专利名称：一种神经生长因子-紫杉醇偶联物及其制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种以神经生长因子(NGF)为载体的、可以靶向输送紫杉醇的受体介导的药物与载体的偶联物。
背景技术：
紫杉醇(paclitaxel，Taxol)是一种复杂的二萜类化合物，最早是从太平洋紫杉树(pacific Yew)树皮中分离出的一种天然产物[参见WaniMC, Taylor HL,
Wal1ME,et al. Plant antitumor agents. VI. The isolation and structure of taxol, a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia. J Am Chem Soc, 1971，93(9):
2325.]。紫杉醇具有良好的抗癌活性，是继阿霉素和顺钼之后的第三代抗肿瘤药物。 紫杉醇使细胞的微管蛋白和组成微管蛋白的二聚体失去平衡，导致细胞在有丝分裂时不能形成纺锤体和纺锤丝，抑制了细胞分裂和增殖，使癌细胞停止在G2期和M期，直至死亡，进而起至丨J抗癌作用[参见1. Horwitz SB. Mechanism of action of taxol. Trends Pharmacol Sci,1992,13 (4) :134.2.Stierle A, Strobel G,Stierle D，et al. The search for a taxol-producing microorganism among the endophytic fungi of the Pacific yew, Taxus brevifolia. J Nat Prod, 1995, 58 (9): 1315]。其临床抗肿瘤效果明显，广泛用于卵巢癌、乳腺癌以及非小细胞肺癌等的治疗。在1992年2月四日美国食品药品监督管理局(FDA)正式批准紫杉醇作为新的抗肿瘤药物上市。尽管紫杉醇具有很大的应用价值和不错经济效益，但是它本身存在明显的缺点 首先，紫杉醇在水中的溶解度极低，几乎不溶于水中，其在水中的溶解度仅为0. 25ug/ml, 由于这一缺点的存在，使得其在肿瘤治疗中有很大的缺陷；其次，大量的临床治疗结果表明，紫杉醇本身对正常细胞也存在很大的杀伤作用，在杀死肿瘤细胞的同时，也会杀死正常细胞；最后，很多的临床治疗结果表明，在以紫杉醇为肿瘤治疗药物的同时，由于紫杉醇的神经毒性的存在[参见:Nabholtz JM, Gelmon K, Bontenbal Μ, et al. Multicenter, randomized comparative study of two doses of paclitaxel in patients with metastatic breast cancer. J Clin Oncol, 1996，14 (6) :1858]，可以造成肿瘤患者的神经损伤，造成很大的副作用，给肿瘤患者带来很大的痛苦。因此，针对紫杉醇存在的这些缺点， 利用物理化学的方法提高其溶解度，增强其靶向作用，并尽可能的降低其神经毒性，是一个亟待解决的问题。神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是一种存在于神经系统的营养因子，其对外周神经系统及中枢神经系统的神经细胞的分化和生长均有调节作用，从而起到保护神经细胞的作用，进而促进神经损伤的修复[参见=Bermet MR, Gibson WG, Lemon G. Neuronal cell death, nerve growth factor and neurot rophic models:50 years on. Auton Neurosci, 2002，95 (122) : 1223]。近年来的研究发现，神经生长因子的两种受体广泛存在于肿瘤细胞表面，可以特异性的结合神经生长因子，达到靶向的作用。因此，利用神经生长因子的这一特性，可以开发以神经生长因子为载体的紫杉醇靶向药物，在解决紫杉醇的水溶性的同时，提高其靶向作用，同时由于神经生长因子的神经营养作用，可以降低由于紫杉醇的神经毒性所造成的神经损伤作用，使紫杉醇的应用得到进一步扩大。
