专利名称：复合菌剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属微生物技术领域，涉及一种复合菌剂及其应用。
背景技术：
水体富营养化已成为困扰世界各国的普遍性环境问题。浮游藻类的大量繁殖导致水华的频繁爆发，严重影响了人类的生活、生产和身体健康，造成了世界范围内的生态灾害，因此，探索控制水华发生的有效途径已迫在眉睫。目前，治理水体富营养化主要是采用物理和化学方法，但这两种方法不仅会消耗大量的财力和物力，而且会在一定程度上破坏生态环境。溶藻菌作为水华和赤潮的防治生物，日益受到 国内外环境工作者的广泛关注。国外对溶藻菌的研究已有数十年的历史，自Geitler报道一种寄生在刚毛藻上的粘细菌以来，陆续有溶藻菌的相关报道，研究重点也逐渐从单一溶藻菌的筛选及溶藻特性研究过渡到菌一藻种群生态学及分子调控机理等方面。目前，国内对溶藻细菌的研究还处于初始阶段，因此，寻找高效溶藻菌对溶藻菌的深入研究及应用具有重要意义。水华鱼腥藻是导致水体富营养化的主要藻种之一，其分布广，能够产生藻毒素，直接和间接危害人类，然截止目前，利用微生物方式控制水华鱼腥藻的研究甚是罕见，利用不同溶藻方式的溶藻菌复合而成的溶藻菌剂更是具有高效溶藻效果的特点。
发明内容
本发明的目的，就是为了提供一种复合菌剂，该复合菌剂可以影响水华鱼腥藻的生长效应和光合色素，从而起到溶藻作用。本发明中的芽孢杆菌SSAL-6和不动杆菌SSAL-8分别从黄化的水华鱼腥藻液中分离筛选获得，芽孢杆菌SSAL-6的分类命名为芽孢杆菌，拉丁文学名为Bacillussp.;已于2012年6月6日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号)保藏，保藏号为CGMCC No. 6195。不动杆菌SSAL-8的分类命名为不动杆菌，拉丁文学名为Acinetobactersp.,已于2012年6月6日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号)保藏，保藏号为CGMCC No. 6196。为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术方案一种复合菌剂，由芽孢杆菌SSAL-6和不动杆菌SSAL-8复合而成，芽孢杆菌SSAL-6和不动杆菌SSAL-8的菌体量之比为I 2 2 I。上述复合菌剂，其中，所述芽孢杆菌SSAL-6和不动杆菌SSAL-8的菌体量之比为
I Io上述复合菌剂的制备方法是，将芽孢杆菌SSAL-6和不动杆菌SSAL-8分别置于200mL LB液体培养基中，在250rpm、37°C下振荡培养12h，至菌悬液OD值为O. 8 1.0，菌体浓度为IO8 109cells/mL时，将芽孢杆菌SSAL-6和不动杆菌SSAL-8复合。上述复合菌剂的制备方法，其中，所述LB液体培养基的组分及配比为酵母提取物，5g ;胰蛋白胨，IOg ；NaCl, IOg ;蒸馏水IOOOmL ；LB液体培养基的pH值为7. 0-7. 2。上述复合菌剂的应用，用于降解水华鱼腥藻。上述复合菌剂的应用，其中，当芽孢杆菌SSAL-6和不动杆菌SSAL-8的菌体量之比为1:1时，复合菌剂对水华鱼腥藻的降解效果随复合菌剂浓度的增大而增加，当复合菌剂的浓度为15%时，对水华鱼腥藻叶绿素a的抑制率达96%。
图1为复合菌剂对水华鱼腥藻的影响电子透射显微镜图；图2为复合菌剂对水华鱼腥藻细胞数的影响示意图；图3为复合菌剂对水华鱼腥藻干重的影响示意图； 图4为复合菌剂对水华鱼腥藻色素吸收光谱的影响示意图；图5为复合菌剂对水华鱼腥藻叶绿素a的影响示意图。
具体实施例方式以下举例说明本发明，但是并不用于限定本发明的保护范围。实施例1复合菌剂对水华鱼腥藻生长效应的影响将芽抱杆菌(Bacillussp.) SSAL-6 和不动杆菌(Acinetobactersp. ) SSAL-8 分别置于200mL LB液体培养基中，250rpm，37°C下振荡培养12h，至菌悬液OD值为O. 8 1.0(菌体浓度为IO8 109cells/mL)时，将芽孢杆菌(Bacillussp.) SSAL-6和不动杆菌(Acinetobactersp.) SSAL-8 复合。水华鱼腥藻培养参照藻类生长抑制实验的标准方法(国家环保部)，采用水生111号无氮培养液培养，pH为7. 5。培养温度30±2°C，连续24h光照，光照强度3000±2001x，
