专利名称：：用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的β片层阻断肽的制作方法
技术领域：
：本发明涉及多肽及其用途，更具体而言，本发明涉及一类可用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的P片层阻断肽，以及J斤述多肽用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的用途。
背景技术：
：阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease,AD)又称老年痴呆症，是一种神经退行性疾病，起病隐匿，病程呈进行性，典型的临床特征是综^^人知能力损害^LA^改变，表现为早期近期记忆力障碍，继而表5W续性智能衰退、失语、判断#^能力丧失^:动障*。这一疾病严重影响患者及其家^员的生活质量，*患者家庭和社^^沉重负担。随着人口老龄^^程的加快，老年性疾病已成为一个明显影响人类健康的突出问题。老年性痴呆和恶性肺瘤、心脑血管意外并列为导致老年人死亡的三大疾病，被喻为21世纪人类他泉的第四大敌。世界卫生组织已将AD列入21世纪五大重点疾病之一。我国于1999年i^v^^社会。2004年底，我国60岁及以上老年人口iiJ!]1.43亿，占总人口的10.97%。鄉测，这一数字在2014年将iifij2亿，2026年iiJij3亿，2037年超过4亿，2051年iiJ)J最大值，之后一直维持在3亿~4亿的,。老^^人口的不断增多，4吏阿尔茨海默病的发病率相对上升。据了解，目前，欧洲、日本和美国80岁以上的人口中有20%以上的人患有此病。4Mfr界65岁以JiA口中有5000多万人患有不同种类的痴呆症。阿尔茨海默病的病理学改变的主JHt征为神经细^L间形成大量由p淀粉样肽(p-amyloidp印tide，简写为AP或PA)沉积形成的老年斑(senileplaque,SP)、神经细胞内过度磷酸化的Tau蛋白所致的神经元纤维缠结(neurofibrillarytangle,NT)和神纟狄大量丟失。众多证据表明A^的神经毒f生是所有病因的共同交汇点。因此耙向AP的预防和/或治疗已成为近年来AD研究的焦点之一。AP是P淀粉样前体蛋白(p-amyloidprecursorprotein,APP)的代谢产物。正常情况下APP在cc分泌酶作用下，生成可溶性的sAPPct，sAPPa具有If^氐细胞内钩浓度，调节突触可塑性、M突触的生^p保护神经元的功能，这是APP加工的主^"形式，这一途径不产生AP;另一途径是APP在P分泌酶作用下产生sAPPP和C99，C99进一步在Y分泌酶作用下，#^^肽。y分泌酶水解C99是不均一的，酶切丙氨酸713和苏氨酸714之间位点产生APi-42;酶切缬氨酸711和异亮氨酸712之间的位点产生APi—40(SelkoeDJ.Alzheimer'sdisease:genes,proteins,andtherapy.PhysiolPev,2001，81(2):741-766)。APi-42占AP蛋白总量的10。/。左右，Ah—40大约占90°/。，<SAPi-42则更容易聚集，聚集的AP1-42是构成老年斑的_4^成分。APi-42肽的一级结构如下所示(SEQIDNO:4):Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser~Gly-Tyr-Glu-Va1-His—His-GIn—151015Lys-Leu-Va1-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Va1-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-16202530Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-GlyGly-Val-Val-Ile-Ala31354042A&i-42C端的10个絲^J^33~42及17~21位的絲Wl^具有高度的疏;do性，构成了ApH2疏水区；28-42位M^J^形成e折叠构象的可能性较大，而9-21位的^J^^t^也可能形成P折叠构象。P折叠构象有利于A^—42肽的聚集。实m果表明，C端的Val4。Ile"Ala42三个絲^JjftP折叠的构#^到了稳定的作用，有利于P折叠的形成。A&肽H2的N端具有亲水性，才娥溶液M的不同，能够形成oc螺i,无规螺i或e折叠的构象。研究结a明P折叠构象有利于AP肽的聚集，而Ae肽的聚集又是由于其疏水区的相互作用。Soto等人(SotoC，KindyMS,Ba咖annM，etal.,InhibitionofAlzheimer'samyloidosisbypeptidesthatpreventbeta-sheetconformation.Biochem.Biophys.Res.Commun.1996，226(3):672-680)用脯氨酸取代AP肽疏水区附近的^酸，得到的小肽不仅不会形成P折叠的构象，同时还可以与AP糾目结合，使其维持无规螺凌的构象，抑制其聚集。