专利名称：牡丹籽提取抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物成分的方法
技术领域：
本发明涉及一种药物成份的提取方法，具体的说是牡丹籽提取抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物成分的方法。
背景技术：
随着抗生素的广泛应用，细菌结构、形态的变异，造成越来越多的细菌对抗生素产生耐药性，且耐药程度日益加强。目前将耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染、乙型肝炎病毒HBV和艾滋病并列为世界范围内三大难解决的传染性疾病。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌对多种抗生素均具有耐药性，并且耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的致病力强且治疗效果差，是引起医院临床感染的主要病原菌之一。在临床上对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌引起的感染虽然可用万古霉素治疗，近几年来，万古霉素被越来越多的医院中视为常规抗生素类用药之后，并且也逐渐出现耐药性，目前，对于减缓耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药性增长速度，除通过限制滥用抗生素来减缓耐药MRSA增长速度，同时必须研究开发新的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌所引起的疾病的药物作为后备，以防出现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌疾病的大爆发。因此筛选和开发能够有效抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的抗生素迫在眉睫。牡丹籽在民间常用于治疗腰腿疼痛，具有抗氧化、消炎止痛作用，牡丹籽作为潜在的药用资源，有待深入开发利用。目前牡丹籽多用于育种，炼制牡丹油，其药用价值尚未被得到开发。据前期研究发现显示，牡丹籽油中主要含有亚麻酸，油酸，亚油酸，棕榈酸和硬脂酸等油脂类物质；有关非油脂的化学成分有齐墩果酸，常春藤皂苷元，山奈酚，木犀草素，芹菜素，柯伊利素，豆留醇等物质，另外已知牡丹籽对枯草杆菌，沙门氏菌，根霉菌和黑曲霉菌和巴门氏菌有一定的抑菌作用，而抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的活性尚无相关报道。
发明内容
本发明针对上述问题的不足，提供从牡丹籽中提取抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物成分的方法，其工艺简单，操作方便，从牡丹籽中得到的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物成分含量高，纯度高，抗菌效果显著。本发明为解决上述问题所采用的技术方案是从牡丹籽中提取抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物成分的方法，其具体步骤为
步骤一、按重量分数比取100份牡丹籽和300—400份浓度为60—80%的乙醇溶液，先将牡丹籽粉碎至200—400目的颗粒，在牡丹籽颗粒中加入乙醇溶液，混合均勻，放入容器内，进行密闭浸泡2— 5天，过滤，得到提取液I和滤渣I，备用；
步骤二、在含有滤渣I的容器内加入200—300份浓度为60—80%的乙醇溶液，混合均勻，进行密闭浸泡2— 3天，过滤，得到提取液II和滤渣II，将得到的提取液I和提取液II进行混合，得到混合液，备用；步骤三、按重量分数比取1份的混合液和8—16份的水，混合均勻，静置2—5小时，抽虑得到上清液，备用；
步骤四、按重量分数比取1份上清液和1份乙酸乙酯溶剂，放入分液漏斗中，进行萃取， 得到上层的萃取液I和下层的分离液I，备用；
步骤五、按重量分数比取1份分离液I和1份乙酸乙酯溶剂，放入分液漏斗中，进行萃取，得到萃取液II，将萃取液I和萃取液II混合均勻，静置，得到乙酸乙酯萃取物，备用；
步骤六、按重量分数比取1份乙酸乙酯萃取物和1份饱和正丁醇溶液，放入分液漏斗中，进行萃取，得到上层的萃取液III和下层的分离液II，备用；
步骤七、按重量分数比取1份分离液II和1饱和份正丁醇溶液，放入分液漏斗中，进行萃取，得到萃取液IV，将萃取液III和萃取液IV混合均勻，蒸发去除溶剂，得到产品。有益效果