发明内容
本发明的目的是提供一种以神经生长因子为载体的紫杉醇的靶向偶联药物。本发明的技术方案如下
一种神经生长因子-紫杉醇偶联物，它是以神经生长因子为载体，通过丁二酸与紫杉醇偶联的神经生长因子-紫杉醇偶联物，该偶联物是一个神经生长因子上连接有1-6个紫杉醇分子的神经生长因子-紫杉醇偶联物。它的组成可以以下式表示
其中，NGF为小鼠颂下腺中提取的神经生长因子(nerve growth factor，NGF)，分子量在138-141KD，η为与一个神经生长因子分子结合的紫杉醇分子数，所述η为1_6 ； 上述神经生长因子-紫杉醇偶联物显示出如下物化特征
(1)外观白色粉末固体；
(2)紫外吸收光谱:217nm,280nm；
(3)红外光谱34220^1,沘88cnT1，1657 cm-1,1467 cm-1,1369 cm-1,1242 cm-1,1105 cm_1,962 cm_1,629 cnT1。 —种制备上述的神经生长因子-紫杉醇偶联物的方法，它包括如下步骤
(1)溶液A的制备将4-12mg紫杉醇与丁二酸酐按摩尔比为1:2 1:10的比例溶在无水吡啶中，磁力搅拌，室温反应5小时后，蒸馏除去吡啶，加入Iml的二甲基甲酰胺(DMF) 溶解产物，加入4. 5mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和3. Omg的二环己基碳二亚胺(DCC)，磁力搅拌反应4小时，得到活化的紫杉醇丁二酸酐酯，离心，取上清液，即为溶液A，备用；
(2)溶液B的制备提取小鼠颂下腺神经生长因子，并采用考马斯亮兰法测定提取得到的神经生长因子的质量，按照紫杉醇和神经生长因子的摩尔比20 1 60 1的量，将神经生长因子溶解于0. 02mol/l PH6. 8的磷酸盐缓冲液中，即得到溶液B，浓度范围为0. 3 0. 9mg/ml ；
(3)偶联4°C条件下，在磁力搅拌的条件下，将溶液A逐滴加入到溶液B中，然后继续在4°C条件下，让其继续反应对 50小时后，取出离心，取上清液，浓缩后，上葡聚糖凝胶层析纯化，即得溶液C ；
(4)4°C条件下，以双蒸水为透析外液，磁力搅拌的条件下，透析48 72小时，每10小时换一次透析液；
(5)冻干透析后的溶液，得到白色的紫杉醇偶联物。本发明的制备流程图见图1。在本发明中，采用红外光谱表征紫杉醇丁二酸酐酯的合成，以及紫杉醇与神经生长因子的偶联物，同时以紫杉醇为对照；采用高效液相色谱法和紫外分光光度法，计算偶联物中紫杉醇的含量。本发明的神经生长因子-紫杉醇偶联物在提高紫杉醇水溶性的同时，增强其靶向性；同时以神经生长因子为载体，在靶向输送药物的同时，修复由紫杉醇导致的神经损伤。 通过研究我们发现，以神经生长因子为载体，以丁二酸酐为紫杉醇和神经生长因子的连接臂，在紫杉醇的2位羟基上发生键合反应，得到了在2位羟基上连接神经生长因子的偶联物。有益效果
本发明的神经生长因子-紫杉醇偶联物为白色固体，与紫杉醇原料药相比，其溶解度提高约20 50倍。由于神经生长因子的存在，使得其具有靶向的作用，可以降低对正常细胞的损伤，有效的保护患者的生命安全，也提高了紫杉醇的应用。将紫杉醇偶联物和紫杉醇原料药配制成一系列的不同浓度样品，加入到Hela细胞和U251细胞中，观察48小时内肿瘤细胞的变化，同时采用MTT法，测定吸光度，并计算偶联物和对照紫杉醇原料药对上述两种肿瘤细胞的抑制率，与紫杉醇原料药相比，相同浓度条件下，其体外抑制肿瘤细胞的能力要强于紫杉醇原料药。