研究结果发现A^肽的疏水区之一A016—M五肽片段Lys-Leu-Val-Phe-Phe能与AP糾目结合，从而阻止其聚集。通过丙氨酸逐个取代，表明Lys16、Leu17、和Phe"在其中起了关键作用。这说明了A"—2。絲是AP肽聚集过程中与邻近AP肽街目结合的部位。研究显示AP的空间构象明显影响其聚集能力，当其二^构以oc螺^7主时，聚集较慢；而以M斤叠为主时，聚集l^快。在一定条件下，富含N斤叠的结构疏水区暴露，会促使AP聚集，形成低聚物，最终成为不可溶性物质树狄间隙^^,产生神经毒l"生并引战内胶质细胞活性增高，产生炎性介质和4傳，共同形成淀粉样斑块。衬的疏水性电荷数增多是AP聚集的主要原因之一。与Ap1-40相比APH2延长的两个JL^酸不仅增加了AP的疏水性，4吏其更易聚集，而且提高了聚集物的稳定性，早期即可选择'lt^淀粉样斑块中i5C^。A^H2可能是可溶性AP形成寡聚物、纤维和斑块的始动因素(Younkin，S.G.1995.EvidencethatAbeta42istherealculpritinAlzheimer'sdisease.Ann.Neurol.37:287-288.;MatsuokY，SaitoM，UfrancoisT,etal.Nova1therapeuticapproachforthetreatmentofAlzheimer'sdiseasebyperipheraladministrationofagentswithanaffinitytoP-amyloid[J].JNeurosci,2003，23(1):1-5)。Jarrett等提出A0H2是作为"种子"首先聚集启动了AP的沉积；其他单^i^聚集到核的周围，延长(elongation)肽链形成纤维进一步聚集并传播,^^F形成斑块(Jarrettn，LansburyPTJr.Seeding"one-dimensionalcrystallization"ofamyloid:apathogenicmechanisminAlzheimer'sdiseaseandscrapieCell.1993，(6):1055-1058)。从AP聚集、沉淀再到老年斑的形成及其伴随的神经元损害被认为是阿尔茨海默病的病理^U制的中心环节。因此，若能够抑制AP肽的聚集，加速A0肽的降解与清除，便能够从才ML上达到预防和/或治疗AD的目的。目前国际上针对AP的药物的研究目标是减少AP的生成，增加AP清除、预防或逆转AP聚集和抑制AP的44生等。美国华盛顿大学医学院的研究人员发现，在清除阿尔茨海默病小鼠脑内的淀粉蛋白斑块后，小鼠的脑细胞开始奇迹般地'1^X功能。表明针对Ap的药物有着令A^舞的前景。在各种针对AP的药物中，P片层阻断剂^i^为人关注。当前国际上属于P片层阻断剂的药物主要有以下两种(1)加拿大Neurochem公司根据低相对分子质量氨基糖蛋白(gly-cosaminoglycan，GAGs)在P淀粉^^白斑块中起稳定斑块作用并P聘斑块降解这一发现，设计并合成了该GAG的衍生4^物。动物体内实^^表明，该类^^目对^"质量GAG类似物可以显著降低p淀粉#^白#浆和脑内水平，抑制Ap聚集，用于治疗AD。目前小^M^物Alzhemed处于111期临床*阶段c(2)Chac6n等(Chac6nMA，BarriaMI，SotoC，etal.，Beta-sheetbreakerpeptidepreventsbeta—inducedspatialmemoryimpairmentswithpartialreductionofamyloiddeposits.Mol,Psychiatry.2004，9(10):953-61)通it^t注射纤维化AP使大I^生行为障碍，然后检验由5个^^iU且成的p片层阻断肽(five-amino-acidbeta—sheetbreakerp印tide，iAbeta5p)对神经元的保护作用，结果显示iAbeta5p不仅能l!ajLAP纤维的形成，而JJ^AP纤维具有分解能力，目前该药处于111期临床*阶段。W域目前需要能够与P淀粉^白单体(A&i-42)特异结合，稳定其正常空间结构，抑制其形成p片层，P^ajh可溶性p淀粉^^白寡聚体和e淀粉,白斑块形成的新的活性药剂。所述药剂应能够抑制Ap肽的聚集，加速AP肽的降解与清除，从而可用于AD的预防和/或治疗。
发明内容本发明的一个目的是_41_#^种能与P淀粉#^白单体(APH2)特异结合、稳定其正常空间结构、抑制其形成P片层、fiUL可溶性e淀粉;^白寡聚体和P淀粉^^白斑块形成、财AP纤维具有分,用的多肽，所述多肽可以,皮称为P片层阻断肽。本发明的发明人意夕卜就现，包胁下絲齡列的多肽能够实现上述目的His-Xl-X2-Leu-X3-Phe-Phe-X4-Glu-Asp其中XI可以为赖氨^i^(Lys，K)或者M,残基(Gln，Q);X2可以为赖氨^基(Lys，K)或者M,残基(Gln，Q);X3可以为缬氨MJ^(Va1，V)或者脯氨^1>(Pro，P);X4可以为丙氨MJUAla，A)或者谷氨to^(Glu，G)。因此，在本发明的第一方面，提供了包括上述^J^^列的多肽。