发明病毒预防的治疗通常导致癌症或病原感染风险患者产生针对肿瘤抗原的抗体或针对致病生物抗原的抗体。癌症风险患者通常遗传易感患者或可能暴露于致癌物质或具有暴露于致癌物质的风险患者。病原感染风险患者通常可能暴露于致病生物。
实施治疗的一种方法包括如上所述将治疗基因/基因们插入到本发明疱疹病毒的基因组中，然后将获得的重组病毒与药学上可呈递的载体或稀释剂混合产生药用组合物。合适的载体和稀释剂包括等渗盐溶液，例如磷酸盐缓冲液。所述组合物可以制成肠胃外、肌内、静脉内、腹膜内、皮下或经皮给药制剂。优选皮下或腹膜内给药。特别优选经皮或皮内给药。
本发明病毒感染树突细胞可以通过给予患者包含所述病毒的组合物体内实现。所述药用组合物给药方式使得包含治疗基因/基因们的所述病毒可以感染树突细胞。病毒的给药量是在104-1010pfu范围内，优选105-108或105-109pfu，更优选大约106-108pfu。当皮内注射或经皮给药时，例如应用无针装置，通常给予10μl-1ml，优选100μl-1ml的在药学上可呈递的合适载体或稀释剂中的或在微粒组合物中的病毒。
另一个方法包括分离/制备外周血或骨髓的树突细胞并在体外用本发明的病毒感染所述细胞。然后转导的树突细胞通常通过肌内、腹膜内、皮下或静脉内注射给予，或直接注射到患者的淋巴结，优选皮下、腹膜内或直接注射到淋巴结给予患者。通常给予患者105-109转导的树突细胞，优选106-108细胞，更优选大约107细胞。
所述给药途径和剂量仅作参考，因为熟练的从业者能为任何特定患者容易地确定最佳给药途径和剂量。按照不同的参数，尤其按照例如患者的年龄、体重和病情决定剂量。
下列实施例说明本发明。
为了使病毒的VMW65突变，在培养病毒的介质中包括3mM六亚甲基-双乙酰胺(HMBA)(McFarlane等，1992)。使用下列病毒株(i)17+(野生型HSV1)(ii)17+/pR20.5/UL43应用标准方法通过与纯化的基因组HSV1病毒株17+DNA同源重组将来自质粒pR20.5(Thomas等1999b)的盒插入到UL43处，所述盒包括RSV/lacZ/pA序列和HSV LAT区域序列(nts 118，866-120，219)隔离开、反向背对背的CMV/GFP/pA序列。所述pR20.5盒首先在独特的Nsi I位点插入到包含UL43侧翼区域(Coffin等，1996)的质粒中，得到质粒pR20.5/43。当编码Srf I的寡核苷酸插入到盒任一侧时，所述20.5盒可以用Srf I从其pGEM5(Promega)质粒主链中切除。从pRc/RSV(Invitrogen)中切除所述RSV启动子、从pCH110(Pharmacia)中切除lacZ/pA、从pcDNA3(Invitrogen)中切除CMV/pA以及从pEGFP-N1(Clontech)中切除GFP，用于构建质粒pR20.5。
(iii)1764/27-/4-病毒株1764/27-/4-如下构建病毒株1764/27-/4-/pR20.5 DNA与空ICP4侧翼区域重排和选择不表达GFP或lacZ的病毒噬菌斑。病毒株1764/27-/4-/pR20.5描述于Thomas等，1999b，它包括插入到ICP4基因中的pR20.5盒，以致替代病毒编码ICP4的基因，同时缺失ICP27和ICP34.5，并在编码VMW65基因中有失活突变。
(iv)1764/27-/4-/pR20.5/vhs病毒株1764/27-/4-/pR20.5/vhs如下构建通过在HSV1病毒株17+的vhs编码基因中的独特Nru I位点将pR20.5盒插入到vhs侧翼区域中，将获得的质粒(pR20.5/vhs)重组到HSV病毒株1764/27-/4-DNA中。因此病毒株1764/27-/4-/pR20.5/vhs缺失编码ICP4、ICP27和ICP34.5的基因，并且在编码vmw65和vhs的基因中有失活突变。
(v)1764/27-/4-/pR19lacZ病毒株1764/27-/4-/pR19lacZ如同以上病毒(iv)构建，只是将pR19lacZ盒(Wagstaff等，1998)重组到病毒株1764/27-/4-的潜伏相关转录(LAT)区域，而不是pR20.5盒插入到vhs。
