专利名称：工厂化育苗养殖循环海水净水菌剂的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物菌剂技术领域，具体地说，它涉及一种育苗和养殖用水的净水菌剂，该净水菌剂涉及热带假丝酵母(Candida tropicalisCGMCC1012)、胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa CGMCC1013)、芽孢杆菌H2(Bacillus sp.H2 CGMCC1004)、芽孢杆菌H4(Bacillus sp.H4CGMCC1006)、异养氨氧化菌H9(Heterotrophic ammonia oxidizer H9CGMCC1010)、异养氨氧化菌H10(Heterotrophic ammonia oxidizer H10CGMCC1011)共6种菌株，这些菌株经培养后，按照其培养物同等体积比例配比组成为育苗和养殖循环海水的净水菌剂，在通常育苗和养殖温度下具有产生脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶，降解育苗和养殖中的饵料残渣和养殖动物的排泄物的能力，去除超低浓度氨氮和COD及BOD的作用。与相应的生物反应器适配，适用于工厂化高密度育苗和养殖循环淡水或海水的氨氮和COD的去除处理。
二、技术背景海产品的大规模工厂化育苗和养殖在我国的近年来得到了迅猛的发展，育苗和养殖品种不断增加，其规模不断扩大，极大地丰富了市场和满足了人们对海产品的需求。但在很多方面也造成了一些负面影响。如近岸海域的污染、养殖动物的病害的爆发和流行等。在海水育苗和养殖方面，其污染主要来源于饵料残渣和养殖动物的排泄物，目前国内很多的养殖场和育苗场一般采用换水(流水)的方法，即抽取新鲜海水经过简单的过滤和消毒(冬天还要经过提温)，作为养殖水体，经养殖一定时间(一天或更短)就直接排放，有些地方甚至是上一个养殖场的排水口就是下一个养殖场的抽水口。开放式育苗和养殖不仅造成海水资源、和能源的巨大浪费(如冬天的海水提温)，而且污染近岸海域，威胁海洋生态环境和养殖海水资源的匮乏，甚至造成养殖动物的大规模的病害的发生和流行。大规模海水养殖，增加了溶解态和悬浮态物质的输出，在一定程度上可以引起近岸海水的污染，同时被污染的海水也制约了海水养殖的进一步发展，因此开发并采用工厂化循环海水高密度育苗和养殖技术正受到广泛重视和应用，对于解决局部海水污染问题和过冬养殖以及节约能源具有重要意义。而要实现循环海水高密度养殖的关键就在于循环海水的保养和处理，这中间的关键又是对养殖循环水中的COD和氨氮的去除处理。一般来说，海水养殖对COD和氨氮浓度都要求严格的限制，养鱼通常要求COD低于5mg/L，氨氮浓度低于0.5mg/L(非离子氨浓度低于0.02mg/L)，育苗期间对COD和氨氮的要求更加苛刻，如扇贝育苗要求COD低于3mg/L，氨氮浓度低于0.1mg/L。要解决育苗和养殖海水的COD和氨氮问题，目前只有两种办法1)换水；2)COD和氨氮的去除处理。采用换水的方法其弊端和危害如如前所述，在此不作重复，因此它不是解决海水养殖问题的出路，也不符合可持续发展的战略需求，因此必须淘汰这种粗泛式的养殖技术。COD和氨氮的去除处理可以为养殖海水的循环使用提供技术保障，对于减少养殖污染物的排放以及减少对近岸海域的污染、减少或避免养殖动物的病害的发生和流行、减少对养殖养殖水源和能源的浪费等都具有重要意义，同时更是符合可持续发展的战略目标。目前对于养殖海水的COD和氨氮去除处理目前还没有其他方法，唯有生物方法，即生物反应器方法。生物反应器对于消除养殖水体的氮、磷和有机物的高效性已被许多研究成果所证明。Ackefors和Enell报道利用生物反应器和过滤器的组合可以有效去除养殖海水的悬浮物和氮、磷，其悬浮物减少了67～97％，COD减少了13～84％，TN和TP分别减少了4～89％和21～86％。很多因素可以影响生物反应器的效率，如运行条件、工艺及其他一些理化因素，但决定性的因素取决于存在于其中的微生物的数量及其效率的高低。