专利名称：用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的引物组合物、试剂盒及方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域。具体地，本发明涉及一种用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的引物组合物、试剂盒及方法。
背景技术：
近年来，葡萄球菌感染率呈现不断上升的趋势，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcusaureus，MRSA)禾口耐甲氧西林 疑固醇阴性葡萄球菌(Metici 11 in-sensitive coagulase-negativeStaphylococcus, MSCNS)的耐药性逐渐加强，而后者还被称为耐甲氧西林表皮葡萄球菌。其中，MRSA位居医院感染病原菌之首， MRSA感染与乙型病毒性肝炎、获得性免疫缺陷综合征被认为是目前世界上最难解决的三大感染性难题。细菌的耐药性是指细菌多次与药物接触后，对药物的敏感性减小甚至消失，致使药物对耐药菌的疗效降低甚至无效。长久以来，细菌的耐药性并未引起足够的重视，医生们相信现有药物对付耐药菌已经是绰绰有余。比如对天然青霉素耐药的金黄色葡萄球菌，可以应用氨苄青霉素；当氨苄青霉素无效时，还可以换用头孢菌素；甚至于对头孢菌素耐药的MRSA，人们还有最后一道防线——万古霉素。但是在1992年，美国首次发现了对万古霉素产生耐药性的MRSA，这几乎将医生逼到无药可用的尴尬境地。在我国，滥用抗生素的情况十分普遍。据调查，我国约有75%的门诊感冒患者应用抗生素，而外科手术的围手术期应用抗生素的情况则高达95%。在住院患者中，抗生素应用率为79%，这一数字远远高于英国的22%和各国的平均水平30%。同时，由于医生滥开氨苄西林等广谱抗菌类药物，导致人体内菌群失调并诱发二次感染的情况更是屡见不鲜。我国在职医生中不少人至今仍用天然青霉素对付耐药性早已达98%的金葡菌。另外，有的医院不做药敏试验就使用抗生素的情况也十分严重。药敏实验是确定细菌对何种抗生素敏感的重要步骤，不经过这一步就用药， 如同打一场无准备之仗，其效果可想而知。传统的辨别病原菌是否耐药的方法是制片扩散法，该方法需要对临床样本进行培养，检测耗时长。如能在用药之前准确无误的测得所感染菌株的耐药情况，则将对临床用药起到非常好的指导作用。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供一种用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的引物组合物。本发明的另一个目的是提供上述引物组合物在制备用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的工具中的用途。本发明的另一个目的是提供一种用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的试剂盒。本发明的又一个目的是提供一种用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的方法。
本发明的目的是采用以下技术方案来实现的。一方面，本发明提供一种用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的引物组合物，该引物组合物包括用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的引物以及内参引物，其中用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO :1，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO 2 ；内参引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO :7，下游引物核苷酸序列为SEQ ID N0:8o本发明还提供了该引物组合物在制备用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的工具中的用途。优选地，上述引物组合物还包括用于检测金黄色葡萄球菌的引物和/或用于检测表皮葡萄球菌的引物，其中用于检测金黄色葡萄球菌的引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO :3，下游引物核苷酸序列为SEQ IDNO :4;用于检测表皮葡萄球菌的引物的上游引物核苷酸序列为SEQ IDNO :5，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO :6。本发明还提供了该引物组合物在制备用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的工具中的用途，其中葡萄球菌为金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌。另一方面，本发明还提供了一种用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的试剂盒，该试剂盒包括上述引物组合物。该试剂盒还可以包括细胞裂解液、核酸结合液、核酸漂洗液、核酸洗脱液和PCR反应液。又一方面，本发明提供了一种用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的方法，该方法包括以下步骤1)提取样本DNA ;2)使用上述引物组合物或试剂盒对步骤1)得到的DNA进行 PCR扩增；3)检测步骤2)得到的扩增产物。其中，步骤1)中的样本优选为人的血液、体液或组织；步骤3)中的检测方法优选为微流体芯片检测法。在本发明的一个优选实施方案中，通过检测两种葡萄球菌特异性基因和耐药菌特异性基因，来鉴别患者所感染的菌种类别，具体包括以下步骤1)提取人临床样本的DNA ；2)将四种基因，即人的DNA保守序列，金黄色葡萄球特有基因femA，表皮葡萄球菌特有基因SE，耐甲氧西林葡萄球菌特有基因mecA的特异性引物混和，对被测样本的DNA进行多重PCR扩增，被扩增的目标基因片段大小不同。3)扩增产物通过微流体芯片进行检测；4)通过各检测峰的位置确定检测到的片段的大小，从而判断检测到的基因，鉴别临床样本感染的菌种类别。5)结果判断a)未出现任何特异性峰，说明临床样本的DNA没有提取出来，检测无效；b)只出现DNA内参特异性峰，说明没有葡萄球菌感染；c)出现DNA内参和femA特异性峰，说明有甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌感染；d)出现DNA内参和SE特异性峰，说明有甲氧西林敏感表皮葡萄球菌感染；e)出现DNA内参、femA和mecA特异性峰，说明有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染；f)出现DNA内参、SE和femA特异性峰，说明有甲氧西林敏感表皮葡萄球菌和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌感染；g)出现DNA内参、SE和mecA特异性峰，说明有耐甲氧西林表皮葡萄球菌感染；h)出现DNA内参、SE、mecA和femA特异性峰，说明有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林表皮葡萄球菌混合感染。