一种抗花生连作复合菌剂的制备及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物防治复合菌剂技术领域，尤其涉及一种抗花生连作复合菌剂的制 备及应用，即抗花生连作化感物质降解菌和生防菌复合菌剂的制备及其应用。
【背景技术】
[0002] 众所周知花生是重要的油料作物之一，中国是最大的花生生产国，种植总面积占 世界总面积的20. 4%，总产量占40. 8% ;2013年中国花生播种面积为471万公顷，花生总 产量为1700万吨。连作花生植株矮小、生育不良，产质量下降，病虫害加剧，连作3年后减 产幅度为10%~40%。据张思苏等人多年试验和调查结果，连作花生一般生长不良，减产 10%以上，高者达30%以上，且随着连作年限的增加，减产愈重。花生连作多年，土壤微生物 的数量与组成发生了改变，细菌数量减少，真菌数量增加。花生是我国主要的经济作物，其 产量及质量关系着国计民生。我国花生面积大、产区相对集中，花生主产区常常多年连片、 大规模种植，连作十分普遍，花生连作障碍已经成为影响花生高产的主要因素之一。花生连 作后病害加重、产量下降。目前，生产中急需一种有效、安全、环保的抗花生连作障碍及其病 害的新技术。
[0003] 控制花生病害的一般方法是使用化学农药，然而，长期使用化学农药会导致病原 菌产生抗药性而降低化学药剂的防病效果，同时长期使用化学药剂会造成农药残留超标和 环境污染。生物防治是控制植物病害的一种新途径，它主要是利用生防菌与植物病原微生 物之间的拮抗作用，抑制植物病原菌的生长。我国多数厂家生产的菌剂大多为单一菌种，功 能单一，效果不显著，且花生抗连作专用菌剂在我国还很少有生产使用。
[0004] 我们多年研宄结果表明，花生连作障碍的主要原因是土壤生物学环境恶化、花生 病害加重和邻苯二甲酸等化感物质化感作用。以花生化感物质降解菌和病害生防菌为核心 的微生物修复新技术是降低花生连作障碍的有效途径。该复合菌剂降低连作给花生生产带 来的风险、改善土壤微生物区系、保持土壤肥力、减低花生病害发病率，降低农药的使用量 和残留，减少环境污染，有利于农业的可持续发展，提尚花生及相关广品的食品安全性，提 高花生品质和花生出口创汇竞争能力，对花生生产具有重要的理论和生产指导意义。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术中化学农药防治所存在的环境污染和病害发生严重等问题，本发明 的目的是提供一种可有效分解花生化感物质降解菌和抗多种病原菌的生防菌复合菌剂，还 涉及它在花生抗连作性能的应用。使用本发明所述复合菌剂，可以减少化学农药的用量及 其在土壤中的累积，防止环境污染，有利于提高作物的质量和产量，经济效益和社会效益十 分显著。
[0006] 所述化感物质降解菌剂包括油酸降解菌株、邻苯二甲酸降解菌株和十六烷酸降 解菌株，所述抗连作花生生防菌为黄色蓝状菌（Talaromyces f lavus) qwl2,其保藏编号为 CGMCC 5067,保藏日期为2011年7月22日；所述油酸降解菌株为里拉微球菌（Micrococcus lylae)06,其保藏编号为CGMCC 5064,保藏日期为2011年7月22日；所述邻苯二甲酸降 解菌株为理氏勒米诺氏菌（Leminorella richardii)L2,其保藏编号为CGMCC 5063,保 藏日期为2011年7月22日；所述十六烧酸降解菌株为紫金牛叶杆菌（Phyllobacterium myrisacearum)C3,其保藏编号为CGMCC 5065,保藏日期为2011年7月22日；上述四种菌种 均保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西 路1号院3号，中国科学院微生物研宄所。 为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：