在工厂化循环海水高密度养殖(30kg/m2)或育苗(20个贝苗/mL或以上)中，特别是为了维持冬季养殖和节约能耗，通常维持较低的养殖温度(一般18摄氏度左右)，要求养殖水体较高的循环次数，通常在4~6次/天，而用于去除COD和氨氮处理的生物反应器的总体积为养殖水体总体积的1/10或更小的情况下，每次循环出水的COD和氨氮应达到养殖或育苗的要求，也就是说在较低的温度和水力停留时间在30~40min的时间内要达到50％或更高的COD和氨氮去除效率，因此在工厂化循环海水高密度养殖和育苗海水的COD和氨氮去除处理中的核心技术就是与生物反应器适配的高效净水菌剂的开发与应用。针对海水养殖中的COD和氨氮处理问题和需求，目前国内外也开发了一些菌剂，如美国的硝化菌剂、丁永良等报道的水族馆净水微生物、吴伟等曾报道的固定化微生物对养殖水体中NH4+-N和NO2--N的转化作用等。这些菌剂虽然具有一定的去除氨氮和净化养殖海水的作用，但都存在着明显的缺点，如美国的硝化菌剂去除氨氮的效率并不能令人满意，此外它的成本太高，还要求经常性的投加，国内的关的海产品养殖业主难以承受；水族馆净水微生物和固定化微生物都是实验室的研究结果，离实际应用还有相当的距离。
发明内容
为了解决上述问题，我们在长期的养殖污水处理研究中分离、筛选到在较低水温下对海水水体污染物具有特异清除能力的微生物群，这是普通微生物难以做到的，本发明的目的就是利用这些对水体污染物具有特异清除能力的微生物群提供了一种用于海水育苗和养殖的净水菌剂，该净水菌剂与生物反应器适配可以进行工厂化育苗和养殖循环海水水质的净化。该净水菌剂能够适应较低水温度、水力停留时间短的条件下、以较低的成本、超低浓度的COD和氨氮处理工厂化循环海水进行高密度育苗和养殖水体。具体地讲，该净水菌剂涉及以下微生物热带假丝酵母(Candida tropicalis CGMCC1012)、胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa CGMCC1013)、芽孢杆菌H2(Bacillus sp.H2 CGMCC1004)、芽孢杆菌H4(Bacillus sp.H4 CGMCC1006)、异养氨氧化菌H9(Heterotrophic ammonia oxidizer H9 CGMCC1010)和异养氨氧化菌H10(Heterotrophic ammonia oxidizer H10 CGMCC1011)共6种菌株。是由上述微生物经过分别先培养，然后，将其培养物混合做为净水菌剂使用，但是不要使净水菌剂中每种培养物之间的配比量相差过于悬殊，一般为了方便按照其培养物同等体积比例配比组成一种混合微生物菌剂。该净水菌剂它可以使超低浓度污染COD(＜8mg/L)和氨氮(＜0.5mg/L)的水体得到了净化处理。
本发明循环海水净水菌剂的微生物培养首先是将6株菌分别接种于各自的培养基，对于酵母菌采用麦芽汁培养基，对于芽孢杆菌和异养氨氧化菌采用牛肉汁培养基或LB培养基，以上所述的培养基都是微生物培养时通常采用的培养基，接种后在30℃左右进行培养2天，例如，热带假丝酵母(Candida tropicalis CGMCC1012)、胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa CGMCC1013)的培养采用麦芽汁培养基，自然pH培养。对于芽孢杆菌H2(Bacillus sp.H2 CGMCC1004)、芽孢杆菌H4(Bacillus sp.H4 CGMCC1006)、异养氨氧化菌H9(Heterotrophic ammonia oxidizer H9CGMCC1010)、异养氨氧化菌H10(Heterotrophic ammonia oxidizer H10CGMCC1011)，采用牛肉汁培养基或LB培养基培养。