1、在本发明中，找到一种新型抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物成份。2、在本发明中，通过对牡丹籽进行萃取，得到的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物成份提取物，其产率大于65%，经过检测，具有抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的作用， 提高了牡丹的药用价值。3、提高牡丹的经济效益和药用价值，对牡丹的综合利用及牡丹产业的深加工开辟一条新途径。4、本发明的操作工艺简单、安全、可靠，可充分的应用于大规模生产中。
图1为12小时药敏观察图； 图2为32小时药敏观察图中标号万1为浓度为5mg/mL的万古霉素药敏片，万10为浓度为10mg/mL的万古霉素药敏片，青1为浓度为5mg/mL的青霉素药敏片，青10为浓度为10mg/mL的青霉素药敏片， 正15为浓度为5mg/mL的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物成份提取物的药敏片，正15为浓度为lOmg/mL的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物成份的药敏片。
具体实施例方式牡丹籽提取抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物成分的方法，其具体步骤为 步骤一、按重量分数比取100份牡丹籽和300—400份浓度为60—80%的乙醇溶液，先
将牡丹籽粉碎至200—400目的颗粒，在牡丹籽颗粒中加入乙醇溶液，混合均勻，放入容器内，进行密闭浸泡2— 5天，过滤，得到提取液I和滤渣I，备用；
步骤二、在含有滤渣I的容器内加入200—300份浓度为60—80%的乙醇溶液，混合均勻，进行密闭浸泡2— 3天，过滤，得到提取液II和滤渣II，将得到的提取液I和提取液II进行混合，得到混合液，备用；
步骤三、按重量分数比取1份的混合液和8—16份的水，混合均勻，静置2—5小时，抽虑得到上清液，备用；
步骤四、按重量分数比取1份上清液和1份乙酸乙酯溶剂，放入分液漏斗中，进行萃取， 得到上层的萃取液I和下层的分离液I，备用；
4步骤五、按重量分数比取1份分离液I和1份乙酸乙酯溶剂，放入分液漏斗中，进行萃取，得到萃取液II，将萃取液I和萃取液II混合均勻，静置，得到乙酸乙酯萃取物，备用；
步骤六、按重量分数比取1份乙酸乙酯萃取物和1份饱和正丁醇溶液，放入分液漏斗中，进行萃取，得到上层的萃取液III和下层的分离液II，备用；
步骤七、按重量分数比取1份分离液II和1份饱和正丁醇溶液，放入分液漏斗中，进行萃取，得到萃取液IV，将萃取液III和萃取液IV混合均勻，蒸发去除溶剂，得到产品。实施例一
牡丹籽提取抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物成分的方法，其具体步骤为 步骤一、按重量分数比取100份牡丹籽和300份浓度为60%的乙醇溶液，先将牡丹籽粉碎至200目的颗粒，在牡丹籽颗粒中加入乙醇溶液，混合均勻，放入容器内，进行密闭浸泡2 天，过滤，得到提取液I和滤渣I，备用；
步骤二、在含有滤渣I的容器内加入200份浓度为60%的乙醇溶液，混合均勻，进行密闭浸泡2天，过滤，得到提取液II和滤渣II，将得到的提取液I和提取液II进行混合，得到混合液，备用；
步骤三、按重量分数比取1份的混合液和8份的水，混合均勻，静置2小时，抽虑得到上清液，备用；
步骤四、按重量分数比取1份上清液和1份乙酸乙酯溶剂，放入分液漏斗中，进行萃取， 得到上层的萃取液I和下层的分离液I，备用；
步骤五、按重量分数比取1份分离液I和1份乙酸乙酯溶剂，放入分液漏斗中，进行萃取，得到萃取液II，将萃取液I和萃取液II混合均勻，静置，得到乙酸乙酯萃取物，备用；
步骤六、按重量分数比取1份乙酸乙酯萃取物和1份饱和正丁醇溶液，放入分液漏斗中，进行萃取，得到上层的萃取液III和下层的分离液II，备用；
步骤七、按重量分数比取1份分离液II和1份饱和正丁醇溶液，放入分液漏斗中，进行萃取，得到萃取液IV，将萃取液III和萃取液IV混合均勻，蒸发去除溶剂，得黄色浸膏，即为得到抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物成份的提取物，其提取物的产率为65%。实施例二
牡丹籽提取抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物成分的方法，其具体步骤为 步骤一、按重量分数比取100份牡丹籽和350份浓度为70%的乙醇溶液，先将牡丹籽粉碎至300目的颗粒，在牡丹籽颗粒中加入乙醇溶液，混合均勻，放入容器内，进行密闭浸泡4 天，过滤，得到提取液I和滤渣I，备用；