[0007] (1)菌种来源
[0008] 土壤采集于山东省连续种植花生多年的花生地，分别是花生连作1年、2年、4年、 7年的土壤，土壤类型是河潮土，土壤质地类型为砂土，花生品种为花育16号。将样品花 生根部的土样用刷子刷入自封袋，并采集根系周围2mm范围内的的土壤，总共收集土重约 500g左右，冷藏用于微生物的筛选测定及化感物质的分离鉴定。
[0009] (2)菌种筛选
[0010] 营养琼脂培养基（NA培养基）：蛋白胨5. Og;牛肉浸膏3. Og;葡萄糖2. 5g;酵母粉 1.0 g ;琼脂粉16. 0-18. Og ;蒸馏水1000ml ;pH7. 0-7. 2。另配制NA液体培养基。马丁氏琼 脂培养基：葡萄糖 l〇g，蛋白胨 5g，KH2PO4 lg，MgSO4 ? 7H200. 5g，1/3000 孟加拉红 IOOmLJK 脂15-20g，pH自然，蒸馏水800mL，临用前加入0. 03%链霉稀释液100mL，使每毫升培养基中 含链霉素30 y g。无碳基础培养基（CM培养基）：K2HP04 7. 5g ;KH2P04 2. Og ;MgS04 ? 7H20 0? 2g ;CaC12 ? 2H20 15mg ;NaCl 0? 5g ; (NH4) 2S04 2. Og ;蒸馏水 1000ml ;pH7. 2-7. 6。种 子培养基：蛋白胨5. Og ;牛肉浸膏3. Og ;葡萄糖2. 5g ;酵母粉1.0 g ;蒸馏水1000ml ; pH7. 0-7. 2PDA固体培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，水lOOOmL，pH自然。
[0011] 筛选步骤：取新鲜土样l〇g加入到分别含有油酸2%、邻苯二甲酸1%。、十六烷酸 2%的100mLCM培养基中，置于150-200r/min，30°C -40°C摇床上培养24-72h。继代培养三 次，吸取100 U 1培养液接种到NA平板上，30°C培养24h，然后根据菌落的不同形态随机挑取 单菌落纯化3代后保存，待测定它们的降解效能。
[0012] 向添加化感物质lg/L的CM培养基中接种后，在170r/min，30°C摇床上培养7天， 不接种的处理为对照，每处理重复3次。用1:1的乙醇乙醚混合萃取液萃取3次，合并萃取 液，旋转蒸发，甲酯化，冷却后用正己烷萃取，用气象色谱仪检测，分选降解效率高、遗传稳 定的菌株。
[0013] 生防菌筛选步骤：土壤自然风干后过20目筛，采用土壤稀释分离法制备10_ 310_ 4、1〇- 5、KT 6的土壤悬浮液。根据所分离的微生物，取不同浓度的土壤悬浮液，真菌取1〇-3、KT 4,用马丁氏琼脂培养基进行涂布。每处理重复3次，28°C培养，计数真菌的菌落数，统 计每克土中真菌的总数。根据平板内菌落的形态、大小、色泽和生长速度等特点，从每个样 品尽可能多的挑取单菌落划线纯化。依据菌落培养性状和形态特征对菌株进行归类并统计 数量。确定优势菌，进行编号保存，待进一步鉴定。
[0014] 将分离到的优势真菌接种到马铃薯培养基（PDA)上，26°C培养7天后，描述菌落质 地、形状、大小、隆起形状和颜色等，同时在光学显微镜（10X40倍）下观察菌株的分生孢子 和分生孢子梗形态。参照有关资料进行形态学鉴定。用CTAB法提取优势真菌的DNA，采用 真菌核糖体18SrDNA的通用引物ITSl和ITS4进行PCR扩增。回收扩增产物，送至北京诺 赛基因公司测序。测序结果在NCBI网站上用BLAST软件与GenBank核酸数据库中相关种 属的DNA序列进行同源性比较。最终将菌株确定为黄色蓝状菌。