菌种的配伍及低温硝化菌剂的制备、使用上述的6株菌种经过分别培养后，将其各自的培养物按照等体积的比例混合，即制成循环海水净水菌剂。由此制成的菌剂也可直接用于养殖海水的COD和氨氮去除处理之用。该混合微生物净水菌剂可以产生脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶，降解饵料残渣和养殖动物的排泄物，降低COD，同时以硝化的方式以及同化的方式去除水体中的氨氮，尤其适合于具有与本循环海水净水菌剂适配的生物反应器的育苗和养殖水体超低浓度氨氮和COD的去除处理，采用循环海水净水菌剂直接挂膜或采用扩大培养物挂膜，在扩大培养的同时也可将部分填料放在培养池中挂膜。将循环海水净水菌剂或扩大培养物加到生物反应器中，如接触氧化反应器、或SBR反应器、或UASB反应器，反应器中装有浸没式填料，其中填料主要采用具有能吸附微生物菌体的低表面势能的高分子材料制成的弹性填料、球形填料，天然植物载体填料等。本发明的循环海水净水菌剂具有适应低COD和氨氮浓度发挥较高效率的能力，解决较低COD和氨氮浓度条件下的育苗和养殖水体的COD和氨氮处理，使出水达到海产品养殖和育苗的水质要求，实现越冬循环海水养殖和育苗以及常温下工厂化循环海水的高密度养殖和育苗，具有广阔的应用前景。
本发明涉及的净水菌剂的菌种于2003年9月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC保藏，其保藏号分别为热带假丝酵母(Candida tropicalis)CGMCC N01012、胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)CGMCC1013、芽孢杆菌H2(Bacillus sp.H2)CGMCC1004、芽孢杆菌H4(Bacillus sp.H4)CGMCC1006、异养氨氧化菌H9(Heterotrophic ammonia oxidizer H9)CGMCC1010和异养氨氧化菌H10(Heterotrophic ammonia oxidizer H10)CGMCC1011。
菌种的培养基组成对于热带假丝酵母(Candida tropicalis CGMCC1012)、胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa CGMCC1013)的培养采用麦芽汁培养基，其配方为麦芽汁1L pH自然对于芽孢杆菌H2(Bacillus sp.H2 CGMCC1004)、芽孢杆菌H4(Bacillus sp.H4 CGMCC1006)、异养氨氧化菌H9(Heterotrophicammonia oxidizer H9 CGMCC1010)、异养氨氧化菌H10(Heterotrophicammonia oxidizer H10 CGMCC1011)的培养采用牛肉汁培养基或LB培养基，其配方如下牛肉汁培养基牛肉膏5克，蛋白胨10克，氯化钠5克，pH7.2LB培养基蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，pH7.2将上述菌种分别接种于其合适的培养基，30℃，进行摇床200rpm好气培养2天。
上述6株菌分别培养之后，按各自相同体积的培养物混合制成净水菌剂。
扩大培养现场试验视情况而定是否需要进行扩大培养，若需要扩大培养则使用如下培养基葡萄糖0.5％，氯化铵0.5％，蛋白胨0.05％，磷酸盐0.03％，硫酸镁0.01％，海水配制。按10％的接种量接种，曝气培养，夏天室温、冬天控制扩大培养温度为20℃，1周为一个培养周期。
四
图1 循环海水净水菌剂对模拟养殖海水的氨氮的去除实验结果图2 净水菌剂接种挂膜后在不同温度下去除氨氮的结果五具体实施方案为了更好地理解本发明，通过以下实施实例予以进一步说明，但并非对本发明的限定。
实施例1循环海水净水菌剂的制备及水质处理菌种的培养
