专利名称：蓝莓提取物用于预防阿尔茨海默病的制作方法
技术领域：
本发明属于药学领域。具体涉及蓝莓提取物对β -淀粉样蛋白及同型半胱氨酸诱导的PC12细胞损伤的保护作用。
背景技术：
阿尔茨海默病(Alzheimer，s Disease,AD)是一种神经退行性疾病。主要的临床表现为认知和记忆功能不断恶化，并伴随各种神经精神症状和行为障碍。在我国65岁以上的老年人中患病率约为5%。AD的主要病理特征之一是在大脑皮层和海马出现由β -淀粉样蛋白(Αβ)聚积形成的老年斑(SP)。大量研究已经表明，Αβ在AD的病中起着相当重要的作用。Αβ的神经毒性能引起氧化应激，线粒体损伤，激活凋亡因子，启动细胞的凋亡。同时，临床研究证明血浆中同型半胱氨酸水平增高可增加AD的发病率。因此，减少Αβ的生 成，抑制Αβ或同型半胱氨酸引起的神经损伤是研究AD治疗的热点之一。目前治疗AD的药物主要是神经营养药、拟胆碱药或胆碱酯酶抑制剂，均属对证治疗药物，不能减缓AD病情的发展。蓝莓(Vaccinium myrtillus L.)制剂现已广泛用于各种保健品，可预防眼科及心血管方面的疾病。然而蓝莓提取物对AD的预防作用还未见报道。
发明内容
本发明的目的是为蓝莓物用于预防海默病提供细胞水平的依据。发明人经过多次药理学实验，发现含25 %总花青素的蓝莓提取物可有效对抗A β 25_35及同型半胱氨酸引起的细胞毒性，抵制细胞凋亡及凋亡蛋白caspase-3的表过。该药理作用在本发明以前尚无文献报道。
图1，和对照组比较，经Αβ25_35处理后细胞核出现凋亡特征表现为细胞核变小或破碎，荧光增强。蓝莓提取物预处理可有效抑制A β25_35诱导的细胞凋亡。蓝莓提取物对A β 25_35诱导的PC12细胞凋亡的影响(Α :对照组，B Α β 25_35处理组，C :25 μ M蓝莓提取物预处理组，D :50 μ M蓝莓提取物预处理组)图2，和对照组比较Αβ 25_35处理后PC12细胞caspase-3的表达显著增高。蓝莓提取物预处理可有效降低caspase-3的表达。蓝莓提取物抑制A β 25_35诱导的caspase-3表达增高。
具体实施例方式细胞培养PC12细胞于37°C、5% CO2培养箱培养。培养基为含8%胎牛血清，8%马血清的DMEM培养液。取对数生长期的细胞以1Χ 104/100 μ I接种于96孔板，37°C培养24h。药物处理蓝莓提取物由香港东方保健品公司提供。细胞加入终浓度为0-50 μ M的蓝莓提取物，培养24h以观察蓝莓提取物的细胞毒性。细胞先不同浓度的蓝莓提取物预处理lh，再加入O. 5 μ M A β 25_35或5mM同型半胱氨酸继续培养24h以观察蓝莓提取物对Aβ 25-35及同型半胱氨酸毒性的对抗作用。MTT细胞活力测定药物处理后，去除培养液，每孔加入50 μ IMTT溶液(终浓度
O.5mg/ml)，37°C培养 4h 后，每孔加入 50 μ IMTT 裂解液(20% SDS, 50% DMFpH4. 7)，37°C 反应过夜。酶标仪检测各组细胞570nm的OD值。将OD值转换为百分比(％ )。未经药物处理的细胞OD值设为100%。每组6空对照，结果用X土SD表示。荧光显微镜检测细胞凋亡将生产良好的PC12细胞接种于6孔板，37°C孵育24h。分组及药物处理同上。弃除培养液，用4%多聚甲醛于4°C固定30min。用磷酸缓冲液(O. IMPBS, pH7. 4)漂洗后，加入终浓度为5 μ g/ml的Hochest33258避光染色lOmin，PBS漂洗后
封片，荧光显微镜观察细胞核凋亡。Western blot 检测 caspase-3 的表达方法将生长良好的PC12细胞接种于6孔板，37°C孵育24h。分组及药物处理同上。用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度。用12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白。电泳后蛋白转移至PVDF膜，用含5%脱脂牛奶的TBST缓冲液(含O. 05%Tween20的TBS缓冲液)室温封闭lh。将膜与溶解于TBST缓冲液的caspase-3 —抗4°C孵育过夜。TBST洗涤5minX 3次后，将膜与溶解于TBST缓冲液的辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育Ih。TBST洗涤5minX3次，用ECL化学发光法检测蛋白表达。附图I说明和对照组比较，经Αβ25_35处理后细胞核出现凋亡特征表现为细胞核变小或破碎，荧光增强。蓝莓提取物预处理可有效抑制A β 25_35诱导的细胞凋亡。蓝莓提取物对Αβ25_35诱导的PC12细胞凋亡的影响(Α :对照组，B :Αβ25_35&理组，C : 25 μ M蓝莓提取物预处理组，D : 50 μ M蓝莓提取物预处理组)附图2说明和对照组比较Αβ 25_35处理后PC12细胞caspase-3的表达显著提高。蓝莓提取物预处理可有效降低caspase-3的表达。
权利要求
1.蓝莓提取物对β-淀粉样蛋白致PC12细胞损伤的保护作用。
2.蓝莓提取物对同型半胱氨酸致PC12细胞损伤的保护作用。
3.蓝莓提取物对β-淀粉样蛋白致PC12细胞核凋亡的抑制作用。
4.蓝莓提取物对β_淀粉样蛋白致caspase-3表达增强的抑制作用。
5.蓝莓提取物对阿尔茨海默病的预防作用。
6.如权利要求1-4任一项中的应用，其中所述的蓝莓提取物有效成分含25%的总花青素。
全文摘要
本发明蓝莓提取物用于预防阿尔茨海默病，首次通过体外实验证明，含25％总花青素的蓝莓提取物可有效抑制β-淀粉样蛋白及同型半胱氨酸引起的PC12细胞凋亡。蓝莓提取物可进一步开发用于预防阿尔茨海默病。
文档编号A61P25/28GK102641351SQ20111036751
公开日2012年8月22日 申请日期2011年11月18日 优先权日2011年11月18日
发明者刘静怡, 张艳波, 施祖荣, 童瑶 申请人:张艳波