一种鲤疱疹病毒II型的dsRNA及其应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种鲤疱疹病毒II型的dsRNA及其应用，属于水产养殖技术领域。
【背景技术】
[0002] 我国水产养殖业在近代得到了迅速发展，其中淡水鱼养殖产量增长最快。鲤科鱼 类鲫鱼作为我国淡水养殖的优良品种，除西部高原外，在全国各地均有分布，具有悠久的养 殖和生长历史以及极为丰富的资源。近十年来，我国鲫鱼养殖的规模和潜力发展迅速，其年 总产量现已达250万吨，并呈稳步上涨趋势，在淡水养殖中占据十分重要的地位。而由鲫鱼 进化而成的金鱼，因其易于饲养、身姿奇异、色彩绚丽，深受人们的喜爱。
[0003] 然而1992年秋和1993年春，日本西部养殖金鱼发生疱疹病毒性造血器官坏死病大 流行，死亡率几乎达到100%，这是有关鲤疱疹病毒II型（CYHV-II)的首次报道(Jung SJ etc，1995)。随后在美国（GroffJ M etc，1998)、澳洲、新西兰、欧洲等世界各国也陆续有该 病发生。1995年我国台湾进口的亲本金鱼导致繁殖金鱼鱼苗爆发性疾病，死亡率高达95 % (Chang P Η 6化，1999)。2011年0￥!^-11首次在匈牙利养殖的银鲫体内被检测到后，感染异 育银鲫的报道陆续增多。我国在2012年首次报道了异育银鲫感染病例，随后陆续在江苏、北 京、广州、武汉等地养殖的异育银鲫中也检测到了 CYHV-II，证实该病毒在我国已有较广泛 的分布(李刚娟等，2013)。异育银鲫是江苏水产养殖的主导产业，该病自射阳部分水产养殖 场出现后，蔓延至大丰、盐城、扬州等主要水产养殖区域，仅2012年全省鲫鱼受灾面积约45 万亩，其中绝收塘口面积约2.38万亩，由此造成的水产品损失约2.96万吨，直接经济损失达 4亿元人民币，给江苏鲫鱼养殖业带来沉重打击。2014年，CYHV-II导致仅江苏省异育银鲫主 养殖区的经济损失就高达30亿元以上。
[0004] 虽然CYHV-II仅感染金鱼、鲫鱼及其普通变种，但其具有较高的传染性，鱼卵、鱼 苗、成鱼和亲鱼均可感染（Hedrik等，2006)，但更易于引起小于1龄幼鱼的爆发性死亡 (Groffet al，1998)，且被证实有垂直传播的现象(Goodwin,2009)。该病主要发生在春秋季 节，水温15-25°C易发病（Jung etc，1995 ;Groffetc，1998)。目前对CYHV-II相关研究较少， 且大多集中于流行病学和分子生物学诊断方法，缺乏有效的防治手段。
[0005] 双链核糖核酸(dsRNA)能够高效特异性地抑制目的基因的表达，且抑制效率远高 于单链RNA，这种效应称之为RNAinterference(RNAi)。科学家在不同物种里面均发现RNAi 效应表明RNAi是在大部分真核生物里都存在的一种保守作用机制。目前RNAi技术已被广泛 应用于基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域，在人类病毒性疾病领域的研究证 实，RNAi能够胜任许多病毒病的基因治疗，未来或将成为一种有效的抗病毒治疗手段。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种CYHV-II的dsRNA，能够防止CYHV-II侵害鲫(金)鱼。 [0007]为实现上述发明目的，本发明提供的dsRNA的单链核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所 不。
