专利名称：人胚肾细胞293t-c10单克隆细胞株及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体为一种用于包装病毒的293T细胞单克隆细胞株及筛选方法，并且该细胞株具有很高的转染效率和病毒包装的稳定性。
背景技术：
293细胞是转染腺病毒ElA基因的人肾上皮细胞系，293T细胞由293细胞派生，可表达SV40大T抗原，主要用于包装病毒或瞬时转染以过量表达各种目标蛋白。慢病毒的类型有人免疫缺陷型病毒HIV、猴免疫缺陷型病毒SIV、猫免疫缺陷型病毒FIV、马传染性贫血EIA等，培养时间较长。按照传统的病毒包装方法，含有病毒颗粒的293T细胞的上清液需要经过超速离心加以浓缩(方法为超速离心后，弃上清液，将病毒溶解于很小的体积内，已获得高浓度的病毒溶液。这样在实验时，只需加入很小的体积，即可获得很高的感染效率，并且可以避免病毒溶液所产生的细胞毒性)，然后用于后续的细胞功能学实验研究。由于超速离心费时费力，且成本较高，因此如果病毒粗液的滴度可以达到5xl06 lxlO7，则无需超速离心即可用于后续的细胞功能学检测。前期实验已经发现，目前使用的293T细胞出毒效率并不高，病毒粗液滴度无法达到5xl06-lxl07。因此，筛选高出毒效率的293T细胞成为我们需要克服和解决的重要问题。我们分析293T细胞不能高效出毒的原因有1) 293T细胞在实验室长期培养传代中存在细菌、支原体污染的潜在威胁，从而使细胞不能以最佳状态进行病毒包装。2)由于293T细胞的异质性，细胞内同时存在出毒效率高和出毒效率低的克隆，所以从原始293T细胞中通过单克隆筛选的方式，可能筛选到具有高出毒效率的293T细胞克隆。支原体污染细胞培养(特别是传代细胞)被支原体污染是个世界性问题。国内外研究表明，95%以上是以下四种支原体口腔支原体(M. orale)、精氨酸支原体(M. arginini)、猪鼻支原体(M. hyorhinis)和莱氏无胆甾原体(A. Iaidlawii),为牛源性。据报道，支原体感染会对细胞造成多方面的影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑制细胞生长等。这些包括代谢、免疫或生化特性、生长状况、以及细胞存活等多方面的改变使细胞学的功能研究蒙上一层阴影。单克隆筛选的方法用于纯化单一的功能性细胞，常用于原代细胞的分离培养，制备单克隆抗体的杂交瘤筛选等。此方法简单易操作，获得的克隆细胞均一性好，单克隆率较高。所以用于高转染效率高滴度的293T单克隆细胞株筛选较适合。
发明内容
本发明旨在提供一种人胚肾细胞293T细胞单克隆株，出毒效率、转染率和感染率高，病毒包装的稳定性好。本发明还提供了上述293T细胞单克隆株的制备方法。本发明另一个目的是将这种293T细胞单克隆株用于包装慢病毒。
本发明提供的人胚肾细胞293T-C10单克隆细胞株，保藏号为CCTCC N0:C201281,以下称为293T-C10或ClO克隆(中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉，武汉大学；邮编430072 ;培养物名称人胚肾细胞293T-C10 ;2012年7月11日保藏，保藏编号CCTCCN0:C201281)o该293T-C10细胞属于人胚肾细胞，培养方法为90%高糖DMEM+10%FBS培养基，5%C02，37°C 培养。保存条件液氮-196 °C冻存。上述人胚肾细胞293T-C10单克隆细胞株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤(I)对数生长期的人胚肾细胞293T细胞进行去除支原体的操作；去除支原体后的细胞表面光滑，细胞饱满，折光性好，细胞生长状态良好；(2)去除支原体后的293T细胞稀释后贴壁培养形成单克隆，并扩大培养；具体方法为，用梯度稀释法将细胞稀释至每孔一个细胞，细胞贴壁后培养数周形成单克隆。