专利名称：一种鲤疱疹病毒2型的巢式pcr检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及水产养殖动物病原检测领域，更具体涉及一种鲤疱疹病毒2型(Cyprinidherpesvirus 2, CyHV-2)的基因检测试剂盒,适用于水产养殖中鲤疱疫病毒病2型的诊断、进出口检验检疫中鲤疱疹病毒病2型的快速检测。
背景技术：
鲤疱疹病毒2型(CyHV-2)是造成金鱼大量死亡的疱疹病毒性造血器官坏死病(herpesviral haematopoietic necrosis,HVHN)的病原，故也称为金鱼造血器官坏死病毒(goldfish haematopoietic necrosis virus,GFHNV)。按照国际病毒系统分类委员会的系 统命名规则，正式命名为鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2, CyHV-2)0该病毒于1992年秋季和1993年春季因造成日本西部养殖的金鱼大量死亡而被首次发现，其致死率高达100%。该病随后在美国，中国台湾,澳大利亚和英国相继爆发,给金鱼养殖造成了巨大的经济损失。近年来，我国鲫鱼(异育银鲫)主要养殖区的鲫鱼出现了大规模死亡，死亡率达80%以上，经过电镜观察和分子检测，确定病原为CyHV-2。该病传播范围广、传染性强、发病快、致死率高，已给我国鲫鱼养殖业造成了巨大的经济损失，成为我国水产养殖中危害最为严重的病毒性疾病之一。细胞培养分离技术是病毒诊断的有效方法，通常是世界动物卫生组织(OIE)推荐的鱼类病毒检测的首选方法。但现有研究资料表明，CyHV-2很难在现有的鱼类细胞系中增殖。胖头鲤细胞(fathead minnow cells,FHM)、鲤鱼上皮瘤细胞(epithelioma papillosumcyprini, EPC)、獲鱼肾细胞(eel kidney, EK-1)、鲑鱼胚胎细胞(chinook salmon embryo,CHSE-214)、虹鳟鱼性腺细胞(rainbow trout gonad, RTG-2)和罗非鱼卵巢细胞(tilapiaovary，T0-2)均对CyHV-2不敏感。仅锦鲤鳍细胞(koi fin 1，KF-1)能产生特征性的细胞病变效应(CPE)，但可惜的是，病毒在KF-I细胞上传至第3代后，CPE消失。可见目前阶段，细胞培养不是CyHV-2诊断的有效方法，基于病毒基因检测的技术就成为了 CyHV-2最有效的检测方法。聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增技术作为最基本的基因扩增技术，现在广泛应用于分子生物学的各个领域，在病毒鉴定领域也得到了广泛的应用。然而其扩增结果受限于检测对象的模板含量，当模板量很少时，常常获得阴性结果。在鱼病学领域，患病鱼体内的病毒量通常很低，使用传统的常规PCR检测技术通常由于其灵敏度不够而出现假阴性结果，无法满足水产养殖病害诊断以及口岸检疫工作的需要。巢式PCR扩增技术是一种建立在常规PCR技术上的新技术，其设计两套PCR引物(巢式引物)对模板进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，以此扩增产物作为模板用内引物进行第二轮扩增。由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性(因为与两套引物都互补的模板很少)因而增加了检测的敏感性，同时又有两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。目前未见CyHV-2的巢式PCR试剂盒的报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是在于提供了一种鲤疱疹病毒2型的巢式PCR检测试剂盒，本发明操作简单，方便快捷，检测限低，灵敏度高，检测结果准确可靠。本发明以抽提自患病鱼组织的病毒DNA作为PCR扩增模板，用两对嵌套式引物对模板DNA进行扩增，可以在较短时间内完成整个PCR检测，不但极大地提高了检测灵敏度，而且缩短了检测时间，且结果准确可靠，是一种有效的鲤疱疹病毒2型分子生物学检测方法。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案一种鲤疱疹病毒2型的巢式PCR检测试剂盒，包括盒体，盒内衬垫上放置6个盛有试剂的I. 5mL离心管，包括IOX反应缓冲液，Taq酶(1U/μ L)，引物Pl (含CyHV_2PlF、CyHV-2PlR各 10 μ Μ)，引物 P2 (含 CyHV-2P2F、CyHV_2P2R各 10 μ Μ)，纯水(分子生物学级)，阳性0嫩(1(^8/!1^)。 所述的IOX 反应缓冲液的配方为Tris-HCl IOOmM, KCl 500mM, MgC1215mM,dNTPs2mM。所述的Tris-HCl为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐；KC1为氯化钾；MgCl2为氯化镁；dNTPs为合成DNA所需的四种脱氧核苷酸的等体积混合液。