静置培养，每天定期摇动3次。其中，上述的LB液体培养基组分及配比为酵母提取物，5g ;胰蛋白胨，IOg ；NaCl,IOg ;蒸馏水IOOOmL ；LB液体培养基的pH值为7. 0-7. 2。上述的水华鱼腥藻液体培养基组分及配比为磷酸氢二钾(K2HPO4)，O. 075g ;硫酸镁(MgSO4 · H2O), O. 125g ;碳酸钙(CaCO3)，
O.1OOg ;柠檬酸铁(I %水溶液)，O. 5mL ;梓檬酸(I %水溶液)，O. 5mL ;钥酸(I %水溶液)，5滴；氢氧化钠(1%水溶液)，1. 5mL ;蒸懼水，1000mL。在水华鱼腥藻浓度为5X IO4 IX IO5个/mL时，向IOOmL藻液中加入复合菌剂(菌体浓度约为 2X IO9 个 /mL,其中 Bacillussp. SSAL-6 和 Acinetobactersp. SSAL-8 菌体浓度均为 IO8-1O9个/mL)，处理浓度(v/v)梯度为2· 5%、5%、7· 5%、10%、12· 5%和 15%，每组样设3个重复。制备与实验组相同的一系列不同配比的培养液(LB培养液水生111号无氮培养液)，分别用于培养水华鱼腥藻形成对照组。以细胞计数法测定藻体细胞数量、并测定水华鱼腥藻干重。细胞计数方法从接种计时起，每隔24h取样，用计数框进行细胞计数。用移液器取经过超声波破碎仪打碎过的藻液0.1mL于计数框中，在低倍镜下观察，放大倍数40X10，随机取五个视野，数出所看到的细胞数，取其平均值。N= 10XaXSi+/Sft ；a表示每个视野内细胞平均值；Si+R表计数框面积；Sft代表视野面积；N代表每mL中细胞个数。水华鱼腥藻干重测定方法取定量的藻液，离心得藻，加入称量皿，在80°C烘至恒重。不同浓度的复合菌剂对水华鱼腥藻的细胞数的影响的测定结果如图2所示，结果表明水华鱼腥藻细胞的去除效果与复合菌剂的浓度呈现出一定的相关性，即随着复合菌剂浓度的增长，对水华鱼腥藻细胞的去除作用越强。当复合菌剂浓度为2. 5%,5%,7. 5%,10%U2. 5%和15%时，培养24h对水华鱼腥藻细胞的去除率分别为5%、13%、24%、33%、37%和46%，培养168h后分别变为10%,35%,54%, 58%、63%和70%，与对照相比，呈现显著差异(P < O. 05)。不同浓度的复合菌剂对水华鱼腥藻的干重的影响的测定结果如图3所示，结果表明纯LB液体培养基的投入对水华鱼腥藻干重亦会产生影响，当LB液体培养基浓度依次为
2.5%,5%,7. 5%A0%A2. 5%和15%时，培养168h后的水华鱼腥藻干重相应增加，分别为 15. 89,16. 40,16. 77,17. 74,18. 30、和 19. 38mg/mL，而投加不同浓度(2. 5%~ 15% )的复合菌剂后，分别为14. 55、11· 11、8· 03、6· 66、6· 90和7. llmg/mL。通过排除LB液体培养基本身对水华鱼腥藻生长的影响因素，可见，随着复合菌剂浓度从2. 5%依次升至15%，复合 菌剂对水华鱼腥藻干重的抑制率依次为8 %、32 %、52 %、63 %、62 %、和63 %。实施例2复合菌剂对水华鱼腥藻光合色素的影响以Bhandari and Sharma法连续扫描400 750nm波长范围内色素吸收光谱，并对水华鱼腥藻叶绿素a含量进行测定。叶绿素a的提取测定取水华鱼腥藻藻液IOmL过O. 45 μ m的复合纤维素膜，将带藻细胞的膜冷冻过夜，取出后迅速用SmL热乙醇于热水浴中萃取2min,将萃取液超声破碎5 20min后，于暗处静置2 6h,离心(5000r/min,4°C ) 5min后取上清液3. 5mL置于比色皿中，于665nm和750nm处测吸光值，计算酸化前的光密度值(E665b = Abs665b-Abs750b),然后滴加200 μ L的lmol/L盐酸酸化,5min后于波长665nm和750nm处再测吸光值，计算酸化后的光密度值(E665a = Abs665a-Abs75J。采用热乙醇为萃取溶剂，A = 11. 5，K = 2. 43，比色皿光程为1cm。