图1 本发明制备过程的流程示意图。图2:紫外吸收光谱图，
其中1:神经生长因子；2:紫杉醇；3:紫杉醇神经生长因子偶联物。图3 紫杉醇的红外光谱图。图4 神经生长因子-紫杉醇偶联物的红外光谱图。图5 紫杉醇原料药和神经生长因子-紫杉醇偶联物对U251细胞48小时抑制实验变化图，其中空心曲线为紫杉醇原料药抑制曲线，实心曲线为偶联物抑制曲线。图6 紫杉醇原料药和神经生长因子-紫杉醇偶联物对Hela细胞48小时抑制实验变化图，其中空心曲线为紫杉醇原料药抑制曲线，实心曲线为偶联物抑制曲线。
具体实施例方式
以下实施例所用材料和仪器
实验材料丁二酸酐(上海楷洋生物技术有限公司);N，N' -二环己基碳酰亚胺(国药集团化学试剂有限公司);N-羟基琥珀酰亚胺(上海楷洋生物技术有限公司);CM-52 (Whatman);CM-sepharose Fast Flow (GE Health care)；
Sephadex G_50 (GE Health care)；透析袋(上海绿鸟科技有限公司)；MTT粉末(碧云天生物技术研究所)
实验仪器旋转蒸发仪(Heidolph公司，德国)；H66025超声清洗机(无锡超声电子设备厂)；磁力搅拌器(江苏金坛医疗仪器厂)；新飞冰箱(新飞集团)；离心机(Biofuge Stratos Hereaus德国)；UV — MOlPC紫外扫描仪(日本岛津)；二氧化碳培养箱(Thermo，美国)
实施例1
(1)溶液A的制备称取5mg的紫杉醇溶于Iml的无水吡啶中，然后加入2mg的丁二酸酐，室温条件下，磁力搅拌反应3小时，生成紫杉醇丁二酸酐酯，经旋转蒸发除去吡啶，并稀盐酸洗过后，将紫杉醇丁二酸酐酯溶于Iml的DMF中，加入4. 5mg的NHS和3. Omg的DCC，室温搅拌反应3小时，即得活化的紫杉醇丁二酸酐酯；
(2)溶液B的制备提取小鼠颂下腺神经生长因子，并采用考马斯亮兰法测定提取得到的神经生长因子的质量，按紫杉醇与神经生长因子的摩尔比20 1，以0. 02mol/L的pH6. 8的磷酸缓冲液为溶剂，配制浓度为0. 4mg/ml的神经生长因子85ml ；
(3)偶联4°C条件下，在磁力搅拌的条件下，将上述溶液A逐滴加入到上述溶液B中， 然后继续在4°C条件下，让其继续反应M 50小时后，取出离心，取上清液，浓缩后，上葡聚糖凝胶层析纯化，即得溶液C ；
(4)4°C条件下，以双蒸水为透析外液，磁力搅拌的条件下，透析48 72小时，每10小时换一次透析液；冻干透析后的溶液，得到白色的神经生长因子-紫杉醇偶联物。通过紫外吸收光谱确定产物的吸收峰位于217nm，^Onm。实施例2
(1)溶液A的制备称取^ig的紫杉醇溶于Iml的无水吡啶中，然后加入2mg的丁二酸酐，室温条件下，磁力搅拌反应4小时，生成紫杉醇丁二酸酐酯，经旋转蒸发除去吡啶，并稀盐酸洗过后，将紫杉醇丁二酸酐酯溶于Iml的DMF中，加入^ig的NHS和3. Omg的DCC，室温搅拌反应3小时，即得活化的紫杉醇丁二酸酐酯；
(2)溶液B的制备提取小鼠颂下腺神经生长因子，以考马斯亮兰法测定神经生长因子的质量，按紫杉醇与神经生长因子的摩尔比沈1，以0. 02mol/l的pH6. 8的磷酸缓冲液为溶剂，配制浓度为0. 4mg/ml的神经生长因子55ml ；
(3)偶联4°C条件下，在磁力搅拌的条件下，将溶液A逐滴加入到溶液B中，然后继续在4°C条件下，让其继续反应对 50小时后，取出离心，取上清液，浓缩后，上葡聚糖凝胶层析纯化，即得溶液C ；
(4)4°C条件下，以双蒸水为透析外液，磁力搅拌的条件下，透析48 72小时，每10小时换一次透析液；冻干透析后的溶液，得到白色的紫杉醇偶联物。通过紫外吸收光谱确定产物的吸收峰位于217nm，280nm。实施例3