筛选增值明显，细胞均一性好的单克隆进行扩大培养；(3)将单克隆细胞株进行磷酸钙-DNA转染，选择转染效率高的单克隆细胞株培养36 60小时(优选为48小时)，选择出毒效率高的单克隆细胞株；并将包装的病毒感染肿瘤细胞，确定和筛选感染力强、对细胞毒性低的细胞株；通过比较不同单克隆的磷酸钙-DNA转染效率与出毒效率，同时感染肿瘤细胞进行感染效率验证和对细胞毒性的观察比较。进一步，通过不同基因构建的质粒反复进行病毒包装测试比较，验证筛选出的单克隆细胞病毒包装的稳定性。检测筛选出的单克隆细胞的病毒包装稳定性。所得到的293T-C10单克隆细胞株可用于包装病毒，优选的，这种293T-C10单克隆细胞株(CCTCC N0:C201281)可应用于慢病毒，这种慢病毒可以是基于pCDH-CMV-MCS-EFl-copGFP (SBI :CD511B_1)质粒或 pFUGW-Hl 质粒包装的慢病毒。本发明通过去除293T细胞支原体，在对数生长期经单克隆筛选，得到均一性的单克隆细胞，比较不同转染与出毒效率，并用于肿瘤细胞感染验证以及重复包装实验验证细胞包装能力的稳定性。本发明的优点在于，去除支原体后的细胞在培养至对数生长期时筛选出的单克隆细胞株具有出毒滴度稳定，能较好的感染肿瘤细胞，且对细胞毒性较小等诸多优点。符合发明目的，满足实验室功能实验的需求。相比于现有技术，本发明的有益效果在于筛选出的293T单克隆细胞株ClO转染效率高达95%以上，病毒粗液的滴度可以达到5xl06 lxl07Tu/ml，重复病毒包装出毒效率稳定可靠。相比较筛选前的293T细胞出毒效率上升明显，不进行超速离心即可感染绝大多数肿瘤及其他待感染的细胞，满足大部分实验需求。
图I为实施例I去除支原体前A和去除支原体后B 293T细胞的状态可见光。图2为实施例2中，去除支原体后的293T细胞株单克隆C2 (A)与ClO (B)可见光。图3为实施例3中，293T细胞株单克隆Cl C14用磷酸钙-DNA转染后的细胞形态(可见光和荧光)。图4为实施例3中，非单克隆293T细胞用293T细胞株单克隆Cl C14包装的病毒感染后的细胞形态(可见光和荧光)。图5为实施例3中，人骨肉瘤细胞系Saos-2细胞用293T细胞株单克隆C2、C6、CIO、C13和C14包装的病毒感染的细胞形态(可见光和荧光)。图6为实施例3中，293T细胞株单克隆C2和ClO用pCDH-CMV-MCS-EFl-copGFP载体质粒进行磷酸钙-DNA转染24小时后的细胞形态(可见光和荧光)。图7为实施例3中，293T细胞株单克隆C2和ClO用pCDH-CMV-MCS-EFl-copGFP载体质粒进行磷酸钙-DNA转染72小时的上清液离心过滤除去细胞碎片后滴度检测和拍照(可见光和荧光)。图8为实施例3中，用C2和ClO克隆包装的病毒在人前列腺癌细胞系中进行感染实验，每孔分别加入100 μ L和10 μ L粗提液，三天后的照片(可见光和荧光)。图9为实施例4中，293Τ细胞株单克隆ClO用不同的质粒转染后，滴度检测拍照(可见光和荧光)。图(A)分别为三种克隆用质粒的磷酸钙-DNA转染24小时后可见光和荧光照片，图(B)为pscN即滴度参照病毒，为纽恩(上海)生物科技有限公司产品；图(C)为用质粒的磷酸钙-DNA转染48小时后收集的病毒上清，感染293T细胞(用12孔板进行细胞培养)3天后的荧光图片，每个克隆滴度检测时分别加入100 μ L和10 μ L体积的病毒。