专利名称：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)疫苗重组蛋白抗原FnbA1的纯化方法
技术领域：
本发明属于生物技术制药领域，涉及一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)疫苗重组蛋白抗原FnbAl的纯化方法。
背景技术：
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)局部感染经久不愈，全身感染死亡率高达20%。自1961年被首次发现，目前已成为全球ICU病房、烧伤、战创伤等感染率最高的病原菌之一。MRSA因其传播途径广泛，易暴发流行，又由于其致病性强，呈多重耐药而成为临床上治疗的难点及重要的生物战剂，被称为“超级细菌”，当前MRSA已与乙型肝炎、AIDS被列为世界三大最难解决的感染性疾病，并位居首位。万古霉素被认为是治疗MRSA的最后一道防线，但2002年以来耐万古霉素的MRSA相继被分离出来，使MRSA即将面临无抗生素可治的严峻挑战。目前，在我国各大医院，由于抗生素的滥用，MRSA的分离检出率逐年上升，已由1978年的5%发展到2009年的79%，且菌群的毒力基因改变明显，并且耐万古霉素的金葡菌也呈蔓延趋势。基于这种严峻形势，我国已将MRSA列为21世纪可能对国人卫生健康有重大影响的12种病原微生物之一。2010年“中国MRSA院内感染诊治策略新进展”会议资料显示，我国内地医院院内感染发生率约为8%，全国每年因医院感染造成的直接损失超过150亿元。因此，加强对MRSA感染的防治研究已迫在眉睫，研制安全、有效的新型MRSA疫苗将对有效控制MRSA耐药性蔓延和临床MRSA广泛感染具有重大应用价值。美国研发的MRSA疫苗已进入III期临床试验，研发具有自主知识产权、高效、安全、经济的MRSA疫苗对有效控制MRSA耐药性蔓延和临床MRSA广泛感染，提升我国的国际竞争力具有重要意义。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抗原组分复杂，且含量较低，直接从全菌中分离纯化出保护性抗原的难度较大，方法繁琐，不利于疫苗的产业化制备。利用基因工程技术将菌体有效的保护性抗原进行克隆表达使MRSA疫苗研制的可行性大大提高。金黄色葡萄球菌表面的粘附素是一类能够介导细菌粘附于寄主细胞表面进而引发疾病的膜蛋白，其中纤连蛋白结合蛋白A(FnbA)是重要的粘附素之一，编码基因具有高度保守性，是MRSA疫苗重要的候选抗原。它能够介导金黄色葡萄球菌结合于细胞表面的纤连蛋白，使细菌黏附于寄主细胞表面，促进细菌对寄主组织的入侵，目前分离到的大多数金黄色葡萄球菌都能够与细胞外基质上的纤连蛋白特异性的结合。申请人:采用生物信息学的方法从FnbA中预测出了一段活性片段FnbAl，通过克隆表达并纯化后，动物试验证明可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好的免疫保护作用。FnbAl具有序列表I所述的核苷酸序列和序列表2所述的氨基酸序列。
发明内容
本发明旨在针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组蛋白抗原(FnbAl)制备中的抗原蛋白纯化，，提供一种工艺简捷、所获得目标蛋白纯度高、回收率较好的纯化工艺和方法。为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案。一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌疫苗重组蛋白抗原的纯化方法，包含步骤收集发酵的表达FnbAl的工程菌后，按照高压破菌、离心，硫酸铵分步沉淀，GST亲和层析、PP酶切，离子交换层析、凝胶过滤层析技术的顺序组合对制备的抗原进行纯化。步骤具体为I)高压破菌将收集的抗原的菌体以pH为7. 0-7. 5的10_20mM PBS缓冲液混匀 悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，高速离心，收集上清；2)硫酸铵分步沉淀4°C搅拌条件下，上清中缓慢加入终浓度为30%的硫酸铵，搅拌半小时以上，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集上清，上清中继续缓慢加入终浓度为40%的硫酸铵，搅拌半小时以上，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集沉淀；3)沉淀复溶称量沉淀湿重，按重量体积比为1: 10比例加入pH为7. 0-7. 5的10-20mM的PBS缓冲液，搅拌混匀10-15分钟，10000_15000g高速离心20分钟以上，收集上清；4) GST亲和纯化选择GST亲和层析填料进行初步纯化，使用roSpH7. 0-7. 5的条件下对目标蛋白进行纯化，Prescission Protease酶进行酶切洗脱；5)离子交换层析纯化步骤4)收集的样品，pH调至9.0，使用pH为9. 0、10 50Tris、0 O.1MNaCl的Tris缓冲液平衡层析系统及离子交换层析柱，然后采用pH为9. O、
10 50Tris0. 5 IMNaCl 的 buffer 梯度洗脱；6)疏水层析纯化将步骤5)纯化获得的样品，按1:1的比例与pH为7. 5的20mMPB，3M (NH4)2SO4混合，采用缓冲液pH为7. 5的lOmMPB，1. 5M (NH4)2SO4平衡层析系统和疏水层析柱后上样，采用pH为7. 5的IOmM PB梯度洗脱，去除痕量非目标蛋白等杂质，分离纯化目标蛋白。7)脱盐采用PBS平衡脱盐柱，将步骤6)纯化获得的样品通过脱盐柱置换缓冲液。优选地，步骤I)采用生产或中试纯化中的60_80MPa高压匀浆破菌技术，高速离心