本发明提供了一种可快速便捷检测金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，耐甲氧西林表皮葡萄球菌的方法，该方法简单，成本较低，适宜推广应用。具体地，本发明具有以下有益效果首先，本发明提供了一种用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的引物组合物，其中包括人DNA保守序列和耐甲氧西林葡萄球菌基因mecA，以及任选的金黄色葡萄球特有基因 femA、表皮葡萄球菌特有基因SE的特异性引物。实验表明，通过PCR反应，这些引物较之其它根据其各自的保守序列设计的引物能够更快速、有效地识别出相应的病毒。上述人DNA 保守序列作为内参，选用的是人β球蛋白(β-globin)基因。由于人体细胞中都含有此基因，引入该基因可以确定模板的提取质量，避免扩增结果的假阴性。其次，本发明提供了用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的试剂盒，其中包括人DNA保守序列和耐甲氧西林葡萄球菌基因mecA，以及任选的金黄色葡萄球特有基因femA、表皮葡萄球菌特有基因SE的特异性引物。该试剂盒不仅能高效、特异性的扩增出目的DNA，还能确定模板的提取质量，避免扩增结果的假阴性。本发明提供了一种可快速、便捷检测葡萄球菌种类和/或葡萄球菌耐药性的方法，可以在基因水平上进行迅速的判断，具有较高的灵敏度和特异性。该方法可直接对患者的临床样本(例如血液、体液等)进行检测，不需要对样本进行培养后再对菌株进行检测， 节约了时间。同时，微流体芯片检测法比传统的DNA电泳检测法简单、快捷、直观。为临床用药提供了准确、及时的指导。因此，本发明所提供的方法技术成熟，检测结果稳定，比传统的滤纸片法、凝胶法等更快捷、灵敏、准确。
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中图1为临床样本出现的各种感染耐药菌情况的电泳结果图；图2A 图2G为临床样本出现的各种感染耐药菌情况的微流体芯片结果图；图3A 图3D为感染的不同耐药菌的基因扩增片段的测序比对结果；图4A 图4D为本发明所提供的引物组合物灵敏度的微流体芯片检测结果图；图5A 图5B为本发明所提供的合引物组合物特异性的微流体芯片检测结果图；图6A 图6C为本发明所提供的引物组合物重复性的微流体芯片检测结果图。
具体实施例方式以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。以下实施例中所使用的技术，除非特别说明，均为本领域的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂等，除非是本说明书特别说明，均为本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。实施例1 临床样本的制备本实施例制备本发明检测方法所使用的人体血液样本，详述如下。1、提取试剂A液细胞裂解液，15ml/瓶，每次用200 μ 1。_成份终浓度
权利要求
1.一种用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的引物组合物，该引物组合物包括用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的引物以及内参引物，其中用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO :1，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO :2 ；内参引物的上游引物核苷酸序列为SEQ IDNO :7，下游引物核苷酸序列为SEQ ID N0:8o
2.根据权利要求1所述的引物组合物在制备用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的工具中的用途。
3.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物还包括用于检测金黄色葡萄球菌的引物和/或用于检测表皮葡萄球菌的引物，其中用于检测金黄色葡萄球菌的引物的上游引物核苷酸序列为SEQ IDNO :3，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO :4 ；用于检测表皮葡萄球菌的引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO :5，下游引物核苷酸序列为 SEQ ID NO :6ο
4.根据权利要求3所述的引物组合物在制备用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的工具中的用途，其中葡萄球菌为金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌。
5.一种用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的试剂盒，该试剂盒包括根据权利要求1或3所述的引物组合物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括细胞裂解液、核酸结合液、核酸漂洗液、核酸洗脱液和PCR反应液。
7.—种检测耐甲氧西林葡萄球菌的方法，该方法包括以下步骤1)提取样本DNA；2)使用根据权利要求1或3所述的引物组合物，或根据权利要求5或6所述的试剂盒对步骤1)得到的DNA进行PCR扩增；3)检测步骤2)所得到的扩增产物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的样本为人的血液、体液或组织。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的检测方法为微流体芯片检测法。
全文摘要
本发明提供了用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的引物组合物，其中包括的用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO1，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO2；内参引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO7，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO8。其中还可以包括的用于检测金黄色葡萄球菌的引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO3，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO4；用于检测表皮葡萄球菌的引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO5，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO6。本发明还提供了上述引物组合物的试剂盒。采用所述引物组合物及试剂盒检测耐甲氧西林葡萄球菌的方法，可以在基因水平上进行迅速判断，具有较好的灵敏度和特异性，具有节约时间、技术成熟及检测结果稳定的优点。
文档编号C12Q1/14GK102168130SQ20101012219
公开日2011年8月31日 申请日期2010年2月26日 优先权日2010年2月26日
发明者倪剑锋, 杨文辉, 赵珊珊 申请人:宁波基内生物技术有限公司