一种鲤春病毒标准样品及其制备方法
【专利摘要】本发明公开一种鲤春病毒标准样品的制备方法，其通过选用鲤春病毒株SVCV-DL进行标准品的制备，经过毒株的鉴定、标准样品的制备，即通过病毒的增殖后收获病毒培养物，再经过冻干工艺，选用由海藻糖、脯氨酸、脱脂奶粉和去离子水制备的冻干保护剂，选用特定的冻干工艺制备鲤春病毒标准样品。最后通过均匀性和稳定性检查、定性检定、定值等项工作获得本标准样品的研制成功，不仅为检测研究、医药研究、应用研究提供了标准样品的需求，同时为检验检疫机构技术指导、服务出口企业提供技术上的支持。
【专利说明】—种鲤春病毒标准样品及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于检测用病毒培养物标准品及其制备方法【技术领域】，具体涉及鲤春病毒标准样品及其制备方法。
【背景技术】
[0002]我国是世界上最大的水产品生产和输出国，目前，我国水产品总量已占全球渔业总产量的40%，连续15年居世界首位，养殖水产品产量占世界养殖总产量的70%。水产品在保障国家粮食安全、促进农民增收和农村经济稳步发展中发挥了重要作用。我国水海产品出口面临的壁垒主要为绿色壁鱼，如日本的“肯定列表制度”、欧盟的《欧盟食品及饲料安全管理法规》及有关法令、美国的《最严谨的水产养殖规范》(BAP)等，欧盟启动了对我国进口人工养殖海产品的审查；韩国政府也禁止我国34家水产养殖企业向韩国出口鱼类等水产品，严重制约了我国水产品的出口增长。
[0003]鲤春病毒病(又称鲤鱼传染性腹水症)是由鲤春病病毒(SVC)感染而引起鲤鱼科的一种急性、出血性传染性病，是对水产养殖业危害较大的一种传染性疫病。也是我国动物防疫法规定的一类动物疫病，OIE将其列为需要向OIE申报的疫病。该病原广泛存在，传播速度快，潜伏期短，死亡率高，可导致整个鱼塘毁灭性打击，且该病毒传播快且比较难控制疫情，是水生动物检疫中严格检验控制的病毒。鲤春病毒血症的流行地域广，流行于欧洲、中东和俄罗斯，主要有奥地利、匈牙利、保加利亚、法国、德国、英国、意大利、西班牙以及捷克、斯洛伐克、俄罗斯等，近几年逐步蔓延到美洲和亚洲。该病是鱼类口岸检疫的第一类检疫对象，可引起各国的贸易摩擦和巨大的经济损失。1998年英国从北京进口一批观赏鱼中检出含有鲤春病病毒，并以此要求中国对所有出口观赏鱼饲养场进行两年以上的净化及SVC监测，直至保证没有SVC，方可向英国出口。随后，中国观赏鱼出口的传统市场法国、意大利、西班牙、比利时、日本和新加坡等也相继提出了类似要求。后经英国有关专家证实，北京并未发现任何SVC感染情况。但是，我国却为此损失创汇I亿多元，而且全国的观赏鱼产业从此一落千丈。2002年美国北卡罗来纳州发生该病导致15万尾锦鲤的损失，同年6月美国威斯康星州的野生鲤鱼也大量发病。2003、2005、2007年英国在本地均检出SVCV。中国养殖鲤鱼占淡水鱼21%，养殖历史悠久，但未见该病暴发的正式报道，该病一旦发病，将给我国养殖渔业以沉重的打击。
[0004]由于养殖生态环境恶化，疾病预防意识差，滥用药物普遍，水生动物种苗质量不高，防疫体系不健全等原因导致水生动物发病。系统内送检鱼的样品通常眼观来看都比较健康，而鲤春病毒通常只有在适宜的温度下才能发病，而且现在用的PCR方法只能从重度感染表现出临床症状的鱼中检出病毒，无法检测潜在的病毒。随着进出口贸易的增大，检验流程时限要求缩减，鱼类疫病多数要上细胞进行先增殖，而普通的水生动物疫病实验室很难得到该病毒，对实验室的质量控制 及研究带来了极大的挑战。
【发明内容】
[0005]为解决上述技术问题，帮助实验室建立好的质量保证，辽宁出入境检验检疫局从2006年就开始从事水生动物疫病及标准样品的研究工作，成立了研制标准样品工作小组，由辽宁出入境检验检疫局制备测试样品，使用的鲤春病毒株SVCV-DL来源于日常搜集样品。进行了原材料的选取、标准样品的制备、均匀性和稳定性检查、定性检定、定值等项工作。
[0006]本标准样品的研制成功，不仅为检测研究、医药研究、应用研究提供了标准样品的需求，同时为检验检疫机构技术指导、服务出口企业提供技术上的支持。
[0007]本发明的一方面在于:公开一种鲤春病毒标准样品的制备方法，其包括以下操作步骤:
[0008]a.病毒的增殖
[0009]选长满单层的EPC细胞，倒掉培养液，接种SVC病毒液；于15°C吸附2小时；补加M199维持液，继续培养至细胞病变达到80%以上，收获病毒培养物，于_20°C保存备用；
[0010]b.冻干工艺
[0011]冻干保护剂为:按以下组分和重量体积比配制而成:海藻糖:去离子水为5%，脯氨酸:去离子水为5%，脱脂奶粉:去离子水为10% ；
[0012]冻干工艺为:取步骤a中病毒培养物与冻干保护剂按等体积比均匀混合，于_30°C中预冻24h后，移至冻干机中，保持真空度在30~40mtorr间，真空干燥24h，即为鲤春病毒标准样品。
[0013]对于上述技术方案中，所述的鲤春病毒标准样品的制备方法，其步骤a所述收获病毒培养物为:待EPC细胞感染SVC病毒后脱落，出现细胞病变后反复冻融细胞培养物三次，于4°C, 10000r/min离心IOmin制备获得。
[0014]对于上述技术方案中，所述的鲤春病毒标准样品的制备方法，其步骤b所述冻干保护剂经过108°C，15min灭菌。
[0015]对于上述技术方案中，所述的鲤春病毒标准样品的制备方法，其步骤a所述收毒的病毒滴度通过Karber法测定，TCID50值为10_6 7 525/ 0.1ml。