步骤二、在含有滤渣I的容器内加入250份浓度为70%的乙醇溶液，混合均勻，进行密闭浸泡3天，过滤，得到提取液II和滤渣II，将得到的提取液I和提取液II进行混合，得到混合液，备用；
步骤三、按重量分数比取1份的混合液和12份的水，混合均勻，静置3小时，抽虑得到上清液，备用；
步骤四、按重量分数比取1份上清液和1份乙酸乙酯溶剂，放入分液漏斗中，进行萃取， 得到上层的萃取液I和下层的分离液I，备用；
步骤五、按重量分数比取1份分离液I和1份乙酸乙酯溶剂，放入分液漏斗中，进行萃取，得到萃取液II，将萃取液I和萃取液II混合均勻，静置，得到乙酸乙酯萃取物，备用；
5步骤六、按重量分数比取1份乙酸乙酯萃取物和1份饱和正丁醇溶液，放入分液漏斗中，进行萃取，得到上层的萃取液III和下层的分离液II，备用；
步骤七、按重量分数比取1份分离液II和1份饱和正丁醇溶液，放入分液漏斗中，进行萃取，得到萃取液IV，将萃取液III和萃取液IV混合均勻，蒸发去除溶剂，得到黄色浸膏，即得到抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物成份的提取物，其提取物的产率为67%。实施例三
牡丹籽提取抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物成分的方法，其具体步骤为 步骤一、按重量分数比取100份牡丹籽和400份浓度为80%的乙醇溶液，先将牡丹籽粉碎至400目的颗粒，在牡丹籽颗粒中加入乙醇溶液，混合均勻，放入容器内，进行密闭浸泡5 天，过滤，得到提取液I和滤渣I，备用；
步骤二、在含有滤渣I的容器内加入300份浓度为80%的乙醇溶液，混合均勻，进行密闭浸泡3天，过滤，得到提取液II和滤渣II，将得到的提取液I和提取液II进行混合，得到混合液，备用；
步骤三、按重量分数比取1份的混合液和16份的水，混合均勻，静置5小时，抽虑得到上清液，备用；
步骤四、按重量分数比取1份上清液和1份乙酸乙酯溶剂，放入分液漏斗中，进行萃取， 得到上层的萃取液I和下层的分离液I，备用；
步骤五、按重量分数比取1份分离液I和1份乙酸乙酯溶剂，放入分液漏斗中，进行萃取，得到萃取液II，将萃取液I和萃取液II混合均勻，静置，得到乙酸乙酯萃取物，备用；
步骤六、按重量分数比取1份乙酸乙酯萃取物和1份饱和正丁醇溶液，放入分液漏斗中，进行萃取，得到上层的萃取液III和下层的分离液II，备用；
步骤七、按重量分数比取1份分离液II和1份饱和正丁醇溶液，放入分液漏斗中，进行萃取，得到萃取液IV，将萃取液III和萃取液IV混合均勻，蒸发去除溶剂，得到黄色浸膏，即得到抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物成份的提取物，其提取物的产率为70%。药敏试验
药敏片的制备在浓度为5mg/mL的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物成份的提取物溶液、浓度为10mg/mL的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物成份的提取物溶液、浓度为 5mg/mL的万古霉素溶液、浓度为10mg/mL的万古霉素溶液、浓度为5mg/mL的青霉素溶液和浓度为lOmg/mL的青霉素溶液中放入直径为6mm的药敏纸片，浸泡M小时，制得浓度为 5mg/mL的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物成份提取物的药敏片、浓度为10mg/mL的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物成份的药敏片、浓度为5mg/mL的万古霉素药敏片、浓度为 10mg/mL的万古霉素药敏片、浓度为5mg/mL的青霉素药敏片和浓度为10mg/mL的青霉素药敏片，备用；
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的活化在无菌操作室中，按重量分数比取1份含 3. 2 X IO8CfuAiL的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌悬液和19份琼脂糖培养基，混合均勻，将含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的培养基倒入培养皿中，培养基的厚度为4一5mm，将含有培养基的培养皿放置30分钟，备用；