对于热带假丝酵母(Candida tropicalis CGMCC1012)、胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa CGMCC1013)的培养采用麦芽汁培养基，其配方为麦芽汁1L pH自然对于芽孢杆菌H2(Bacillus sp.H2 CGMCC1004)、芽孢杆菌H4(Bacillus sp.H4 CGMCC1006)、异养氨氧化菌H9(Heterotrophicammonia oxidizer H9 CGMCC1010)、异养氨氧化菌H10(Heterotrophicammonia oxidizer H10 CGMCC1011)的培养采用牛肉汁培养基或LB培养基，其配方如下牛肉汁培养基牛肉膏5克，蛋白胨10克，氯化钠5克，pH7.2LB培养基蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，pH7.2将上述菌种分别接种于其合适的培养基，30℃，进行摇床200rpm好气培养2天。
菌种的配伍及低温硝化菌剂的制备6株菌种经过分别培养后，将其各自的培养物按照等体积的比例混合，即制成育苗和养殖水源净水菌剂。由此制成的菌剂也可直接用于养殖水源的COD和氨氮去除处理之用。该养殖海水净水菌剂按5％的接种量接种于人工配制的含COD 30mg/L、氨氮5mg/L的模拟养殖海水中，在25℃条件下摇床培养进行去除氨氮实验，结果，30mg/L的COD和5mg/L的氨氮经50分钟的反应即可基本被完全去除。如图1所示。
扩大培养和挂膜扩大培养现场试验视情况而定是否需要进行扩大培养，若需要扩大培养则使用如下培养基葡萄糖0.5％，氯化铵0.5％，蛋白胨0.05％，磷酸盐0.03％，硫酸镁0.01％，海水配制。按10％的接种量接种，曝气培养，夏天室温、冬天控制扩大培养温度20℃，1周为一个培养周期。
挂膜采用工厂化育苗和养殖循环海水净水菌剂直接挂膜或采用扩大培养物挂膜(在扩大培养的同时也可将部分填料放在培养池中挂膜)。按5％的量将循环海水净水菌剂或扩大培养物加到生物反应器中(接触氧化反应器、或SBR反应器、或UASB反应器)，反应器中装有浸没式填料(所用材料不限，主要是低表面势能的高分子材料制成的弹性填料、球形填料，天然植物载体填料等)并保证比表面积达到300m2/m3以上，闷曝挂膜2周，使循环海水净水菌剂均匀、充分地附着在载体填料的表面。期间控制溶氧4mg/L左右。
生物处理系统的启动与预运行生物反应器填料挂膜完成后，先控制水力停留时间200min流量进水运行2天，然后逐步均匀加大流量，至预运行2周达到设计流量即控制水力停留时间40min并继续预运行1~2周，期间控制溶氧4mg/L左右并维持COD 20mg/L左右，氨氮浓度2mg/L左右。
生物处理系统的运行和管理预运行完成后即可进行系统的运行，进行海水养殖或育苗循环水的COD和氨氮去除处理。在海产品的养殖或育苗期间由于溶氧较高，生物处理系统可以不曝气。在运行期间应不定期地往生物反应器中投加适量的碳源，同时最好能每月补充适量的循环海水净水菌剂(生物反应器有效容积的3ppm)，如果处于养殖或育苗间断期，应按预运行方案维持运行。实施例2循环海水净水菌剂对模拟海水的COD和氨氮去除结果将配制好的循环海水净水菌剂按5％的接种量接种于人工配制的含COD30mg/L以及氨氮5mg/L的模拟海水中，在25℃条件下摇床培养进行去除COD和氨氮实验，30mg/L的COD和5mg/L的氨氮经50min的反应即可基本被完全去除。结果如图1所示。
实施例3 净水菌剂的脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶活性测定将配制好的循环海水净水菌剂按照标准方法测定上述三种酶的活性结果如表1所示，表1的结果表明，该菌剂具有脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶的酶活，可以分解养殖海水中的饵料残渣和养殖动物的排泄物。
表1循环海水净水菌剂的酶活
*酶活定义为每分钟从底物中释放出1μmol脂肪酸所需的酶量为1国际单位(IU)；
**酶活定义为在30度条件下1小时内催化1mL2％可溶性淀粉成为糊精所需的酶量为1个单位(U)；***酶活定义为每分钟从酪蛋白释放1μg酪氨酸所需的酶量为1个单位(U)。
实施例4 填料挂膜后的模拟小系统运行对氨氮的去除循环海水净水菌剂按实施方案中的操作在载体填料上挂膜后，在模拟小系统中进行去除COD和氨氮的试验。该模拟小系统的循环海水为3m3，其中的生物反应器有效容积为0.300m3，是循环海水的1/10，生物反应器中所装填料为天然植物载体填料，装填度达到比表面积为100m2/m3，于10月底11月初进行了不同氨氮浓度的去除实验，结果列于表2。从表2可见，在水温较低的情况下，挂膜后的生物反应器在控制水力停留时间为35min对超低浓度的COD和氨氮的去除效率基本稳定维持在55~60％之间，说明具有较高的氨氮去除效率，出水可以达到育苗和养殖的要求。