(vi)1764/27-/4-/pR20.5/vhs/HBS-Ag通过用Xho I和Nsi I消化pHBV130(Gough和Murray，1982)并在Sal I和Sma I位点之间插入释放的片段到pSP72(Promega)中，将pR20.5/vhs质粒中的lacZ基因替换成编码肝炎表面抗原(HBS-Ag)的基因。用Xba I和EcoR I消化pR20.5/vhs释放lacZ基因，所述lacZ基因由用HindIII和EcoR I从pSP72中切除的HBS-Ag基因代替。获得的质粒重组到1764/27-/4-/pR20.5/vhs病毒DNA中，选择并纯化不表达lacZ的噬菌斑。然后通过DNA印迹确定基因组结构。制备树突细胞如前所述由外周血制备DC(Coffin等，1998)。简要地说，用lymphoprep(Nycomed)从60ml健康/乙肝接种的供体血液中制备外周血单核细胞(PBMC)。除去红细胞后，取出非贴壁细胞(主要是T细胞和B细胞)，用HBSS冲洗并以1400rpm、5分钟室温离心。所述细胞沉淀用2ml90％FCS10％二甲基亚砜(DMSO)混合液中重悬浮，等分试样并贮藏在-80℃用于以后T细胞分离。用添加GM-CSF(0.1μg/ml)和IL-4(0.05μg/ml)的RPMI培养基培养贴壁细胞并在37℃、5％CO2中培养7天。进一步lymphoprep后接着用抗-CD19、抗-CD2(Harlan)和抗CD3(Harlan)抗体磁力去除纯化细胞，DC在完全RPMI培养基中重悬浮以备立即使用。CD4+T-细胞的分离将如上所述的冷冻T和B细胞迅速解冻，用HBSS冲洗并以1400rpm离心5分钟。细胞重悬浮于2ml完全RPMI培养基中，计数并用抗-CD19(BU12-200μl neat，Immunology dept，UCL)、抗-CD14(HB246-200μl neat，Immunology dept，UCL)和抗-HLA-DR(L243-100μlneat，Immunology dept，UCL)mAb孵育，放在冰上30分钟。所述细胞用HBSS冲洗，重悬浮于2ml完全RPMI培养基中，以10μl珠/106污染细胞的比例与结合到磁珠上的绵羊抗小鼠抗体(Dynabeads，Dynal)混合并在转动混合器上在4℃孵育45分钟。然后使所述细胞悬浮液/磁珠混合物在冰上接触磁体10分钟后通过去除上清液来取出CD4+T细胞。CD4+T细胞计数，以适合的浓度重悬浮于完全RPMI培养基中，放在冰上或培养在37℃、5％CO2(o/n)中备用。感染DC在室温下以1400rpm沉淀DC5分钟。然后通过将DC重悬浮在包含病毒的RPMI培养基中以MOI为1于37℃、5％CO2下感染DC1小时。然后加入1ml添加GM-CSF(0.1μg/ml)和IL-4(0.05μg/ml)的RPMI培养基。DC在37℃、5％CO2下孵育。为了进行LPS刺激，可以使用额外包含100ng/ml的LPS的RPMI。细胞因子分析应用市售可得的ELISA试剂盒(R&D Systems)测量DC培养上清液中的IL-6和TNF-α。ELISA之前，用指示病毒感染DC后42小时收集上清液冰贮藏在-20℃备用。T细胞增殖试验分离并如上处理来自乙肝接种和未接种的人类个体的DC和CD4+T细胞。DC以1×105DC/ml到1×104DC/ml稀释渡使用，CD4+T细胞以1×106细胞/ml使用。DC每个浓度的实验都一式三份。向每个测定加样孔加入100μl DC和100μl CD4+T细胞。向加样孔加入指示重组乙肝表面抗原(Austral)至终浓度为1μg/孔。HSV-1-感染和未感染的DC和CD4+T细胞在37℃、5％CO2中培养6天。然后加入1μCu/孔[3H]胸苷(Amersham)，18小时后收获细胞并计数掺入的[3H]胸苷。实施例1初步数据表明不含功能性vhs基因的HSV病毒株增强病毒感染后的树突细胞活化本文在所有情况下都用每种病毒感染1×105树突细胞，所述病毒通过温和离心，以大约100μl病毒悬浮液重悬浮于DMEM中，在37℃孵育1小时，并与2ml RPMI/10％FCS+100ng/ml GM-CSF、50ng/mlIL-4一起转移到24孔板中。然后这些板在37℃/5％CO2中孵育过夜。树突细胞也用已知的树突细胞活化剂脂多糖(LPS)处理，用未处理的作对照。
然后将这些感染和对照的上清液用于ELISA测定以检测分泌细胞因子的水平。应用荧光激活细胞分类术(FACS)检测感染和对照树突细胞表面CD86的表达水平。在树突细胞培养物中有两种与CD86表达水平有关的细胞。FACS分析观察到两个峰，即反映细胞的第一个峰与低水平的CD86表达有关，细胞的第二个峰与高水平的CD86表达有关。例如LPS活化时，更多的细胞表达高水平的CD86，因此在第二个峰发现更多细胞。