抑菌实验将制备好的浓度为5mg/mL的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物成份提取物的药敏片、浓度为10mg/mL的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物成份的药敏片、浓度为
65mg/mL的万古霉素药敏片、浓度为10mg/mL的万古霉素药敏片、浓度为5mg/mL的青霉素药敏片和浓度为lOmg/mL的青霉素药敏片分别放置在含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的培养基中，在37°C条件下培养15小时后，观察培养基中的抑菌圈；
结果发现，在培养12小时后观察到，浓度为5mg/mL的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物成份提取物药敏片的抑菌圈为IOmm ；浓度为lOmg/mL的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物成份药敏片的抑菌圈为15mm ；浓度为5mg/mL的万古霉素药敏片的抑菌圈为15mm ；浓度为lOmg/mL的万古霉素药敏片的抑菌圈为20mm ；浓度为5mg/mL的青霉素药敏片无的抑菌圈，而浓度为lOmg/mL的青霉素药敏片有模糊抑菌圈；而在培养32小时后观察到，在浓度为 lOmg/mL的万古霉素药敏片的抑菌圈上出现有单个耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的菌落，表明万古霉素具有耐药性，而抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物成份提取物，具有显著的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的作用，而且抑菌效果稳定，没有耐药性。
权利要求
1.牡丹籽提取抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物成分的方法，其特征在于具体步骤为步骤一、按重量分数比取100份牡丹籽和300—400份浓度为60—80%的乙醇溶液，先将牡丹籽粉碎至200—400目的颗粒，在牡丹籽颗粒中加入乙醇溶液，混合均勻，放入容器内，进行密闭浸泡2— 5天，过滤，得到提取液I和滤渣I，备用；步骤二、在含有滤渣I的容器内加入200—300份浓度为60—80%的乙醇溶液，混合均勻，进行密闭浸泡2— 3天，过滤，得到提取液II和滤渣II，将得到的提取液I和提取液II进行混合，得到混合液，备用；步骤三、按重量分数比取1份的混合液和8—16份的水，混合均勻，静置2—5小时，抽虑得到上清液，备用；步骤四、按重量分数比取1份上清液和1份乙酸乙酯溶剂，放入分液漏斗中，进行萃取， 得到上层的萃取液I和下层的分离液I，备用；步骤五、按重量分数比取1份分离液I和1份乙酸乙酯溶剂，放入分液漏斗中，进行萃取，得到萃取液II，将萃取液I和萃取液II混合均勻，静置，得到乙酸乙酯萃取物，备用；步骤六、按重量分数比取1份乙酸乙酯萃取物和1份饱和正丁醇溶液，放入分液漏斗中，进行萃取，得到上层的萃取液III和下层的分离液II，备用；步骤七、按重量分数比取1份分离液II和1饱和份正丁醇溶液，放入分液漏斗中，进行萃取，得到萃取液IV，将萃取液III和萃取液IV混合均勻，蒸发去除溶剂，得到产品。
全文摘要
牡丹籽提取抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物成分的方法，取牡丹籽和乙醇溶液混合，后密闭浸泡2—5天，得到提取液Ⅰ和滤渣Ⅰ，利用乙醇再次对滤渣Ⅰ进行浸泡，得到提取液Ⅱ，将两次提取液混合，加水混合后，静置得到上清液，用乙酸乙酯溶剂对得到的上清液进行两次萃取，得到的两次萃取液混合，后加入正丁醇饱和溶液，进行两次萃取，将得到的两次正丁醇萃取液混合，放置2—5天，得到产品。本发明的牡丹籽提取抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物成分的方法，其工艺简单，操作简单，从牡丹籽中得到的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物成分含量高，纯度高，抗菌效果显著。
文档编号A61K131/00GK102362895SQ20111036831
公开日2012年2月29日 申请日期2011年11月19日 优先权日2011年11月19日
发明者刘普, 尹卫平, 李亮, 李文渊, 邓瑞雪 申请人:河南科技大学