[0008] 本发明还提供一种获得所述dsRNA的方法，是以CYHV-II基因组为模板，设计引物 扩增得到SEQ ID N0.2所示的核苷酸，并通过构建基因工程菌表达SEQ ID N0.2所示的核苷 酸，再从基因工程菌中提取得到所述dsRNA。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，以Escherichia coli HT115(DE3)为宿主表达得到 所述dsRNA。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，在SEQ ID NO.2所示的核苷酸片段的两端分别连接 T7启动子，连接L4440质粒后转化Escherichia coli HT115(DE3)菌株，构建得到表达所述 dsRNA的基因工程菌。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，在SEQ ID N0.2所示的核苷酸片段的两端分别连接 T7启动子，连接L4440质粒后转化Escherichia coli HT115(DE3)菌株，构建得到表达所述 dsRNA的基因工程菌;将活化培养后的基因工程菌接种到LB培养基中，37°C、200rpm振荡培 养至0D6QQ = 0.5，加入IPTG终浓度至0.5mM，继续培养6h;采用Tr i zol法提取菌体总RNA，并使 用RNaseA消化掉单链RNA。
[0012] 本发明还提供一种防治CYHV-II感染的疫苗，所述疫苗的有效成分包括核苷酸序 列如SEQ ID NO. 1所示的dsRNA。
[0013] 将本发明提供的dsRNA通过腹腔注射途径免疫接种鲫鱼，对鲫鱼的免疫保护率是 100% ;dsRNA注射鲫鱼免疫后10天进行攻毒，攻毒CYHV-II的免疫保护率为63.9% ;dsRNA免 疫金鱼后3天攻毒，免疫保护率为55% ;可见本发明提供的dsRNA确实能起到抵抗CYHV-II侵 害的作用，且免疫保护能力优秀，具有很大的应用潜力。
【附图说明】
[0014] 图1为dsRNA表达菌株诱导表达后提取的RNA的琼脂糖凝胶电泳图；泳道M:Marker 泳道1:提取的RNA。
[0015] 图2为dsRNA免疫鲫鱼后立即攻毒的免疫保护率。
[0016]图3为dsRNA免疫鲫鱼10天后攻毒的免疫保护率。
[0017]图4为dsRNA免疫金鱼后3天攻毒的免疫保护率。
【具体实施方式】
[0018] 实施例1: dsRNA表达菌株的构建
[0019] 1、SEQ ID N0:2基因片段的获得和表达质粒的构建
[0020]病毒核酸提取试剂盒(TAKARA)提取病料病毒基因组(病料样品采集于江苏省大丰 渔场），-20°C冻存备用。以病毒基因组为模板，以序列分别SEQIDN0.3、SEQIDN0.4的引 物，PCR合成SEQIDN0.2所示的序列。
[0021] TIANGEN公司胶回收试剂盒回收上述基因片段，HindIII、XholI对片段和质粒 L4440进行双酶切，酶切片段T4连接酶连接，转化到大肠杆菌ToplO中，筛选转化子提取质粒 并进彳丁测序鉴定，重组质粒命名为L_23a。
[0022] 2、dsRNA表达菌株的构建
[0023]制备HT115(DE3)感受态细胞，具体方法同常规大肠杆菌感受态制备方法。表达质 粒L-23a采用CaCl2法转入HT115(DE3)中，PCR筛选得到表达菌株htL23a。同时构建空载体对 照表达菌株htL4440。
[0024] 实施例2:dsRNA的表达和提取
[0025] 活化菌株htL23a 1:100加入LB培养基中（150ng/ml Amp)，37°C200rpm振荡培养 OD600 = 0 · 5，加入IPTG终浓度至0 · 5mM，继续培养6h。测定0D_后，采用Trizol法提取菌体总 RNA(见图1)，提取的总RNA使用RNaseA消化掉单链RNA。对照组htL4440dsRNA提取方法同上。
[0026] 实施例3: dsRNA免疫鲫鱼后立即攻毒的免疫保护率
[0027] 体长15cm的健康鲫鱼配以循环水处理和净化系统，养殖水温维持23_25°C。暂养10 天后，随机分组，每组15尾，设置2个平行水槽。将制备的dsRNA和CYHV-II病毒混合后采用腹 腔注射的方法免疫。注射dsRNA剂量为1. Oyg/尾，其来源的原始菌量为5 X 107CFU。阴性对照 组注射无菌PBS(磷酸缓冲盐溶液）。观察统计各组死亡数(见图2)，待各组累计死亡率稳定 后，计算每组免疫保护率(见表1)。
[0028] 按照下列公式计算免疫保护率:免疫保护率(RPS) % =(对照组死亡率-免疫组死 亡率)/对照组死亡率X 100%。