由于上述的多肽能与f>淀粉样蛋白单体(APH2)特异结合、稳定其正常空间结构、抑制其形成P片层、阻止可溶性P淀粉#^"白寡聚体和P淀粉#^"白斑块形成、且对AP纤维具有分解作用，因此可以用于阿尔茨海默病的预防和/或治疗。因此，在本发明的第二方面，提供了本发明的多#制备用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物中包括一种或多种本发明的多#可药用的载体。在本发明的第四方面，提供了一种预防和/或治疗受试者的阿尔茨海默病的方法，所述方法包括给予所述受^r有效量的本发明的多肽。图1显示了制备本发明多肽的一种示例性方法的步#所制备产品的检测结果。图1A显示了用于合成和纯化本发明多肽H101的一种示例性方法的主要步骤；图1B显示了H101的色谱分析结果；图1C显示了H101的质谱检测结果。图2显示了APp42肽聚集和纤维形成的减磺l:T荧光分析结果，表明本发明多肽对AP聚集的荧光强度的影响。将给定浓度的AP肽与本发明的多肽HIOI、H102或H103或维生素E(VE)或L5在37"C赙育24小时，然后测量ThT荧光强度。n=5,承表示与APi—42纟ibf目比尸〈0.05。图3显示了H102和维生素E抑制AP纤维形成的剂量依赖性曲线，将浓度为10pmol/L、20nmol/L、44.30jamol/L、100pmol/L的H102和维生素E与11.07nmol/L的APp"在37"C共孵育24小时，然后测量ThT荧光强度。n=5。图4显示了H102和维生素E抑制APH2纤维形成的时间依赖性曲线，将浓度为44.30,1/L的H102和维生素E与11.07jimol/L的APi—42在37°C共孵育，分别在12小时，1天、3天、5天和7天时测量ThT荧光强度。n=5。图5显示了用浓度为44.30jimol/L的各种多肽与11.07pmol/L的Ap丄—42在37。C^赙育5天后，AP1-42多肽纤维形成的电镇观察结果。其中图5A为将API—"单独孵育5天的电镜结果，放大倍数35000倍；图5B为将AP!-42单独孵育5天的电镜结果，放大倍数50000倍；图5C为将多肽L5与A&i-42^"^育5天的电镜结杲，放大倍数35000倍；图5D为将多肽H101与APh2i赙育5天的电镜结果，放大倍数35000倍；图5E为将多肽H102与APh2—^孵育5天的电镜结果，放大倍数35000倍；图5F为将多肽H103与APi-42"-^孵育5天的电镜结果，放大倍数35000倍；图6显示了不同浓度(10ymol/L、20jumol/L和40ymol/L)的各种多JI^于与5ymol/L的AP1—42—起培养72小时的yUt经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的存活率的影响。n=12,*表示与APi-42^^目比,〈0.05。图7显示了用APPN末端^^和AP抗/^t各组小鼠的海马CA1区神经元切片进行免^^且化染色的结果，放大倍数为400倍。图7A:对照组的APPN末端抗体免疫组化染色结果；图7B:对照组的AP抗体免^l且化染色结果；图7C:模型组的APPN末端^/^免^i且化染色结果；图7D:模型组的A0抗体免^l且化染色结果；图7E:多肽注射组的APPN末端抗体免疫组化染色结果；图7F:多肽注射组的Ap抗体免疫组化染色结果。图8显示了用刚果tof各組动物的;^f颞叶;^和海马进行染色的结果，放大倍数为400倍。图8A:对照组的大脑颞叶皮层的刚果红染色结果；图8B:对照组的海马的刚果红染色结果；图8C:^t型組的大脑颞叶^0&的刚果红染色结果；图8D:模型组的海马的刚果红染色结果；图犯多肽注射组的:U^颞叶皮层的刚果红染色结果；图8F:多肽注射组的海马的刚果红染色结果。^M^实施方式在本文中公开了一系列多肽的#^#列，本领域技#员能够理解的是，在以单字母或三字母的M^J^示某一序列时，该序列从左至右表示的是该多肽从N端(氨基端)至C端(羧基端)的序列。例如当使用"His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp"或"HQKLVFFAED"表示某一多肽的序列时，意为该多肽的序列为"N端-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-C端，，，即"N端-HQKLVFFAED"C端"。在本发明的第一方面，提供了包括下述M酸序列的多肽His-Xl-X2-Leu-X3-Phe-Phe-X4-Glu-Asp其中Xl可以为赖氨^^(Lys，K)或者錄ilW絲(Gln，Q);X2可以为赖氨^J^(Lys，K)或者谷氨,残基(Gln，Q);X3可以为缬氨^J^(Val，V)或者脯氨MJ^(Pro，P);X4可以为丙氨舰基(Ala，A)或者錄舰基(Glu，G)。本发明的多肽可以包括上述M酸序列、基^^上由上述M酰亭列组成或者由上述^J^4列组成。在本发明的一个实施方案中，提供了一种具有如下序列的多肽，所述多肽在本发明中被命名为H101:H101:His-Lys-Gln-Leu-Va卜Phe-Phe-Glu-Glu-Asp(服QLVFFEED)(SEQIDNO:1)。