(1)溶液A的制备称取8mg的紫杉醇溶于Iml的无水吡啶中，然后加入5mg的丁二酸酐，室温条件下，磁力搅拌反应5小时，生成紫杉醇丁二酸酐酯，经旋转蒸发除去吡啶，并稀盐酸洗过后，将紫杉醇丁二酸酐酯溶于Iml的DMF中，加入5mg的NHS和4. Omg的DCC，室温搅拌反应4小时，即得活化的紫杉醇丁二酸酐酯；(2)溶液B的制备提取小鼠颂下腺神经生长因子，以考马斯亮兰法测定神经生长因子的质量，按紫杉醇与神经生长因子的摩尔比35 1，以0. 02mol/l的pH6. 8的磷酸缓冲液为溶剂，配制浓度为0. 6mg/ml的神经生长因子58ml ；
(3)偶联4°C条件下，在磁力搅拌的条件下，将溶液A逐滴加入到溶液B中，然后继续在4°C条件下，让其继续反应对 50小时后，取出离心，取上清液，浓缩后，上葡聚糖凝胶层析纯化，即得溶液C ；
(4)4°C条件下，以双蒸水为透析外液，磁力搅拌的条件下，透析48 72小时，每10小时换一次透析液；冻干透析后的溶液，得到白色的紫杉醇偶联物。通过紫外吸收光谱确定产物的吸收峰位于217nm，280nm。实施例4
(1)溶液A的制备称取8mg的紫杉醇溶于Iml的无水吡啶中，然后加入8mg的丁二酸酐，室温条件下，磁力搅拌反应5小时，生成紫杉醇丁二酸酐酯，经旋转蒸发除去吡啶，并稀盐酸洗过后，将紫杉醇丁二酸酐酯溶于Iml的DMF中，加入5mg的NHS和4. Omg的DCC，室温搅拌反应3小时，即得活化的紫杉醇丁二酸酐酯；
(2)溶液B的制备提取小鼠颂下腺神经生长因子，以考马斯亮兰法测定神经生长因子的质量，按紫杉醇与神经生长因子的质量摩尔比44:1，以0. 02mol/l的pH6. 8的磷酸缓冲液为溶剂，配制浓度为0. 7mg/ml的神经生长因子41ml ；
(3)偶联4°C条件下，在磁力搅拌的条件下，将溶液A逐滴加入到溶液B中，然后继续在4°C条件下，让其继续反应M 50小时后，取出离心，取上清液，浓缩后，上葡聚糖凝胶层析纯化，即得溶液C;
(4)4°C条件下，以双蒸水为透析外液，磁力搅拌的条件下，透析48 72小时，每10小时换一次透析液；冻干透析后的溶液，得到白色的紫杉醇偶联物。通过紫外吸收光谱确定产物的吸收峰位于217nm，280nm。实施例5
(1)溶液A的制备称取12mg的紫杉醇溶于Iml的无水吡啶中，然后加入Hmg的丁二酸酐，室温条件下，磁力搅拌反应5小时，生成紫杉醇丁二酸酐酯，经旋转蒸发除去吡啶，并稀盐酸洗过后，将紫杉醇丁二酸酐酯溶于Iml的DMF中，加入6mg的NHS和4. Omg的DCC，室温搅拌反应5小时，即得活化的紫杉醇丁二酸酐酯；
(2)溶液B的制备提取小鼠颂下腺神经生长因子，以考马斯亮兰法测定神经生长因子的质量，按紫杉醇与神经生长因子的摩尔比58 1，以0. 02mol/l的PH6. 8的磷酸缓冲液为溶剂，配制浓度为0. 8mg/ml的神经生长因子37ml ；
(3)偶联4°C条件下，在磁力搅拌的条件下，将溶液A逐滴加入到溶液B中，然后继续在4°C条件下，让其继续反应对 50小时后，取出离心，取上清液，浓缩后，上葡聚糖凝胶层析纯化，即得溶液C ；
(4)4°C条件下，以双蒸水为透析外液，磁力搅拌的条件下，透析48 72小时，每10小时换一次透析液；冻干透析后的溶液，得到白色的紫杉醇偶联物。通过紫外吸收光谱确定产物的吸收峰位于217nm，^Onm。实施例6
体外培养人肿瘤细胞U251取指数生长期的细胞，用胰酶消化后，1500 rpm离心5 min,将细胞重悬于培养基中；将细胞浓度调至为2 X IO4个/mL，接种于96孔细胞培养板中，每孔 100 μ L，阴性对照组放入二氧化碳培养箱培养对h ；每孔加入受试药物，终浓度为0. 125， 0. 25,0. 5,1,1. 75 nmol/L，各组均设3个复孔。分别在加药48 h后，每孔加入5 mg/mL MTT 试剂20 μ L，继续置于37°C培养4 h。每孔加入DMSO 100 μ L，振荡混勻，测定各孔在波长 570 nm处的吸光度值。计算U251细胞增殖抑制率抑制率(％) = (1 -实验组吸光度/对照组吸光度)X100%。