[0029] 表1 dsRNA混合CYHV-II注射鲫鱼后的免疫保护率
[0030]
[0031] 从上表可以看出，对免疫后立即攻毒的鲫鱼来说，实施例2获得的dsRNA(htL23a) 对鲫鱼的免疫保护率是100%，证明dsRNA确实能起到抵抗CYHV-II侵害的作用，且免疫保护 能力优秀，具有很大的应用潜力。
[0032] 实施例4: dsRNA免疫鲫鱼后10天攻毒的免疫保护率
[0033] 鲫鱼的分组和饲养，dsRNA注射剂量均同实例3 dsRNA注射免疫后10天进行攻毒， 观察统计各组死亡数(见图3)，待各组累计死亡率稳定后，计算每组免疫保护率(见表2)。 [0034] 表2 dsRNA注射鲫鱼10天后攻毒的免疫保护率
[0035]
[0036] 从工衣κι 以有qq，头删 yijz撕守丄叹，口，攻毒CYHV-II的 免疫保护率为63.9%。虽然对比免疫后立即攻毒的免疫保护率有所下降，但对CYHV-II仍有 较好的抵抗能力，可以明显降低鲫鱼的死亡率。并且在以后改进免疫程序后，存在很大的可 能进一步提升免疫保护率。
[0037] 实施例5: dsRNA免疫金鱼后3天攻毒的免疫保护率
[0038]健康金鱼配以循环水处理和净化系统，养殖水温维持23-25°C。暂养10天后，随机 分组，每组10尾，设置2个平行水槽。免疫注射dsRNA剂量为200ng/尾，阴性对照组注射无菌 PBS。观察统计各组死亡数17天(见图4)，计算每组免疫保护率(见表3)。
[0039] 表3 dsRNA注射金鱼3天后攻毒的免疫保护率
[0040]
[0041] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种dsRNA，其特征在于，单链核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。2. -种编码权利要求1所述dsRNA的DNA。3. 含有权利要求2所述DNA的载体或重组细胞。4. 一种表达权利要求1所述dsRNA的基因工程菌，其特征在于，以Escherichia col i HT115(DE3)为宿主，以L4440质粒为表达载体。5. -种获得权利要求1所述dsRNA的方法，其特征在于，是通过构建基因工程菌表达SEQ ID NO.2所示的核苷酸，再从基因工程菌中提取得到所述dsRNA。6. 根据权利要求5所的方法，其特征在于，以Escherichia coli HT115(DE3)为宿主。7. 根据权利要求5所的方法，其特征在于，在SEQ ID NO. 2所示的核苷酸片段的两端分 别连接T7启动子，连接L4440质粒后转化Escherichia coli HT115(DE3)菌株，构建得到表 达所述dsRNA的基因工程菌。8. 根据权利要求7所的方法，其特征在于，将活化培养后的基因工程菌接种到LB培养基 中，37°C、200rpm振荡培养至0D_ = 0.5，加入IPTG终浓度至0.5mM，继续培养6h;采用Trizol 法提取菌体总RNA，并使用RNaseA消化掉单链RNA。9. 权利要求1所述dsRNA在制备用于治疗或预防鲤疱疹病毒II型感染的药物中的应用。10. -种疫苗，其特征在于，有效成分包括核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的dsRNA。
【专利摘要】本发明公开了一种鲤疱疹病毒II型的dsRNA及其应用，属于水产养殖技术领域。本发明从CYHV-II基因组中筛选得到了一段核苷酸序列，通过构建基因工程菌，表达得到相应的dsRNA，以所得dsRNA免疫鲫鱼、金鱼，能够有效保护鱼免受CYHV-II的侵害；具有巨大的市场应用价值。
【IPC分类】A61K31/713, A61K48/00, C12N15/113, A61P31/22, C12N15/70
【公开号】CN105567693
【申请号】CN201610109702
【发明人】不公告发明人
【申请人】江苏海健前沿生物科技有限公司
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年2月26日