获取破菌上清。优选地,步骤2)和步骤3)硫酸铵分步沉淀再复溶。优选地，步骤4)所述的GST亲和纯化所使用的填料为GST-Sepharose4B、GST-Sepharose 6B> GST-Sepharose FastFlow、GST-Sepharose HP 之一。优选地,步骤4)所使用的Prescission Protease酶带有GST标签，以利于去除Prescission Protease 酶。优选地，步骤5)所使用的离子交换层析填料为Q HP,RESOURCE Q、Q FF、Adhere之
ο优选地,步骤6)所述的凝胶层析柱为Superdex75、Superdex 200、Superdex HR10/30 之一。本发明所述抗原是通过以下步骤制备的I)设计正向引物和反向引物通过PCR扩增或全基因合成以获得编码FnBAl蛋白活性片段的核酸序列；
2)将步骤I)所获得的核酸序列克隆至表达载体构建重组载体，然后将该重组载体转化至宿主菌；3)诱导转化后的宿主菌表达重组蛋白。本发明的有益效果是本发明采用的此纯化方法，从表达耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)重组基因工程疫苗候选抗原(本申请中命名为FnbAl)的大肠杆菌工程菌中可以获得纯度大于98%的FnbAl，得率50%以上，整个纯化过程无需额外置换缓冲液。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌疫苗重组蛋白抗原FnbAl为采用生物信息学方法，从MRSA的纤连蛋白结合蛋白A中预测出的的活性片段，经大肠杆菌基因工程菌表达获得。通过上述工艺处理不同批次的FnbAl作12% SDS-PAGE，呈现出单一目标蛋白条
带，分子量约为72KD，纯度在98%以上。蛋白等电点在pH4. 5左右。不同FnbAl肽指纹图谱各峰峰数均保持一致，各峰的保留时间均在± IOSec内波动，说明肽图谱重现性好。纯化后的FnbAl与氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂共同注射免疫BalB/C小鼠，发现FnbAl加免疫佐剂组血清中的IgG水平显著高于阴性对照组(PBS组)(P < O. 01)，证明使用本发明纯化方法获得的FnbAl可有效刺激机体产生较高的免疫应答。使用MRSA标准株252 (购自ATCC)感染，发现FnbAl加免疫佐剂组感染率为80%作用，且具有良好的重复性，表明该蛋白片段具有良好的免疫原性和免疫保护性，可用作耐甲氧西林葡萄球菌重组基因工程疫苗的候选抗原。
图1为FnbAl发酵菌体破菌样品SDS-PAGE。在图中，泳道M为蛋白分子量marker，泳道1_2为FnbAl破菌上清。图2为硫酸铵沉淀及GST亲和层析样品SDS-PAGE。在图中，泳道M为蛋白分子量marker，泳道I为40%硫酸铵沉淀后复溶样本，泳道2为PP酶酶切后第一次洗脱样本，泳道3为PP酶酶切后第二次洗脱样本，泳道4为PP酶(Prescission Protease酶)酶切后第三次洗脱样本。图3为离子交换层析图。图中分别列出了 280nm处的紫外吸收值和电导值的变化。图4为离子交换层析样品SDS-PAGE。在图中，泳道M为蛋白分子量marker，泳道1_5为峰I样品，泳道6为峰2样品，泳道7为峰3样品，泳道8为峰4样品。图5为两次疏水层析的层析图。图中分别列出了 280nm处的紫外吸收值和电导值的变化。 图6为疏水层析样品SDS-PAGE。在图中，泳道M为蛋白分子量marker，泳道I为离子交换层析样本，泳道2_3为第二次疏水层析样本，泳道4-7为第一次疏水层析样本。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作详细描述。实施例一抗原FnBAl的制备
本实施例所使用的菌株与各种试剂如下1.菌株金黄色葡萄球菌MRSA-252国际标准株由美国ATCC提供；2.试剂质粒pGEX-6p_2、大肠杆菌菌株XL-lblue为申请人教研室保存，primeSTAR HS DNA Polymerase>DNA Marker、限制性内切酶 BamHI 和 Not1、蛋白Marker为大连TakaRa公司产品；质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒为美国Omega公司产品；细菌基因组提取试剂盒、超薄回收试剂盒以及显色液为天根公司产品；T4DNA Ligase 为 Fermentas 公司产品；谷胱甘妝-琼脂糖凝胶Glutathione Sepharose 4B为美国GE Healthcare公司
女口
广叩ο本实施例的具体步骤如下(一 )耐甲氧西林金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A活性片段FnBAl活性片段的克隆1.首先根据MRSA_252FnBA蛋白全长基因序列，应用生物信息软件进行结构分析，确定需要扩增的FnBAl目的基因片段。所述FnBAl目的基因片段的核苷酸序列如SEQ IDNO :1所不,其蛋白的的氣基酸序列如SEQ ID N0:2所不。2.根据分析结果，采用PCR方法自MRSA-252基因组扩增FnBAl目的基因片段，扩增步骤如下I)设计PCR引物如下，分别为SEQ ID NO :3_4 (下划线示酶切位点碱基序列)FnBAl-F SEQ ID NO 35, -CGCGGATCCATGGGACAAGATAAAGAAGCTGCA-3'BamH IFnBAl-R SEQ ID NO 45' -TTTTCCTTTTGCGGCCGCCTATCCATTATCCCATGTTAATGTAT-3'Not I2)-80°C冷冻库中取出保存的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA-252菌株涂布于MRSA-252专用固体培养基上，于37 °C培养过夜，再挑取单菌落接种于MRSA-252专液体体培养基中培养8个小时，参照细菌基因组抽提试剂盒抽提MRSA基因组。3)以MRSA-252全基因组DNA为模板PCR扩增FnBAl基因片段PCR 体系