结果
表1指示病毒以MOI为1感染24小时后培养上清液或对照上清液中细胞因子浓度(ELISA测定)。
表2对照细胞和用指示病毒感染的细胞的CD86表达结论结果表明未处理的树突细胞分泌最小水平的检测的细胞因子并在其表面具有预料的“静止”水平CD86。LPS处理后显著刺激细胞因子水平并且表面CD86的表达水平显著增加。应用抗-CD86抗体的FACS分析，在上述实验中LPS处理细胞的平均荧光强度大约为1×103。这些结果表明树突细胞处于活化状态。
指示病毒感染树突细胞后，可以清楚地了解到，对于树突细胞发生的这些测定的活化，所述病毒必须在编码vhs基因中包含失活突变。使用不同无能水平的病毒，只有包含vhs突变的病毒显著活化上述测定中的树突细胞。还可以了解到当细胞用LPS处理并用指示病毒感染时如果不包括vhs突变，CD86水平象许多只用LPS处理的细胞一样不增加。同样，除非包括vhs突变，否则FACS测量的病毒感染后CD86表达细胞的平均荧光强度从如果细胞用LPS处理所看到的要降低。因此，结论是为了使树突细胞得到最大免疫刺激，应该在编码vhs基因中包括失活突变。实施例2不含功能性vhs蛋白的HSV病毒株不妨碍树突细胞活化应用荧光激活细胞分类术(FACS)检测感染和对照树突细胞表面CD86、CD80、CD83和CD40的表达水平。ELISA测定感染的上清液细胞因子的水平。结果ELISA结果(图3)表明，尽管可以用HSV高效感染，但是野生型(病毒株17+)或失活(病毒株1764/27-/4-)病毒不产生DC活化的指示细胞因子。但是如果将病毒株1764/27-/4-的vhs失活，产生病毒株1764/27-/4-/pR20.5/vhs，那么产生DC活化的指示细胞因子。对无LPS刺激的DC的FACS分析(图2)表明，基本用野生型HSV(病毒株17+)或不能复制的HSV载体(病毒株1764/27-/4-)感染阻止CD86表达的增加。如上所述，如果DC已经被感染过程活化那么可以预料到CD86表达增加。在HSV感染的细胞中CD40的水平也改变/降低。但是，如果vhs失活(病毒株1764/27-/4-/pR20.5/vhs)，指示活化的CD86水平增加，而CD40水平不受影响。在HSV感染的无刺激DC中CD80和CD83不受很大的影响。CD83(B7.1)和CD86(B7.2)是两个关键的T-细胞共同刺激分子，CD40是关键的T-细胞激活剂，CD83是DC成熟和活化期间DC上调的标记。
在感染野生型(病毒株17+)或失活(病毒株1764/27-/4-)病毒的时候用LPS刺激DC，对CD40水平的影响更显著。但是，如果vhs失活，那么阻止了这些对CD40的影响。LPS刺激的DC通常显著上调CD83和CD86的表达，但是受HSV阻止(病毒株17+和1764/27-/4-)，除非vhs失活(病毒株1764/27-/4-/pR20.5/vhs)。当vhs失活时，CD83和CD86水平都增加到与LPS刺激的未感染的细胞相同或更高的程度。结论如初步实验(实施例1)所述，可以清楚地了解到，对于树突细胞活化，所述活化通过在HSV感染或HSV感染和LPS刺激作用下的表面标记的表达水平来测量，显然编码vhs的基因必须失活。编码功能性vhs的病毒不允许树突细胞显著活化，所述活化通过所检测表面标记的表达水平来测量。实施例3体外用vhs失活的HSV载体转导DC引导抗原特异性T细胞反应。
上述结果说明，vhs失活的HSV载体可以作为有效的载体用于DC，因为HSV在DC中失活作用已得到阻止。其实用所述HSV突变体感染的DC似乎在感染作用下特异性活化，其根据CD86的上调和特定细胞因子的分泌来测量。为了检测vhs-失活的HSV突变体是否可以用于在将抗原编码基因传递到DC后引导抗原特异性免疫反应，应用由乙肝接种和未接种个体制备的DC和T-细胞进行实验。在此首先构建病毒，其中乙肝表面抗原(HBS-Ag)表达盒插入到缺失IE基因病毒的vhs编码基因中。然后进行T-细胞增殖测定，其中来自接种的或未接种的个体的DC未经处理、通过与重组HBS-Ag蛋白混合而“加载”抗原、用包含对照标记基因的载体感染(1764/27-/4-/pR20.5/vhs，MOI＝1)、用对照载体感染(1764/27-/4-/pR20.5/vhs，MOI＝1)并且还与重组HBS-Ag混合、或者用表达HBS-Ag的载体感染(1764/27-/4-/pR20.5/vhs/HBS-Ag，MOI＝1)。然后将DC分别与得自相同的接种的或未接种的个体的T-细胞混合，在标准的T-细胞增殖测定中观察对T-细胞增殖的作用。