实施例5 不同温度条件下挂膜后菌剂对氨氮的去除将菌剂按如上所述方法进行挂膜，然后在不同温度、水力停留时间为35min条件下对氨氮浓度为4mg/L的模拟养殖水进行实验，结果如图2所示。表明该菌剂在高于25度的条件下具有较好的去除氨氮的能力。
表2模拟小系统中的氨氮去除实验
实例5 循环海水净水菌剂在扇贝育苗循环海水的氨氮去除应用效果在青岛金瀛海洋科技发展有限公司的扇贝育苗场，生物处理系统见图2。进行了现场循环海水育苗试验，在整个育苗周期(约2~3周)都采用循环海水，期间约4天种苗倒池一次。期间检测了生物处理系统的进出水氨氮，结果表明在水温为17℃左右的条件下，进水的氨氮浓度在50~65μg/L，出水的氨氮浓度维持在30μg/L以下，达到了扇贝育苗的要求，保证了扇贝育苗的顺利进行。表3为运行25天的结果。
表3系统运行25天去除氨氮的结果
权利要求
1.一种育苗和养殖水源的净水菌剂，该水源净水菌剂涉及的微生物组成如下热带假丝酵母(Candida tropicalis)CGMCC1012、胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)CGMCC1013、芽孢杆菌H2(Bacillussp.H2)CGMCC1004、芽孢杆菌H4(Bacillus sp.H4)CGMCC1006、异养氨氧化菌H9(Heterotrophic ammonia oxidizer H9)CGMCC1010、异养氨氧化菌H10(Heterotrophic ammonia oxidizer H10)CGMCC1011，净水菌剂是由上述微生物经过分别先培养，然后，将其培养物混合组成一种育苗和养殖水源净水菌剂。
2.根据权利要求1所述的水源净水菌剂，其中净水菌剂涉及的微生物对于酵母菌采用麦芽汁培养基先培养，对于芽孢杆菌和异养氨氧化菌采用牛肉汁培养基或LB培养基先培养，培养后按照其培养物同等体积比例配比混合组成一种微生物海水净水菌剂。
3.根据权利要求1或2所述的水源净水菌剂，该净水菌剂能够直接用于淡水或海水养殖水源或循环水的净化，或与生物反应器适配进行工厂化育苗和养殖循环海水水质的净化，能够适应较低水温度15℃~20℃、超低浓度的COD和氨氮处理工厂化循环淡水或海水进行高密度育苗和养殖水体的处理。
4.根据权利要求3所述的水源净水菌剂，其中涉及的生物反应器有接触氧化反应器、SBR反应器、和UASB反应器，反应器中装有浸没式填料，填料主要是低表面势能的高分子材料制成的弹性填料、球形填料，天然植物载体填料，有利于微生物菌体的吸附。
全文摘要
本发明涉及一种育苗和养殖水源的净水菌剂，该净水菌剂涉及的微生物是由热带假丝酵母(Candida tropicalis CGMCC1012)、芽孢杆菌H2(Bacillus sp.H2 CGMCC1004)、异养氨氧化菌H9(Heterotrophic ammonia oxidizer H9 CGMCC 1010)共6种菌株，这些菌株经培养后，按照其培养物同等体积比例配比组成为育苗和养殖循环海水的净水菌剂，在通常育苗和养殖温度下具有产生脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶，降解育苗和养殖中的饵料残渣和养殖动物的排泄物的能力，去除超低浓度氨氮和COD及BOD的作用。与相应的生物反应器适配，适用于工厂化高密度育苗和养殖循环水的氨氮去除和COD的去除处理。
文档编号C02F3/00GK1597563SQ0315864
公开日2005年3月23日 申请日期2003年9月19日 优先权日2003年9月19日
发明者刘志培, 贾省芬, 杨惠芬, 吴建峰, 刘双江 申请人:中国科学院微生物研究所