在本发明的另一个实施方案中，提供了一种具有如下序列的多肽，所述多#本发明中被命名为H102:H102:His-Lys-Gln-Leu-Pro-Phe-Phe~Glu-Glu-Asp(HKQLPFFEED)(SEQIDNO:2)。在本发明的另一个实施方案中，提供了一种具有如下序列的多肽，所述多#本发明中,皮命名为H103:H103:His-Gln—Lys-Leu-Val-Phe-Phe—Ala~Glu-Asp(HQKLVFFAED)(SEQIDNO:3)。在本文中公开了多种多肽的tj^酸序列。显而易见的是，可以对本发明的多肽进行各种修饰。所迷的修饰包括但不限于脯氨酸和赖氨酸的鞋基化，丝氨^或苏氨^^的羟基基团的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的o-JL^基团的甲基化,N端M的乙酰化以;s^某些情况下C端g的ife^f匕。应该理解的是，在l^本发明多肽的皿絲列i^,上述各种#^形^于本领域技^A员;L^而易见的，并且含有这些#^的包括所公开#^断列的多肽#本发明的范围之内。上述的本发明多肽能够作为P片层阻断肽，它们能够与P淀粉样蛋白单体(A3i-42)特异结合、稳定其正常空间结构、抑制其形成P片层、阻止可溶性P淀粉絲白寡聚体和&淀粉白斑块形成、JJ寸AP纤维具有分幹ft用，因此可以用作预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物。所以，在本发明的另一方面，提供了本发明的多^制名"预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。本文中所使用的"预防"指的是减少受试者患上疾病的风险或者延迟患者患病或症状出现的时间。本文中所使用的"治疗"并不是指完全治愈。它是指减轻了潜在疾病的症状和/或减少了导致症状的一种或多种潜在的细胞、生理或生物化学病因或枳逸。应理解本文所使用的被减轻是相对于疾病状况而言的，包括疾病的分子状况，而不仅仅是疾病的生理状况。本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物中包括一种或多种本发明的多肽和可药用的载体。"可药用的载体"是指在生物学上或其他方面不会具有不良作用的物质，即可以将所述物质与本发明的多肽一同给予受试者，同时不会引起^r不良的生物学影响或以有害的方式与含有它的药物组合物的任何其他组分相互作用。显然应当选择可使活性成分的^^r降解降到最低并且使受试者体内的任何不良副作用减到最小的载体，这是本领域技术人员所熟知的。本发明的药物组合物通常包括至少一种本发明的多肽和一种或多种可药用的载体。合适的载体包括但不限于抗氧化剂、防腐剂、着色剂、调味剂和稀释剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、填充剂、增量剂、緩冲剂、载体、冲淡剂、赋形剂和/或药用佐剂。例如，合适的载体可为生理盐水溶液、柠檬酸盐緩冲液或人工CSF,以及可能添加常用于肠胃外给药組合物的其他物质。中性緩冲盐溶液或与血清清蛋白混合的盐溶液也是示例性的载体。本领域技术人员可以容易地确定可用于本发明组合物和剂型的多种緩冲剂。典型的緩沖剂包括但不限于可药用的弱酸、弱碱或它们的混合。优选地，緩冲组分为水溶性物质，例如磷酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸、乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、谷氨酸，以及它们的盐。载体中的基本溶剂在性质上可以为水性的或非水性的。另外载体可以含有用于改善或维持制剂pH、渗透性、粘度、澄清度、颜色、无菌度、稳定性、溶出狄或气味的其他可药用赋形剂。本发明的药物组合物还可以含有其他可药用的用于改善或维持本发明多肽的释沈逸率的载体。这类载体为配制緩释制剂的技术人员已知的物质。当本发明的药物组合物被配制成以后，可在无菌管中以溶液、悬液、■、乳剂、固体或者脱水或冻干粉末的形式储存。这些制剂也可以以即用形式、以用前需要重配的冻干粉形式或以用前需要稀释的液体形式储存。优选地，本发明的药物组合物以单次使用的无菌管装形式提供，并在用前一直在2-8x:储存。在即将给药前，可将本发明的药物组合物用合适的无菌的例如M上述的柠檬酸盐緩沖液恰当地稀释。本发明还提供了一种预防和/或治疗受试者的阿尔茨海默病的方法，所述方法包旨予所述受M有效量的本发明的多肽。术语"有效量"意为所使用的化合物的量足以防止疾病的发病或症状的出现，或者改善疾病或病症的一种或多种病因或症状。所迷改善只需减轻或改变而并不必须消除。对于本发明多肽而言，其预防和/或治疗有效量应才^所针对的个体以及所用的多肽而变化。所用的多肽的预防和/或治疗有效量也应根据个体的年龄、身材、体重、状况等而变化。针对务沐受^，确定本发明多肽的预防和/或治疗有效量是在^4页域技^A员的能力范围之内的。将本发明的多M本发明的预防和/或治疗方法应用于阿尔茨海默病受试者时，具有显著抑制受试者脑组织内AP聚集，减少淀^#斑块的数量和面积，改善阿尔茨海默病症状的效杲。例如可以提高活动力和注意力并减少反应时间，可以改善发音、面部表情、体态、嗅觉、性欲、性功能和情绪状况并使精神状态愉快。