这些实验表明(图)，尽管HBS-Ag重组蛋白和所述对照HSV载体可以在接种个体中引起小的T-细胞增殖反应，所述HSV反应可能表明T-细胞对HSV结构蛋白特异性增殖，所述对照载体与重组HBS-Ag混合能诱发轻微增强的反应，HBS-Ag的表达载体引起比任何这些都显著的加强反应。因此随着应用HSV载体将HBS-Ag直接传递到DC，引起明显特异的T-细胞增殖反应，仅与重组抗原混合不会发生这样的增殖反应。因此vhs失活的HSV载体允许传递抗原编码基因到DC，以便使DC保留刺激抗原特异性T-细胞增殖反应的能力。
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权利要求
1.减毒疱疹病毒在制备用于刺激免疫反应的方法的药物中的用途，所述病毒(i)缺少功能性vhs基因或其功能等同物；(ii)包含功能性UL43基因或其功能等同物；所述方法包括用所述病毒感染树突细胞。
2.按照权利要求1的用途，其中所述病毒是单纯疱疹病毒1或2。
3.按照权利要求1或2的用途，其中所述病毒缺少编码ICP47的功能基因。
4.按照任一前述权利要求的用途，其中所述病毒具有VMW65基因或其功能等同物，所述VMW65基因编码缺少转录-激活活性的蛋白质。
5.按照任一前述权利要求的用途，其中所述病毒缺少至少一个功能性立即早期基因。
6.按照权利要求5的用途，其中所述立即早期基因选自编码ICP0、ICP4、ICP22、ICP27的基因或其功能等同物。
7.按照权利要求5或6的用途，其中所述病毒缺少编码ICP27的功能基因和编码ICP4的功能基因。
8.按照权利要求4-7任一项的用途，其中所述病毒缺少编码ICP27的功能基因和编码ICP4的功能基因，并且它具有VMW65基因或其功能等同物，所述VMW65基因编码缺少转录-激活活性的蛋白质。
9.按照权利要求5-8任一项的用途，其中所述病毒缺少编码ICP0、ICP4、ICP22和ICP27的功能基因。
10.按照任一前述权利要求的用途，其中所述病毒还缺少ICP34.5功能基因或其功能等同物。
11.按照任一前述权利要求的用途，其中所述病毒包括异源基因。
12.按照权利要求11的用途，其中所述异源基因与控制序列有效连接，所述控制序列允许在树突细胞中表达所述异源基因。
13.按照权利要求11或12的用途，其中所述异源基因编码治疗用途的多肽。
14.按照权利要求11-13任一项的用途，其中所述异源基因编码选自以下的多肽与非肿瘤细胞相比在肿瘤细胞中或肿瘤细胞表面上的表达水平升高的多肽；存在于肿瘤细胞中或在肿瘤细胞表面上但是非肿瘤细胞没有的多肽；能够调节免疫反应的多肽；以及寄生物、病毒或细菌来源的多肽。
15.按照权利要求11-14任一项的用途，其中所述病毒包括一种以上的异源基因。
16.按照任一前述权利要求的用途，其中所述病毒包括能够调节免疫反应的一种或多种异源基因。
17.按照权利要求16的用途，其中所述异源基因编码趋化因子、细胞因子或共同刺激分子。
18.按照任一前述权利要求的用途，其中所述树突细胞是人树突细胞。
19.按照任一前述权利要求的用途，其中所述树突细胞是在体外感染前从外周血或骨髓中分离或制备的。
20.按照权利要求19的用途，其中所述树突细胞在感染后送回所述机体内。
21.按照权利要求1-18任一项的用途，其中所述树突细胞在所述病毒给予到人或动物体内后被感染。
22.按照任一前述权利要求的用途，其中所述药物是通过注射、输注、皮内或经皮途径给药或利用基因枪方式给药。
23.按照任一前述权利要求的用途，其中所述药物用于治疗或预防病原性感染或癌症。
24.一种刺激人体或动物免疫反应、或者治疗或预防人或动物病原性感染或癌症的方法，所述方法包括给予其需要患者有效量的具有UL43功能基因并缺少vhs功能基因的病毒。
全文摘要
本发明提供缺失功能性vhs基因或其功能等同物的减毒疱疹病毒在制备用于免疫疗法或接种的药物中的用途，包括用所述病毒感染树突细胞。
文档编号A61P31/04GK1439056SQ0181093
公开日2003年8月27日 申请日期2001年4月12日 优先权日2000年4月12日
发明者R·S·科芬 申请人:拜奥维克斯有限公司