[0015] (3)菌种培养
[0016] 将（2)中筛选出的菌种利用不同方式进行培养。斜面培养：斜面划线接种后放于 30°C的恒温培养箱中，细菌培养24h，真菌培养5天。种子培养：用接种针取1-2环斜面菌接 入种子培养基中，250ml三角瓶的装液量为100ml，置于170r/min，30°C振荡培养72h。摇瓶 培养：用移液枪将种子液按1 % (V/V)的接种量接入发酵培养基（添加化感物质）中，250ml 三角瓶的装液量为l〇〇ml，置于170r/min，30°C振荡细菌培养72h，真菌培养5天
[0017] (4)复合菌剂的制备配比和载体选择
[0018] 获得的复合菌剂中里拉微球菌OD值为0.5-0. 8,理氏勒米诺氏菌OD值为 0.6-0. 8,紫金牛叶杆菌OD值为0.3-0. 5。黄色蓝状菌自然生长5天，选取泥炭土，硅藻土， 麸皮为载体，将一定量的载体高温灭菌，在无菌条件下将上述复合菌剂与载体混合均匀，进 行培养。每7天计数微生物的活菌数并通过测定活菌数试验和大田试验研宄不同菌肥的促 生效果。
[0019] 本发明获得的复合菌剂的主要成分为化感物质降解菌和抗连作花生生防菌的复 合菌剂，理氏勒米诺氏菌有效活菌数8. 9X 107-6. 2X 108cfu/ml，里拉微球菌有效活菌数 2. 4X IO7-L 16X 108cfu/ml，紫金牛叶杆菌有效活菌数6X 108-3. 8X 109cfu/ml。其中最佳 配比化感物质降解菌剂有效活菌总数1. 37 X 109-3 X UTcfu/ml。抗连作花生生防菌有效活 菌数为2. 4X IO7-L 12 X 108cfu/ml。按每小区200ml与3Kg麸皮混合均匀施入土壤，施入 土壤后对花生茎腐病、焦斑病、网斑病、褐斑病均有显著的抑制作，产量提高5% -15%。
[0020] 本发明的有益效果为：
[0021] 施用复合菌剂的能够提高连作花生开花期过氧化氢酶，以及整个生育期的磷酸 酶和脲酶活性，能显著提高根际细菌数量。与现有技术相比，本复合菌剂根据菌种特性添 加6. 5%氯化钠组分优化营养条件和培养条件，采用生物技术中常用方法，制备条件简单温 和，提取工艺简单，同时具备降解花生化感物质和防治花生连作病害的优点，使用简单，大 大降低了劳动强度，提高了工作效率：另外采用生物技术，以天然花生根际土壤中存在的菌 种为主，能够高效的降解长期塑料薄膜覆盖残留的邻苯二甲酸、十六烷酸、油酸等根际连作 残留的化感物质，抑制花生焦斑病、网斑病、褐斑病等常发叶部病害病菌的生长，有效防治 植物病害，减少化学农药的用量和其在土壤中的累积，对于防治环境污染极为重要，降解后 的产物能够被细菌作为碳源转化为无害物质，增加土壤碳源，有利于作物根系对降解物质 的吸收，不会对环境产生污染；该复合菌剂稳定性好，连续培养后不会发生基因突变，能够 稳定遗传，能够增加土壤中有益细菌的数量，提高土壤肥力，也有利于提高我国花生等作物 的质量和产量，经济效益和社会效益十分显著。
[0022] 本发明中抗花生连作复合菌剂的制作方法，与现有的按菌剂体积比混合发酵相 比，正交实验设计高效率、快速经济，这种方法利用了微生物对数期具有增长速度快、细胞 代谢能力最强、细菌很少死亡的特点。实际发酵生产中在保证营养物质补充、代谢产物排 出、pH稳定、温度稳定等情况下可以扩大培养，使微生物始终处于对数期，以最快速度达到 稳定期，活菌数达到最大，微生物活性最高且菌间协同作用明显。载体能够为微生物生长提 供特定场所，且对微生物存活有直接影响，选用合适的载体对于菌剂的稳定性具有重要意 义，使用未经发酵的麸皮做载体孔隙大，施入土壤中能增加土壤的