上述各种液体试剂分别装在I. 5mL离心管中，置于盒内。所述的引物核苷酸序列为CyHV-2PlF 为TGAAATGTCAAAAGTGGATGGCyHV-2PlR 为TATTCCCAGACAGCCTTCAAACyHV-2P2F 为GAACACCGCTGCTCATCATCCyHV-2P2R 为ACTCTTCGCAAGTCCTCACC一种鲤疱疹病毒2型的巢式PCR检测试剂盒，其检测步骤是I)检测前检测样本DNA的提取取适量濒死的患病鱼鰓丝、脾脏、肾脏组织，用玻璃匀浆器匀浆，5000rpm于4°C离心10分钟，取适量匀浆上清液用DNA提取试剂提取DNA。2)外引物Pl的PCR扩增制备PCR反应体系20 μ L :10XPCR反应缓冲液2 μ L，Taq酶(1U/μ L)1 μ L，外引物Ρ10. 5 μ L，DNA模板4 μ L，纯水补足至20 μ L。同时取阳性对照DNA模板做阳性对照，取纯水做阴性对照。PCR反应条件为94°C预变性5分钟，94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸40秒，30个循环后72 °C 5分钟。3)内引物P2的PCR扩增取I μ L外引物Pl的扩增产物作为模板，以内引物Ρ2为弓丨物进行PCR扩增，其他反应成分和反应条件同第一次扩增。4)扩增产物检测与分析2%(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测目的条带并成像分析。5)结果判定A.当检测样本和阳性对照的扩增条带大小一致，为357bp时，结果为阳性；B.当检测样本无条带或条带大小与阳性对照的扩增条带大小不一致，不为357bp时，结果为阴性；C.当阳性对照无条带时，表明试剂盒中相关试剂降解，试剂盒失效；D.当阴性对照出现条带时，操作过程中有试剂污染，检测结果无效。本发明的有益效果是
本发明检测鲤疱疹病毒2型的巢式PCR试剂盒，提供一种检测高致病性的鱼类病毒的分子检测技术，尤其是能快速、简便、准确的检测病原的试剂盒，能在8小时内完成检测。本发明提供了一种依赖PCR的分子检测试剂盒，克服细胞分离培养、电镜超薄切片观察、ELISA检测等病毒诊断方法繁琐、效率低、可靠性差、成本高的不足。该试剂盒能快速、灵敏、准确地检测到病原，并可直接从患病鱼组织中检测到病毒病原。大大简化了检测程序，提高了检测水平，同时为病害防治策略的制定提供了技术依据。通过对鲤疱疹病毒2型的特异性检测，经过外引物CyHV_2PlF和CyHV_2PlR，以及内引物CyHV-2P2F和CyHV_2P2R对目标病毒进行两轮PCR扩增，获得357bp的单一 PCR产物，可以特异的检测目标病毒。但是对于锦鲤疱疹病毒(KHV)、大鲵虹彩病毒(GSIV)、斑点叉尾鮰病毒(CCV)、鳗鱼疱疹病毒(HVA)等4种DNA病毒，均无扩增产物。通过灵敏度的检测，对克隆有目的基因的T载体进行常规PCR和巢式PCR检测比较，发现常规PCR扩增的最低检测限为IO3个拷贝，而巢式PCR最低检测限为10个拷贝。
图I为一种鲤疱疹病毒2型的巢式PCR检测试剂盒的示意图。其中I为盒体，2为衬垫，3为IOX反应缓冲液，4为Taq酶，5为引物P1，6为引物P2，7为纯水，8为阳性DNA。图2是发明实施例患病鱼的CyHV-2检测结果示意图。其中M为Takara DL1000DNA Marker, Γ5为检测样本，6为阳性对照，7为阴性对照。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明的原理与特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例I :一种鲤疱疹病毒2型的巢式PCR检测试剂盒，包括盒体(I )，盒内衬垫(2)上放置6个盛有试剂的I. 5mL离心管，包括IOX反应缓冲液(3)，Taq酶(1U/μ L) (4)，引物Pl (包含 CyHV-2PlF、CyHV_2PlR 各 10 μ Μ) (5)，引物 Ρ2 (包含 CyHV_2P2F、CyHV_2P2R 各 10 μ Μ)
(6)，纯水(分子生物学级)(7)，阳性0嫩(1(^8/!1^) (8)。所述的IOX 反应缓冲液的配方为Tris-HCl IOOmM, KCl 500mM, MgCl215mM,dNTPs2mM。所述的Tris-HCl为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐；KC1为氯化钾；MgCl2为氯化镁；dNTPs为合成DNA所需的四种脱氧核苷酸的等体积混合液。上述各种液体试剂分别装在I. 5mL离心管中，置于盒内。所述的引物核苷酸序列为CyHV-2PlF 为TGAAATGTCAAAAGTGGATGGCyHV-2PlR 为TATTCCCAGACAGCCTTCAAACyHV-2P2F 为GAACACCGCTGCTCATCATC