在本发明的另一个实施方案中，可以适当地对例如阿尔茨海默病患者给予本发明的多肽作为认知增进剂，从而提高特别是被痴呆损害的学习能力或者抑制认知衰退和/或痴呆。^^发明的多肽的制备本发明的多肽可以通过本领域技^A员已知的任何制备多肽的方法来制备。可以使用化学合成法合成本发明的多肽。多肽的合成可以在溶液中进行，也可以使用固相合成法。多肽的固相合成方法包括Fmoc固相合成法和tBoc固相合成法。人工合成多肽的方法一^从C端(M端)向N端CtJ^)合成。在本发明的一个实施方案中，采用Fmoc固相合成^^成本发明的多肽，并通过HPLC进行纯化。图1以示例性的方式显示了在这个实施方案中合成和纯化本发明的一种多肽HIOI的主要步#所制备多肽的;^测结果。在这个实施方案中，使用多肽固态合成^^合成柱上合成多肽，从而大大减轻了产品提纯的难度。为了防止副M的iLi，^^成柱和添加^J^酸的侧^I^皮保护的。g端是游离的，并JU^gjL之前必须活化。本发明的多It^采用Fmoc法合成和采用制备高效斜目(HPLC)柱纯4^，可以^J^)质谱(MS)分析来鉴定。应当理解的是，所有本发明的多肽均可用与上述实施方案类似的合成方法来制备、纯化和鉴定。也可以通过重多ilj^因工程的方法生产本发明的多肽。简而言之，可以合成编码本发明多肽的多核苷酸，然后将其用本领域已知的方法转化至合适的宿主细胞中并使其^^达，对表达产物进行纯化或处理即可得到本发明的多肽。实施例下面结合实施例对本发明作进一步说明。以下实施例是为了使本领域M技权员能够更好舰解本发明，这仅仅出于示例性目的，并非意在限制本发明的范围。已经努力确M关数字(如数量、温度等)的准确性，但应该考虑到^^存在一些误差和偏差。除非另有说明，份数为重量份数，温度以"C为W或者为环境温度，压力接近或等于大气压。实施例l:本发明的多肽的制备在本实施例中，首先^^1Fmoc/tBu固相多肽合成法合成了本发明的一种多肽HIOI，所述多肽的序列为His-Lys-Gln-Leu-Val-Phe-Phe-Glu-Glu-Asp(SEQIDN0:1)。本实施例的多肽合成方法中所用原料为Fmoc-Asp(OtBu)-WangResin(0.37咖ol/g)、Fmoc-Va卜0H、Fmoc~Glu(0tBu)-0H、Fmoc-His(trt)-0H、Fmoc-Gln(trt)-OH、Fmoc-Leu-0H、Fmoc-Lys(Boc)-0H和Fmoc-Phe-OH。本实施例中应用的多肽合^纯化方法的主要步骤如图1A所示。图1A所示的实验方案中所用的TFA试剂的配方为[TFA:H20:乙_=^|:錄，以僻^p、比为92.5:2.5:2.5:2.5混/H。，'j备得到的肽粗产品通过HPLC纯化，佳J^获得的肽的纯度大于95%，HPLC的结果示于图1B。将通itii^法制备和纯化的多肽H101^^]质谱(MS)分析鉴定并测序，质^^析的结果示于图1C。鉴定和测序的结果显示，用上述方法制备的多肽序列和分子量与预期相符。用与本实施例中类似的方法，it^还制备了以下;ut本发明的多肽HI02:His_Lys-Gln-Leu-Pro-Phe-Phe-Glu-Glu-Asp(SEQIDNO:2);H103:His-Gin-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp(SEQIDNO:3)。对以上;ut合成多肽的测序和鉴定结a明，本实施例所述的合成和纯化方法适用于本发明的各种多肽。用所述方法制备的各种多肽的序列和分子量均与预辦目符。并且用上述it化方法可以得到纯度大于95°/4的多肽产物。实施例2:本发明多JIWP淀粉皿白的影响材料与方法1.药品与试剂A0i—42(纯度>98°/。)、维生素E、硫磺素T(ThioflavinT，ThT)、噢哇蓝(MTT)，二甲肚砜(DMSO),均购自美国Sig咖7〉司；MEM培养基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(trypsin)均购自美国Gibco-BRL公司；本发明的珊多肽HIOI、H102和H103采用实施例1所迷的方法制备；同时还用与实施例l所述方法类似的方法^^成了一种五肽Leu-Pro-Phe-Phe-Asp，该五肽与Soto-Jara等人发明的P片层阻断肽iAbeta5的序列相同，并J^本发明中被命名为L5，在本实施例和其后的实施例中#^用L5肽作为对照。以上几种多肽均由上海吉尔生物>{^司合成，并通过高效液相色镨法(HighperformanceLiquidChromatography,HPLC)纯化，赠妝(MS)分析鉴定敝均〉95%。2.确磺素T(ThioflavinT，ThT)荧光分析和电子显微^^见察ThT荧光强度可以反映ap的聚集程度，所以用ThT荧^^分冲/m蛋白的聚集程度。据mii，维生素E(VE)可以有效抑制AP聚集和纤维形成，因此本实验采用维生素E作为阳i树照。将A&I—"冻干粉用50咖ol/LPBS(pH7.4)配制成22.15|imol/L溶液，将上述四种多肽(HIOI、H102、H103和L5)用同样的PBS分别配制成浓^788.61umol/L的溶液，维生素E用含0.2%Tween80的PBS配制成88.61jamol/L的乳化液。