27.9 X ( Ewsa - Ee65a) X V 叶绿素 a (μ§/ ) =y其中，V表示提取液体积(mL)，V表示样品的体积(L)。不同浓度的复合菌剂对水华鱼腥藻色素吸收光谱的影响的测定结果如图4所示(A、B、C、D、E、F、G 分别代表溶藻菌浓度为 0%、2· 5%、5%、7· 5%、10%、12· 5%、15% )，结果表明不同浓度的复合菌剂作用于水华鱼腥藻时，其色素光谱吸收曲线变化差异较大。中高浓度(> 7. 5% )处理下光谱吸收曲线已非常不明显，各处峰值模糊甚微，表明复合菌剂已大大地抑制了藻体色素的种类和含量。中低浓度(2. 5 7. 5% )处理下，随着复合菌剂浓度的增加，各色素光谱吸收峰值均有降低，这与复合菌剂对藻体细胞数以及干重的影响相一致，谱图充分体现复合菌剂的浓度相关性。叶绿素a是光能的捕获者，也是叶绿体膜内光传导者，因此叶绿素a含量的多少，充分反映出藻体光合成能力的强弱。不同浓度的复合菌剂对水华鱼腥藻叶绿素a的影响的测定结果如图5所示，结果表明复合菌剂对叶绿素a的抑制作用随着复合菌剂浓度的增加而增强。复合菌剂浓度为2. 5%,5%,7. 5%、10%、12. 5%和15%，24h对叶绿素a的抑制率分别为9%、15%、23%、30%、38%和 44%，168h 后依次升至 76%、81 %、91 %、95%、96%和96%。本发明的复合菌剂能够有效地降解水华鱼腥藻，对水体富营养化的控制提供了科学依据，为微生物治理水华的研究提供了重要基础。在一定条件下，复合菌剂对水华鱼腥藻的降解效果随菌剂浓度的增大而增加，当复合菌剂的浓度为15%时，对水华鱼腥藻叶绿素 a的抑制率可高达96%。
权利要求
1.一株芽孢杆菌，从黄化的水华鱼腥藻液中分离筛选获得，命名为SSAL-6，保藏号为 CGMCC No. 6195。
2.一株不动杆菌，从黄化的水华鱼腥藻液中分离筛选获得，命名为SSAL-8，保藏号为 CGMCC No. 6196。
3.一种复合菌剂，其特征在于，由芽孢杆菌SSAL-6和不动杆菌SSAL-8复合而成，芽孢杆菌SSAL-6和不动杆菌SSAL-8的菌体量之比为I 2 2 I。
4.根据权利要求3所述的复合菌剂，其特征在于，所述芽孢杆菌SSAL-6和不动杆菌 SSAL-8的菌体量之比为1:1。
5.根据权利要求3或4所述的复合菌剂的制备方法，其特征在于，将芽孢杆菌SSAL-6 和不动杆菌SSAL-8分别置于200mL LB液体培养基中，在250rpm、37°C下振荡培养12h，至菌悬液OD值为O. 8 1. O,菌体浓度为IO8 109cells/mL时，将芽孢杆菌SSAL-6和不动杆菌SSAL-8复合。
6.根据权利要求5所述的复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述LB液体培养基的组分及配比为酵母提取物，5g ;胰蛋白胨，IOg ；NaCl, IOg ;蒸馏水IOOOmL ；LB液体培养基的 pH 值为 7. 0-7.2。
7.根据权利要求3所述的复合菌剂的应用，用于降解水华鱼腥藻。
8.根据权利要求7所述的复合菌剂的应用，其特征在于当芽孢杆菌SSAL-6和不动杆菌SSAL-8的菌体量之比为1:1时，复合菌剂对水华鱼腥藻的降解效果随复合菌剂浓度的增大而增加，当复合菌剂的浓度为15%时，对水华鱼腥藻叶绿素a的抑制率达96%。
全文摘要
本发明提供了一种复合菌剂及其应用。该复合菌剂由芽孢杆菌SSAL-6和不动杆菌SSAL-8复合而成，其中芽孢杆菌SSAL-6和不动杆菌SSAL-8的菌体量之比为1～2∶2～1，最好为1∶1。本发明的复合菌剂能有效地降解水华鱼腥藻。当芽孢杆菌SSAL-6和不动杆菌SSAL-8的菌体量之比为1∶1时，复合菌剂对水华鱼腥藻的降解效果随复合菌剂浓度的增大而增加，当复合菌剂的浓度为15％时，对水华鱼腥藻叶绿素a的抑制率可高达96％。
文档编号C12R1/01GK103013851SQ20121037880
公开日2013年4月3日 申请日期2012年10月8日 优先权日2012年10月8日
发明者沈健英, 孙秀敏 申请人:上海交通大学