权利要求
1.一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)疫苗重组蛋白抗原FnbAl的纯化方法，其特征在于，包含步骤收集制备的所述抗原；按照高压破菌、离心，硫酸铵分步沉淀，GST亲和层析、PP酶酶切，离子交换层析、疏水层析和脱盐的顺序组合对制备的抗原进行纯化。
2.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于1)高压破菌将收集的菌体以PH为7.0-7. 5的10-20mM PBS缓冲液混匀悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，高速离心，收集上清；2)硫酸铵分步沉淀4°C搅拌条件下，上清中缓慢加入终浓度为30%的硫酸铵，搅拌半小时以上，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集上清，上清中继续缓慢加入终浓度为 40%的硫酸铵，搅拌半小时以上，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集沉淀；3)沉淀复溶称量沉淀湿重，按重量体积比为1: 3-10比例加入pH为7. 0-7. 5的 10-20mM的PBS缓冲液，搅拌混匀10-15分钟，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集上清；4)GST亲和纯化选择GST亲和层析填料进行初步纯化，使用PBSpH7. 0-7. 5的条件对目标蛋白进行纯化，Prescission Protease酶进行酶切洗脱；5)离子交换层析纯化步骤4)收集的样品，pH调至9.0，使用pH为9.0，10 50Tris， O O.1M NaCl的Tris缓冲液平衡层析系统及离子交换层析柱，然后采用pH为9. 0,10 50Tris，0. 5 IM NaCl 的 buffer 梯度洗脱；6)疏水层析纯化将步骤5)纯化获得的样品，按1:1的比例与pH为7. 5的20mM PB， 3M (NH4) 2S04混合，采用缓冲液pH为7. 5的lOmMPB，1. 5M (NH4) 2S04平衡层析系统和疏水层析柱后上样,采用pH为7. 5的IOmM PB梯度洗脱，去除痕量非目标蛋白等杂质，分离纯化目标蛋白。7)脱盐采用PBS平衡脱盐柱，将步骤6)纯化获得的样品通过脱盐柱置换缓冲液。
3.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，步骤I)采用生产或中试纯化中的 60-80MPa高压匀浆破菌技术，高速离心获取破菌上清。
4.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，步骤2)和步骤3)硫酸铵分步沉淀再复溶。
5.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，步骤4)所述的GST亲和纯化所使用的填料为 GST-Sepharose 4B、GST-Sepharose 6B、GST-Sepharose FastFlow> GST-Sepharose HP 之一。
6.如权利要求5所述的纯化方法，其特征在于，步骤4)所使用的Prescission Protease酶带有GST标签，以利于去除Prescission Protease酶。
7.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，步骤5)所使用的离子交换层析填料为 Q HP、RESOURCE Q、Q FF、Adhere 之一。
8.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，步骤6)所述的疏水层析柱为phenyl或 butyl ο
9.如权利要求1至8任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述抗原是通过以下步骤制备的I)设计正向引物和反向引物通过PCR扩增或全基因合成以获得编码FnBAl蛋白活性片段的核酸序列；2)将步骤I)所获得的核酸序列克隆至表达载体构建重组载体，然后将该重组载体转化至宿主菌；3)诱导转化后的宿主菌表达重组蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)疫苗重组蛋白抗原FnbA1的纯化方法。FnbA1为采用生物信息学方法，从MRSA的纤连蛋白结合蛋白A中预测出的活性片段，经大肠杆菌基因工程菌表达获得。其纯化步骤为对高密度发酵的FnbA1重组表达菌按照高压破菌、离心，硫酸铵分步沉淀，GST亲和层析、PP酶酶切，离子交换层析、疏水层析和脱盐的顺序组合进行纯化。本发明提供的纯化方法简捷、容易放大、重复性好，所获目标蛋白纯度高，动物试验证明纯化的抗原可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好的免疫保护作用。
文档编号C12N15/31GK102993278SQ20121037884
公开日2013年3月27日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者章金勇, 邹全明, 郭鹰, 冯强, 樊绍文, 卢陆, 董衍东, 敬海明, 顾江 申请人:重庆原伦生物科技有限公司, 中国人民解放军第三军医大学