HY-15 pCDH-GFP 是 pCDH-CMV-MCS-EFl-copGFP 载体，克隆编号为 HY-15 ;G-I PAK7是在pCDH-CMV-MCS-EFl-copGFP载体上插入人的PAK7基因，克隆编号为G-I ；G-37 SKAl是在pCDH-CMV-MCS-EFl-copGFP载体上插入人的SKAl基因，克隆编号为 G-37。(A)图是3种克隆的磷酸钙-DNA转染24小时的荧光图片(B)图是3种克隆的磷酸钙-DNA转染48小时后收集的病毒上清，感染293T细胞3天后的荧光图片，每个克隆滴度检测时分别加入100 μ I和10 μ I体积的病毒。12孔是磷酸钙-DNA转染时使用的细胞培养孔板规格。pscN (滴度参照病毒)分别选用了 2xl08、2xl07、2xl06Tu/ml滴度的病毒感染293T细胞，每组各加入I μ I体积的病毒。图10为实施例4中，用冻存后复苏的ClO克隆细胞以及未冻存的传代培养至10代的ClO克隆细胞株进行病毒包装测试，转染后的照片(可见光和荧光)；(A-I)为复苏的ClO克隆细胞，(B-I)为传代至10代的ClO克隆细胞株。图11为实施例4中,用冻存后复苏的ClO克隆细胞株进行病毒包装测试,转染后进行滴度检测拍照(可见光和荧光)；滴度检测时病毒加入量为I 100μ I。图12为实施例4中，用未冻存的传代培养至10代的ClO克隆细胞株进行病毒包装测试，转染后进行滴度检测拍照(可见光和荧光);滴度检测时病毒加入量为I 100 μ I。图13是实施例5中，未经过筛选的293Τ细胞株与293Τ细胞单克隆ClO包装pFUGW-GFP病毒后转染效率、滴度检测和感染肿瘤细胞效率的比较。图14为实施例5中，未经过筛选的293T细胞株与293T细胞单克隆ClO包装pCD-GFP病毒后转染效率、滴度检测和感染肿瘤细胞效率的比较
具体实施例方式采用人胚肾细胞293T细胞(中科院细胞所)进行病毒包装。实施例I :去除293T细胞支原体，比较去除前后细胞的状态。I、复苏人胚肾细胞293T细胞(中科院细胞所)；2、将复苏的细胞消化计数IxlOVml，种植于6cm盘中培养；3、贴壁后更换新鲜的培养基，加入支原体去除药物，如喹诺酮类衍生物MRA (MPBiomedicals 3050044)，培养 I 周后停药。4、拍照比较去除支原体前后细胞的形态，结果如图I所示，去除支原体后的细胞表面光滑，细胞饱满，折光性好，细胞生长状态良好。实施例2 :对无支原体污染的293T细胞进行梯度稀释至96孔板中培养，筛选与扩大实验I、消化细胞，用新鲜培养基重悬实施例I获得的细胞。2、计数后逐步稀释至lcell/ΙΟΟμ 1，加入至96孔板中，37度、5%C02培养。3、次日细胞贴壁后，在显微镜下观察只有一个活细胞的孔，用mark笔标记。4、培养3天后，对mark笔标记的孔进行换液。5、培养10天后，单克隆长成。进一步对生长速度较快，细胞均一性好的单克隆进行筛选。获得标记为C1/C2/C4/C5/C6/C7/C10/C11/C12/C13/C14等11个单克隆细胞株。其中代表性的克隆为C2与ClO克隆。拍照如图2。6、待96孔长至80%密度时，将细胞消化扩增至48孔板，以此类推从小到大扩至IOcm 盘。7、将扩大的细胞进行冻存保种。实施例3 :比较不同单克隆的磷酸钙-DNA转染效率与出毒效率，同时感染肿瘤细胞进行感染效率验证和对细胞毒性的观察比较。I、将不同单克隆细胞株Cl C14培养至对数生长期，在12孔板中每孔种植4xl05个细胞。2、将GFP标记的对照质粒与慢病毒原件质粒混合，用磷酸钙-DNA沉淀法进行质粒转染；其中，对照质粒为pCDH-CMV-MCS-EFl-copGFP载体，包装的病毒命名为pCDH-GFP ;病毒原件质粒为Pvsv_G (Clontech :631530)、pCMV delta R8. 2 (Addgene :12263)。