实验时将Apw2溶液与树多峻液等^、^^，使它们的终浓度分别为11.07pmol/L和44.30|amol/L。将Api-"和维生素E乳化液等^V:^作为阳']i^照，将只含有而不含有^r上述多M维生素E的溶液作为阴性对照。将上述各组溶液在37X:共同赙育24h后，每组取10ji1加入990n1的3.0pmol/LThT磷離緩冲液中，在狄波长453nm，发射波长478~486nm处测定ThT荧光强度。3.本发明多肽与APi-42的量效和时效关系选取多肽H102,用上述PBS配制成系列浓度，与11.07umol/LA0i-42溶';^37。C共同孵育24小时后,进行ThT荧^r测，以确定本发明多肽与APi-42的量效关系。将浓^44.30,1/L的證和维生素E与11.07jumol/L的APH2在37匸共孵育，分别在粹育开始后12小时(12h)、1天(ld)、3天(3d)、5天(5d)和7天(7d),进^f亍ThT荧i^r测，以确定XPLS^种多肽与APi-42的时效关系，同时，单独孵育A0l-42肽作为阴'^t照。4.电#^膝为了进一步*纤维的形成，用浓^44.30jumol/L的各种多肽与11.07y边ol/L的AP1-42在37。C^孵育5天后，取每组样本各5ji1,滴于含碳支持膜的300目去离子铜网上，室温静置15min。2y。醋酸xsl^4W光负染2min，干燥后用透射电m察。同时将APi-42肽单独孵育5天作为阴'l!^t照。5.细^^胜实验选择4^域常用的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系作为细胞条t生实验的对象，该细胞系购于首都医科大学宣武医院，在MEM培养基内按常财法培养，其中添加10。"v/v)的胎牛血清，于371c、5%0)2培养箱中培养，每5天传代一次。将细胞生长状态稳定并处于对l^t长期的SH-SY5Y细胞以密度为1.0x107ml接种于96孑Ul(Costar产品)，每孔培养液体积200n1，24小时后更换为iLA清培养基，并加入5jimol/LApi-42溶液，^^且。将前述四种多肽分别以10p迈ol/L、20jiniol/L和40pmol/L浓妙入各组细胞的培养液中。将只加^t血清培养基紗入APh2和多肽的细J!^i且作为阳性对照，将培养基中只加入APi—"而^MpAJi述多肽的细J5Si且作为阴'树照。在加入多^72小时，向每孔中加入3-(4,5-二曱基-2-#^)-2，5-二苯絲化四唑(MTT)(5mg/ml)20p1，37t:孵育4小时，弃去原培养液，每孑L^入DMS0200nl，静置10min，震摇lmin,使曱臜颗粒完全溶解，用全自动酶标仪测定492nm处的光密度值(0pticaldensity,0D)。6.统计学处理对于两组之间的数据比较，采用t检验方法；对于两组以上的lt据比较，采用尸检验方法。结果1.所测试的各种多肽对AP1-42聚集和纤维形成的抑制作用用ThT焚光法分析所测试的各种多肽和VE对APi—42聚集和纤维形成的影响，AP1-42在PBS溶液中能形成非常高的荧光强度，表明AP1-42能自我聚集和形成AP纤维。将只含有APp42而不>|^[可测试多赋维生素E的阴'f树照的荧光强度计为100%。计算所测试的各种多肽对A&H2聚集和纤维形成的抑制率(％)。结果示于下表l(注表l中4^t据均已扣除仪器系统本身产生的本底焚光)。表l:各种多^tAP聚集的抑制作用(0/。)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>由Ji^l的结果可以看出，H1O2对A01—42聚集的抑制率最高，向下递减依次为L5、维生素E、H101和H103。将Ji^的实M^i会制成直方图，示于图2。如图2所示，H102能明显抑制Ap聚集和纤维形成；维生素E与AP共同孵育，也有明显抑制A^-42聚集和纤维形成的作用，^效果比H102弱。2.本发明多肽与APi-42的量效关系图3示出了不同浓度的多肽H102和维生素E与11.07limol/LA01-42溶液在37匸共同孵育24小时后，进行ThT荧i^测的结果。由图3可以看出，H102和维生素E对AP纤维形成的抑制具有浓度效应，H102在#^浓度泉的抑制率均大于维生素E。H102和维生素E的最高抑制M均在20Mmol/L附近。3.本发明多肽与APi-"的时效关系图4示出了本发明多肽H102和维生素E与11.07pmol/LA^—42溶液在37t:共同孵育不同时间后，进行ThT荧光检测的结果。由图4可以看出，11.07pmol/LApi-42单独赙育前24h的荧光强度较低，第3天急剧增强，随后形成一平台式增长，H102组和VE组的各时间点的荧光强度均明显减弱，并且以H102处SI旦的^最为显著。以曲线的半高峰出现的时间Tm代表曲线的变化特征，AP组的Tm在第3天。与AP^a4目比，H102和维生素E组将1/2延迟至第4天。4.电^^L^结果图5显示了用浓JL^牧30jLimol/L的各种多肽与11.07M血ol/L的Ap在37X^"^孵育5天后，A^-42多肽纤维形成的电镇观察结果。