实施例7
体外培养人肿瘤细胞HeLa取指数生长期的细胞，用胰酶消化后，1500 rpm离心5 min, 将细胞重悬于培养基中；将细胞浓度调至为2 X IO4个/mL，接种于96孔细胞培养板中，每孔 100 μ L，阴性对照组放入二氧化碳培养箱培养对h ；每孔加入受试药物，终浓度为0. 125， 0. 25,0. 5,1,1. 75 nmol/L，各组均设3个复孔；。加药48 h后，每孔加入5 mg/mL MTT试剂 20 yL，继续置于37°C培养4 h。每孔加入DMSO 100 μ L，振荡混勻，测定各孔在波长570 nm处的吸光度值。计算HeLa细胞增殖抑制率抑制率(％)= (1 -实验组吸光度/对照组吸光度)X 100%。
权利要求
1.一种神经生长因子-紫杉醇偶联物，其特征是它是以神经生长因子为载体，通过丁二酸与紫杉醇偶联的神经生长因子-紫杉醇偶联物，该偶联物是一个神经生长因子上连接有1-6个紫杉醇分子的神经生长因子-紫杉醇偶联物。
2.根据权利要求1所述的神经生长因子-紫杉醇偶联物，其特征是所述的神经生长因子的分子量为138-141KD。
3.一种制备权利要求1所述的神经生长因子-紫杉醇偶联物的方法，其特征是它包括如下步骤步骤1.溶液A的制备将4-12mg紫杉醇与丁二酸酐按摩尔比为1:2 1:10的比例溶在无水吡啶中，磁力搅拌，室温反应5小时后，蒸馏除去吡啶，加入Iml的二甲基甲酰胺 (DMF)溶解产物，加入4. 5mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和3. Omg的二环己基碳二亚胺(DCC)， 磁力搅拌反应4小时，得到活化的紫杉醇丁二酸酐酯，离心，取上清液，即为溶液A，备用；步骤2.溶液B的制备提取小鼠颂下腺神经生长因子，并采用考马斯亮兰法测定提取得到的神经生长因子的质量，按照紫杉醇和神经生长因子的摩尔比20:1 60:1的量， 将神经生长因子溶解于0.02mol/l PH6. 8的磷酸盐缓冲液中，即得到溶液B，浓度范围为 0. 3 ~ 0. 9mg/ml ；步骤3.偶联4°C条件下，在磁力搅拌的条件下，将溶液A逐滴加入到溶液B中，然后继续在4°C条件下，让其继续反应M 50小时后，取出离心，取上清液，浓缩后，上葡聚糖凝胶层析纯化，即得溶液C;步骤4.在4°C条件下，以双蒸水为透析外液，磁力搅拌的条件下，将溶液C透析48 72小时，每10小时换一次透析液；步骤5.冻干透析后的溶液，得到白色的神经生长因子-紫杉醇偶联物。
4.权利要求1所述的神经生长因子-紫杉醇偶联物在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
一种神经生长因子-紫杉醇偶联物，它是以神经生长因子为载体，通过丁二酸与紫杉醇偶联的神经生长因子-紫杉醇偶联物，该偶联物是一个神经生长因子上连接有1-6个紫杉醇分子的神经生长因子-紫杉醇偶联物。本发明的神经生长因子-紫杉醇偶联物为白色固体，与紫杉醇原料药相比，其溶解度提高约20～50倍。由于神经生长因子的存在，使得其具有靶向的作用，可以降低对正常细胞的损伤，有效的保护患者的生命安全，也提高了紫杉醇的应用。与紫杉醇原料药相比，相同浓度条件下，其体外抑制肿瘤细胞的能力要强于紫杉醇原料药。
文档编号A61K47/48GK102516385SQ201110367988
公开日2012年6月27日 申请日期2012年2月7日 优先权日2012年2月7日
发明者余江南, 刘宏飞, 徐希明, 曹霞, 闫真芳, 黄治民 申请人:江苏大学