转染用的质粒载体为pFUGW_Hl (addgene :25870)质粒空载体和pCDH-CMV-MCS-EFl-copGFP (SBI :CD511B_1)质粒空载体。3、转染24小时后，用荧光显微镜进行拍照观察，结果如图3。4、换液培养48小时后，收取培养上清液。离心过滤去除细胞碎片。5、提前I天在96孔板中种植293T细胞(非单克隆)，每孔2xl04个。6、吸取不同单克隆包装的病毒，每孔加入100 μ I粗提液。培养3天后进行荧光拍照，结果如图4。得出C2/C6/C10/C13/C14感染效率较高。7、在人骨肉瘤细胞系Saos-2细胞中对上述5种克隆包装的病毒进行感染实验，每孔加入100 μ I或10 μ I的粗提液。培养3天后进行荧光拍照,结果如图5。8、初步得出C2与ClO克隆对肿瘤细胞的感染较高。
9、更换另一套 GFP 表达强的质粒载体(pCDH-CMV-MCS-EFl-copGFP)，在 C2 与 ClO细胞上进行磷酸钙转染实验。转染24小时后，用荧光显微镜进行拍照观察，结果如图6。10、换液培养48小时后，收取培养上清液。离心过滤去除细胞碎片。滴度检测后荧光拍照，结果如图7。11、在人前列癌细胞系DU145细胞中对上述2种克隆包装的病毒进行感染实验，每孔加入100 μ I和10 μ I的粗提液。培养3天后进行荧光拍照，结果如图8。12、观察表面，C2克隆在10 μ I体积感染条件下感染效率较低，且在100 μ I时细胞易飘起，细胞表面荧光碎片更明显，这些碎片在随后的培养过程中会逐步体现对细胞的毒性作用。而ClO克隆的滴度更高，对Dul45细胞的毒性也更小。最终确定ClO克隆(即293T-C10单克隆细胞株，保藏号CCTCC C201281)符合高转染效率高滴度的要求。该293T-C10细胞属于人胚肾细胞，培养方法为90%高糖DMEM+10%FBS培养基，5%C02，37°C 培养。保存条件液氮-196 °C冻存。基于上述pFUGW-Hl质粒空载体，包装的慢病毒，我们命名为pFUGW_GFP。基于上述P⑶H-CMV-MCS-EFI-copGFP (SBI :⑶511B-1)质粒空载体包装的慢病毒，我们命名为pCDH-GFP (下文统一以此名称标记)实施例4 :选择根据不同基因构建的质粒反复进行病毒包装测试比较。I、选择不同基因构建的质粒HY-15 pCDH-GFP 是pCDH-CMV-MCS-EFl-copGFP 载体，克隆编号为 HY-15 ;G-1 PAK7是在pCDH-CMV-MCS-EFl-copGFP载体上插入人的PAK7基因，克隆编号为G_1 ;G_37 SKAl是在pCDH-CMV-MCS-EFl-copGFP载体上插入人的SKAl基因，克隆编号为G-37。2、ClO单克隆细胞株进行磷酸钙-DNA转染，分别转染标记为HY-15、G_l、G-37的质粒。使用12孔细胞培养孔板进行磷酸钙-DNA转染和培养。3、转染后与滴度检测拍照，结果如图9。pscN (滴度参照病毒)分别选用了 2xl08、2xl07,2xl06Tu/ml滴度的病毒感染293T细胞，每组各加入I μ I体积的病毒，如图9的(B)。(A)图是3种克隆的磷酸钙-DNA转染24小时的荧光图片(C)图是3种克隆的磷酸钙-DNA转染48小时后收集的病毒上清，感染293Τ细胞3天后的荧光图片，每个克隆滴度检测时分别加入100 μ I和10 μ I体积的病毒。4、将复苏的ClO克隆细胞或原先传代至10代的ClO克隆细胞株进行病毒包装测试，可见光和荧光下的照片如图10，其中，(A-I)为复苏的ClO克隆细胞，(B-I)为传代至10代的ClO克隆细胞株。(A-I) (B-I)转染后进行分别加入I滴度检测拍照。复苏的ClO克隆细胞和传代至10代的ClO克隆细胞株结果分别如图11和图12所示。