CyHV-2P2R 为ACTCTTCGCAAGTCCTCACC实施例2 一种鲤疱疹病毒2型的巢式PCR检测试剂盒，包括盒体1，盒内衬垫2上放置6个盛有试剂的1.5mL离心管，包括IOX反应缓冲液3，Taq酶(1U/μ L) 4，引物Pl (包含CyHV-2PlF、CyHV-2PlR 各 10 μ Μ) 5，引物 P2 (包含 CyHV_2P2F、CyHV-2P2R 各 10 μ Μ) 6，纯水(分子生物学级)7，阳性DNAdOy g/mL) 8ο所述的IOX 反应缓冲液的配方为Tris-HCl IOOmM, KCl 500mM, MgC1215mM,dNTPs2mM。所述的Tris-HCl为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐；KC1为氯化钾；MgCl2为氯化镁；dNTPs为合成DNA所需的四种脱氧核苷酸的等体积混合液。所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤 I)检测前检测样本DNA的提取取适量濒死的患病鱼鰓丝、脾脏、肾脏组织，用玻璃匀浆器匀浆，5000rpm于4°C离心10分钟，取适量匀浆上清液用DNA提取试剂提取DNA。2)外引物Pl的PCR扩增制备PCR反应体系20 yL :10XPCR反应缓冲液2 μ L，Taq酶(1U/μ L)1 μ L，外引物Ρ10. 5 μ L，DNA模板4 μ L，纯水补足至20 μ L。同时取阳性对照DNA模板做阳性对照，取纯水做阴性对照。PCR反应条件为94°C预变性5分钟，94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸40秒，30个循环后72 °C 5分钟。3)内引物P2的PCR扩增取I μ L外引物Pl的扩增产物作为模板，以内引物Ρ2为弓丨物进行PCR扩增，其他反应成分和反应条件同第一次扩增。4)扩增产物检测与分析2%(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测目的条带并成像分析。5)结果判定E.当检测样本和阳性对照的扩增条带大小一致，为357bp时，结果为阳性；F.当检测样本无条带或条带大小与阳性对照的扩增条带大小不一致，不为357bp时，结果为阴性；G.当阳性对照无条带时，表明试剂盒中相关试剂降解，试剂盒失效；H.当阴性对照出现条带时，操作过程中有试剂污染，检测结果无效。实施例3 对5个自然感染的患病鱼组织样本的检测随机抽取患典型病症的鲫鱼，取适量鰓组织于玻璃匀浆器匀浆，取匀浆上清液O. 25mL用DNAzol提取病毒DNA模板，用试剂盒中的试剂进行巢式PCR检测。检测结果用1%(W/V)琼脂糖凝胶电泳及成像系统分析。结果表明(附图2)，所检测的5个鲫鱼样本均为CyHV-2阳性，此结果和电镜超薄切片观察结果完全一致。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本实施，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.ー种鲤疱疹病毒2型的巢式PCR检测试剂盒，其特征在于盒体(I)内衬垫(2)上放置6个盛有试剂的I. 5mL离心管，包括IOX反应缓冲液含Tris-HCl IOOmM, KCl 500mM,MgCl2 15mM, dNTPs 2mM (3)，Taq 酶 IU/μ L (4)，引物 Pl :含 CyHV-2 P1F、CyHV-2 PlR 各10yM(5)3|_P2:*CyHV-2 P2F、CyHV-2 P2R#10yM (6)，纯水(7)，阳性 DNA 10 μ g/mL (8)；上述各种液体试剂分别装在1.5mL离心管中，置于盒内。
2.根据权利要求I所述的ー种鲤疱疹病毒2型的巢式PCR检测试剂盒，其特征在于所述的引物核苷酸序列为 CyHV-2 PlF 为TGAAATGTCAAAAGTGGATGGCyHV-2 PlR 为TATTCCCAGACAGCCTTCAAACyHV-2 P2F 为GAACACCGCTGCTCATCATC CyHV-2 P2R 为ACTCTTCGCAAGTCCTCACC。
全文摘要
本发明公开了一种鲤疱疹病毒2型的巢式PCR检测试剂盒，其特征在于盒体(1)内衬垫(2)上放置6个盛有试剂的1.5mL离心管，包括10×反应缓冲液含Tris-HCl100mM，KCl500mM，MgCl215mM，dNTPs2mM(3)，Taq酶1U/μL(4)，引物P1含CyHV-2P1F、CyHV-2P1R各10μM(5)，引物P2含CyHV-2P2F、CyHV-2P2R各10μM(6)，纯水(7)，阳性DNA10μg/mL(8)。外引物P1的序列为CyHV-2P1FTGAAATGTCAAAAGTGGATGG，CyHV-2P1RTATTCCCAGACAGCCTTCAAA；内引物P2的序列为CyHV-2P2FGAACACCGCTGCTCATCATC，CyHV-2P2RACTCTTCGCAAGTCCTCACC。经过内外引物的两轮扩增，最终可获得357bp的DNA产物。本发明操作简单，方便快捷，检测限低，灵敏度高，检测结果准确可靠。
文档编号C12R1/93GK102851403SQ20121037883
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者徐进, 张辉, 曾令兵 申请人:中国水产科学研究院长江水产研究所