从各图中可以看出，APi-42单独孵育5d，出现大量AP纤维，直径约8~10nm，长约0.5~5p迈，呈芒刺式晶状聚集，有分枝，甚至交织成网状，其间夹杂着少量呈聚集状态的无定形结构(图5A和5B，对照组)；L5与A0孵育5d,形成的AP纤维明显较细，并聚絲直径约48nm,长O.3~5pm,交织成网状，其间夹杂着极少量呈聚集状态的无定形结构(图5C);H101与AP共同孵育5d，有A0纤维形成，直径较细，约5-8nm，长O.5~5jLxm，有分枝交织成网状，其间可见极少量呈聚集状态的无定形结构(图5D);H102与AP共同孵育5d,AP纤维形成明显减少且直径变细，约36nm，长O.3~3jum，交织成网状，其间夹杂着极少量呈聚集状态的无定形结构(图5E);H103与AP共同孵育5d，A^纤维形成，并聚iy^直径约58nm，长0.55jim,呈芒刺式晶状聚集，交织成网状，其间夹杂着少量呈聚集状态的无定形结构(图5F)。5.本发明多肽对SH-SY5Y细胞存活率的影响图6显示了不同浓度(10p迈ol/L、20nmol/L和40uniol/L)的各种多^t于与5mmol/L的A&1-42—起培养72小时的yUt经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的存活率的影响。n-12，承表示与APH2组相比户〈0.05。由图6中可以看出，APi—42作用于SH-SY5Y细胞72h后，细J^活率下降，而用不同浓度的4种多肽(10jLimol/L、20p迈ol/L、40jimol/L)分别与APi—42共同孵育细胞，细胞存活率有所改善，并呈现一定的剂量依赖关系。以上结果表明，H102对细胞存活率的提高最有效，并且以20nmol/L为最适浓度。实施例3:Hl02对APP转基因小鼠脑内淀粉#^白(A&)和淀粉##白前体蛋白(APP)表达的影响材料与方法实M物9月龄APP695转基因小鼠30只，同遗传背景同月龄C57BL/6J小鼠10只，料不限，均购自中国医学科学院中国协和医科大学^^物研究中心。药品与试剂Api—42跳购自美国Chemicon公司；APP抗体、即用型SABC免疫组化染色试剂盒、DBA显色试剂盒、刚果红购自武汉博士^/〉司；^L试剂均为国产分析纯。H102多絲用如实施例l所述的方法制备、纯化和鉴定，在实验时用生理盐水稀释配制成40jimol/L溶液。动物分组和;^型制备30只APP695转基因小鼠随机分为模型组15只，多肽注射组15只；C57BL/6J10只设为正常对照组。多肽注射组每次向动物侧脑室注射40nmol/L的H102生理盐水溶液3pl，对照组和模型组每次向动物侧脑室注射等体积生理盐水，每日注射一次，连续注射10天。所有动物均以相同M饲养于天津医科大学实验动物中心SPF级清洁鼠房。将动物用10%水合氯醛按400mg/Kg体重的剂量进4亍^^后，固定于脑立体定向M,剪去头部4JL用氨尔碘消毒后，沿正中线切开^pi^长约lcm，剥离骨膜，显露骨性标志。调整小鼠头部平面，4吏Bregma和Lambda处于同一高度。参照George，s小鼠脑立体定位图谱，在颅骨上于侧脑室(P。..58，&，H—L》位置打一直径为l咖小孔为进针点。手术后第二天，开始注射。借助小动物脑立体定位^it过微量注射器緩慢、匀it^向侧脑室注入3pl多g液或生理盐水，注射结A^留置针lmin,緩慢退针。局部压iiih血，连续注射10天。小鼠海马石i^t刀片的制备对各组动物连续进行侧脑室注射10A^，采用0.1kg/L水合氯趁按4mL/kg体重的剂量进行皿注射麻醉，经左心室iSi4插管，同时剪开右心房，快速灌注生理盐水；待肝脏变白后，改灌注40g/L多聚甲醛，ii^'^慢，至小鼠四肢僵硬为满意；取小鼠脑，快it^tA含30%蔗糖的多聚甲醛溶液中固定2~4天。待脑组织下沉后，即可4tit块包埋。行小鼠脑矢状面切片，待海马CA1区出g,进行连续切片，每隔10^L1张，每只小鼠每种^W3张，厚度5ym。免疫组织化学染色按照免疫组化试剂盒说明书的步骤，分别进4亍AP、APP的免疫組化染色，第一^#释;^别为1:100和1:200，第二求M释度均为1:100。在400倍方文大倍数下，JiS并拍照。小鼠脑组织切片的刚果红染色上述石蜡包埋切片至水，^10%甲醛液15min后，直接^^刚果红染色液15min,水洗4min，浸入苏木^素液2min,水^将切片浸入0.5%盐酸乙醇分化，充分水洗泛蓝后用乙醇脱水，用二甲^it明化，用中性树胶封固。在400倍》文大倍数下，條并拍照。结果1.APPN末端抗体免J^且化染色和A&抗体免疫组化染色。图7显示了用APPN末端l^和A0抗体对各组动物的海马CA1区神经元切片进行免^^且化染色的结果。从图7中可以看出(l)对照组中APPN末端抗体和Ap^^免^i且化染色的结果(分别为图7A和图7B)显示对照组海马CA1区神经元胞浆着色呈阴性或弱阳性；(2)模型组中APPN末端抗体和AP抗体免疫组化染色的结果(分别为图7C和图7D)显示模型组与对照la^目比阳性细胞增多，表达增强，胞浆着色明胁深；(3)多肽注射组中APPN末端抗体和AP抗/^免疫组化染色的结果(分别为图7E和图7F)显示:多肽注射组APP同模型^4目比阳性细胞减少，胞M色变淡，表达减弱。2.刚果红染色。用刚果红对小鼠脑组织病理切片进行染色后，对小鼠;U^颞叶皮层和海马淀粉样斑^4达情;X^行，J^，染色结果示于图8。