[0016]本发明的另一方面在于，保护一种利用上述技术方案中所述方法制备的鲤春病毒标准样品。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]本发明附图4幅，
[0018]图1 =SVCV目的片段外套引物扩增PCR电泳图；M:DL2000 Marker ；1:F1/R2扩增产物；大小约为714bp ；
[0019]图2 =SVCV目的片段内套引物扩增PCR电泳图；M:DL2000 Marker ；1:F1/R4扩增产物;2:阴性；
[0020]图3:鲤春病毒糖蛋白核酸序列对比图；
`[0021]图4 =Neighbor Joining方法作系统发育树；图中所示本鲤春病毒株SVCV-DL (图中以lcll22631为简称)与S30病毒株亲缘关系最近，为一个分支。
【具体实施方式】[0022]下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0023]本发明中使用的EPC细胞系(全称鲤上皮乳头状瘤细胞系)由ATCC购买；M199培养基为Gibco公司产品；胎牛血清购自杭州四季青生物工程公司。感受态细胞E.coli JM109、PCR试剂盒、分子量标准DL-2000、DNA快速纯化回收试剂盒、DNA片段的连接转化试剂盒等均为TaKaRa公司产品；氨苄青霉素(Amp)为上海生工生物工程有限公司产品；其余试剂均为分析纯产品。
[0024]实施例1鲤春病毒标准样品的制备
[0025]一.病毒的鉴定
[0026]将辽宁出入境检验检疫局日常收集的鱼病病料组织(毒株来源于样品)，根据OIE和《GB/T15805.5-2008鱼类检疫方法第5部分:鲤春病毒(SVCV)》方法进行前处理，并进行RT-PCR检测。
[0027]RNA的提取
[0028]①Trizol法提取病毒RNA:
[0029]②取3个1.5mL灭菌EP管，病毒样品2个，阴性对照I个，并对每个管进行编号。
[0030]③每管加入600 μ L裂解液，样品200 μ L ;再加入200 μ L氯仿，混匀器上震荡混匀5s。于 4°C条件下，12000r/min 离心 15min。
[0031]④再取相同个数的EP管，加入-20°C预冷的异丙醇500 μ L，对每个管进行编号。取离心后上清至少500 μ L,颠倒混匀。于4°C条件下，12000r/min离心15min。
[0032]⑤轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，吸干液体。加入600 μ L75%乙醇，颠倒洗涤。于4°C条件下，12000r/min 离心` lOmin。
[0033]⑥轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，吸干液体。4000r/min离心10s。
[0034]⑦用微量加样器尽吸干液体，室温干燥3min。
[0035]⑧加入11 μ L DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，冰上保存备用。
[0036]RT 反应:
[0037]①解二级结构:在PCR管中，加入如下体系:
[0038]RNA 模板 IOyL
[0039]Rl3 μ L
[0040]DEPC 水 2 μ L
[0041 ] 总体积15 μ L。70°C加热5min后，立即冰浴。
[0042]②合成cDNA:在上述管中，加入如下体系:
[0043]
?.V 5 X Buffer5 μ L
ΛΤΡη2μ 1.HEP (201:)I μ L
DEFC 水I μ L
MLV〗μ L[0044]总体积25 μ L。40°C加热 60min。
[0045]PCR反应:在上述管中加入如下体系:
[0046]
【权利要求】
1.一种鲤春病毒标准样品的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤: a.病毒的增殖 选长满单层的EPC细胞，倒掉培养液，接种鲤春病毒的病毒液；于15°C吸附2小时；补加M199维持液，继续培养至细胞病变达到80%以上，收获病毒培养物，于_20°C保存备用； b.冻干工艺 冻干保护剂由以下组分按重量体积比配制而成，海藻糖:去离子水为5%，脯氨酸:去离子水为5%,脱脂奶粉:去离子水为10% ； 冻干工艺为:取步骤a中病毒培养物与步骤b中的冻干保护剂按等体积比均匀混合，于_30°C中预冻24h后，移至冻干机中，保持真空度在30~40mtorr间，真空干燥24h，即为鲤春病毒标准样品。
2.根据权利要求1所述的鲤春病毒标准样品的制备方法，其特征在于步骤a所述收获病毒培养物为:待EPC细胞感染SVC病毒后脱落，出现细胞病变后反复冻融细胞培养物三次，于4°C, 10000r/min离心IOmin制备获得。
3.根据权利要求1所述的鲤春病毒标准样品的制备方法，其特征在于步骤b所述冻干保护剂经过108°C，15min灭菌。
4.根据权利要求1所述的鲤春病毒标准样品的制备方法，其特征在于步骤a收获病毒培养物的 TCID5tl 值为 10 -67 525 / 0.1ml。
5.一种利用权利要求1所述方法制备的鲤春病毒标准样品。
【文档编号】C12N7/00GK103555860SQ201310557758
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月7日 优先权日:2013年11月7日
【发明者】吴斌, 肇慧君, 蔡晓萍, 张雪 申请人:吴斌, 肇慧君, 蔡晓萍, 张雪