可见两者没有明显差别，说明ClO克隆细胞(即CCTCC C201281)具有稳定性。实施例5I、用去除支原体的未经过筛选的293Τ细胞株与293Τ细胞单克隆C10(293T_C10)分别包装慢病毒(用pFUGW-Hl质粒空载体和pCDH-CMV-MCS-EFl-copGFP载体转染，病毒包装方法与前述一致)，培养24小时后比较转染效率，未经过筛选的293T细胞株转染效率40% 50%，经观察，用糖蛋白VSVG检测发现融合细胞相对较少；(VSVG是种糖蛋白，能引起
7293T或者293T-C10细胞发生细胞融合，导致细胞出现形态变大，是判断病毒包装成功与否的指标)；293T细胞单克隆ClO转染效率90% 100%，融合细胞相对较多，差异非常明显。2、培养72小时后检测病毒滴度(分别感染293Τ与293T-C10细胞)，未经过筛选的293Τ细胞株转染效率分别为小于10%和10% 20%，病毒滴度小于I X 105Tu/ml和I X IO5Tu/ml，经观察，感染后的细胞GFP表达较弱；293T细胞单克隆ClO感染效率均大于80%，病毒滴度分别为2 X 106Tu/ml和I X 107Tu/ml，感染后的细胞GFP表达相对较强，差异非常明显。3、用未经过筛选的293Τ细胞株与293Τ细胞单克隆ClO包装病毒，用于肿瘤细胞saos-2和DU145感染效率验证，未经过筛选的293T细胞株转染效率分别为小于10%和10% 20%，经观察，感染后的细胞GFP表达较弱；293T细胞单克隆ClO感染效率均大于80%，感染后的细胞GFP表达相对较强，差异非常明显。pFUGW-GFP和pCDH-GFP病毒包装的结果分别如图13和图14所示。
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权利要求
1.人胚肾细胞293T-C10单克隆细胞株，其特征在于，保藏号为CCTCCC201281。
2.权利要求1所述人胚肾细胞293T-C10单克隆细胞株的制备方法，其特征在于，包括 如下步骤(1)去除支原体的人胚肾细胞293T细胞稀释后贴壁培养形成单克隆，并扩大培养；(2)将单克隆细胞株进行磷酸钙-DNA转染，选择转染效率高的单克隆细胞株培养36 60小时后选择出毒效率高的单克隆细胞株；并将包装的病毒感染肿瘤细胞，确定和筛选感 染力强、对细胞毒性低的细胞株。
3.权利要求2所述人胚肾细胞293T-C10单克隆细胞株的制备方法，其特征在于，步骤 (1)所述去除支原体的人胚肾细胞293T细胞通过如下方法获得取对数生长期的人胚肾细 胞293T细胞进行去除支原体的操作。
4.权利要求1所述人胚肾细胞293T-C10单克隆细胞株在包装病毒方面的应用。
5.权利要求1所述人胚肾细胞293T-C10单克隆细胞株在包装慢病毒方面的应用。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，具体为一种用于包装病毒的人胚肾细胞293T-C10单克隆细胞株及筛选方法。通过去除293T细胞支原体，在对数生长期经单克隆筛选，得到均一性的单克隆细胞，比较不同转染与出毒效率，筛选得到单克隆细胞株。这种细胞株保藏号为CCTCC C201281，具有很高的转染效率和病毒包装的稳定性，相比较筛选前的293T细胞出毒效率上升明显，不进行超速离心即可感染绝大多数肿瘤及其他待感染的细胞，满足大部分实验需求。
文档编号C12N5/073GK102911911SQ20121037834
公开日2013年2月6日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者王海峰, 姚远颋, 谈竹君, 劳昕元 申请人:上海黄离生物科技有限公司