从图8中可以看出(1)对照组小鼠的:^颞叶皮层(图8A)和海马(图8B)中未见阳性淀粉样斑块；(2)模型组小鼠的雄颞叶皮层(图8C)和海马(图8D)出现大小不一，淡红色着色团块状淀粉#^白斑块物质，多为圆形或类圆形，ltfe分布，分布密度不均，周围可见多少不等的神经元细胞；(3)多肽注射組小鼠的她颞叶J^(图8E)和海马(图8F)也出现一些团块状淀粉^W白斑块物质，但是多肽注射组中的淀粉样斑块数》b^型組明显减少。结论免疫组化染色结果显示^M^型组小鼠雄CA1区，AP1-42阳性的细胞明显高于正常对照組。而H102多肽注射组阳性的细胞较模型组明显减少。由此推测在体内可以抑制AP的聚集，降低Ap的务性。jtW卜，刚果红染色发现，转基因组小鼠脑内明显出现淀粉样斑块，正常对照组小鼠脑中未见斑块，H102多肽注射组小鼠脑内的淀粉样斑块的数目和面积较转基因组有明显的减少。这^iit了H102可以抑制AP的聚集，减少其生成的结论。在本申请中，引用了多种出版物。所M的出版物通过引用的方式全文纳A^^说明书中，以使，详尽的叙ii^发明所^t术领域的情况。对于本领域技术人员显而易见的是，只要不背离本发明的范围和桥冲，可对本发明进行各种修改和变动。通过考虑本发明在此所公开的说明书和实例，本发明的M实施方案对;W域技^^员来^A显而易见的。本说明书和实施例应仅看作示例性用途，本发明真正的范围和精神在所附的权利要求书中说明。序列表<110>天津医科大学王威<120>用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的P片层阻断肽<130>CP1080054/CB<160>4<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>1HisLysGinLeuValPhePheGluGluAsp1510<210>2<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>2HisLysGinLeuProPhePheGluGluAsp1510<210>3<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>3HisGinLysLeuValPhePheAlaGluAsp1510<210>4<211>42<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>4AspAlaGluPheArgHisAspSerGlyTyrGluValHisHisGinLys151015LeuValPhePheAlaGluAspValGlySerAsnLysGlyAlalielie202530GlyLeuMetValGlyGlyValVallieAla3540权利要求1.一种包括如下氨基酸序列的多肽His-X1-X2-Leu-X3-Phe-Phe-X4-Glu-Asp其中X1可以为赖氨酸残基(Lys，K)或者谷氨酰胺残基(Gln，Q)；X2可以为赖氨酸残基(Lys，K)或者谷氨酰胺残基(Gln，Q)；X3可以为缬氨酸残基(Val，V)或者脯氨酸残基(Pro，P)；X4可以为丙氨酸残基(Ala，A)或者谷氨酸残基(Glu，G)。2.根据权利要求l的多肽，所述多肽具有如下M酸序列-.His-Xl-X2-Leu-X3-Phe-Phe-X4-Glu-Asp其中Xl可以为赖氨^^(Lys，K)或者;^tM^g(Gln，Q);X2可以为赖氨Wi^(Lys，K)或者谷氨,^J^(Gln，Q);X3可以为缬氨^基(Val，V)或者脯氨酸残基(Pro，P);X4可以为丙氨^J^(Ala，A)或者谷氨酸戎基(Glu,G)。3.根据权利要求2的多肽，所述多肽具有选自下述的M酸序列His-Lys-Gln-Leu-Val-Phe-Phe-Glu"Glu-Asp(SEQIDNO:1);His-Lys-Gln-Leu-Pro-Phe-Phe-GlU"Glu-Asp(SEQIDNO:2);His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp(SEQIDNO:3)。4.根据权利要求1-34P项的多IL^制备用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。5.—种药物组^吻，所述药物组合物中包括一种或多种,权利要求1-3任一项的多#可药用的载体。6.—种预防和/或治疗受试者的阿尔茨海默病的方法，所述方法包:^给予所述受^T有效量的才N^权利要求1-34—项的多肽。全文摘要本发明涉及一类可用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的β片层阻断肽，以及所述多肽用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的用途。文档编号A61P25/28GK101531703SQ200810006598公开日2009年9月16日申请日期2008年3月13日优先权日2008年3月13日发明者周根发,徐淑梅,威王申请人:天津医科大学;王威