阿尔茨海默病的诊断和治疗的制作方法

本发明属于神经科学领域。具体地，本发明涉及一种阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的诊断和治疗靶点，以及相应的诊断、治疗方法和相关试剂盒。

背景技术：

AD是临床上最常见的神经系统退行性疾病，其以进行性进展的记忆、视空间及执行功能障碍为典型临床表现^[1]。近年来，随着老龄化程度的加快，我国AD患者数量大幅增加，由此给患者、家庭及社会带来了十分沉重的负担^[2]。截至目前为止，该病病因尚不明确，且无有效的治疗手段。

根据已有研究，AD的主要病理特征之一是脑内累积大量β淀粉样蛋白(Amyloid-β，Aβ)，进而诱发一系列神经毒性反应，最终导致认知功能障碍^[3]。因此，Aβ是现阶段相当一部分AD治疗的主要研究靶点。大量证据表明，脑组织对Aβ的清除能力下降，是导致病程早期Aβ累积的主要原因^[4]。新进证据提示，在起病早期清除AD模型小鼠脑内的Aβ后，小鼠的认知功能有所恢复，提示针对Aβ疗法的早期应用可延缓AD病程的进展^[5]。

然而，AD早期诊断手段的缺乏是应用此类疗法的最大阻碍。目前，在AD患者中开展脑组织活检较为困难，而通过病史及量表评估法诊断AD，其敏感性及特异性又十分有限。因此，探明一种较易操作的，特异性及敏感性较高的AD诊断方法亦成为当务之急。

发明概述

本发明的目的在于提供一种早期诊断及治疗AD的方法。

具体地，本发明首次发现TREM1蛋白是AD发病机制中重要一环，其在单核-巨噬细胞系统中的表达水平下调直接影响该系统对Aβ的清除能力，从而导致Aβ在脑内累积。在一个实施方案中，本发明提供了一种早期诊断AD的方法，其关键点为检测TREM1在外周单核中的表达水平。在一个具体的实施方案中，通过qRT-PCR检测TREM1基因转录水平以评估TREM1表达水平。在另一个具体的实施方案中，通过ELISA、免疫印迹或免疫组化方法直接检测TREM1蛋白表达水平。

此外，在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗AD的方法，其关键点为上调TREM1水平或激活TREM1通路以恢复脑内单核-巨噬细胞系统(即小胶质细胞)对Aβ的吞噬能力。在一个具体的实施方案中，通过向脑内小胶质细胞转入外源性TREM1基因以提高其表达水平。其载体可以是质粒、慢病毒或其他可行的核酸形式。在另一个具体的实施方案中，向机体内引入能够提高TREM1基因表达水平的转录调控物质。在另一个具体的实施方案中，向脑内引入特定物质以靶向激活TREM1通路，所述特定物质可以 是激动性抗体及其活性片段、激动性配体或通路下游分子的激动剂。

附图说明

图1.Trem1可以促进WT幼鼠的小胶质细胞对Aβ的吞噬作用。为弄清生理条件下TREM1在小胶质细胞吞噬Aβ中的作用，我们利用慢病毒机制操纵从WT幼鼠中分离出的原代小胶质细胞中Trem1的表达。在转导72h后，分别利用qRT-PCR和ELISA技术证实了Trem1 mRNA的表达水平(a)和Trem1蛋白水平(b)的改变。之后，应用Griciuc等人提供的离体试验方法检测小胶质细胞对Aβ_1-42的吞噬和降解作用。(c)将小鼠原代小胶质细胞置于5μM Aβ_1-42培育6h。利用ELISA技术对内化的Aβ_1-42数量进行检测(t＝0h)。(d)继而，将培养基中剩余的Aβ_1-42清洗出去，将原代小胶质细胞进一步培养6h以使得Aβ_1-42充分降解。利用ELISA技术对细胞内Aβ_1-42水平进行测定(t＝6h)。(e)将Aβ_1-42剩余量(t＝6h)与总的Aβ_1-42内化量(t＝0h)的比值视为Aβ_1-42降解指数。降解指数越高，代表降解Aβ_1-42的能力越低。利用单因素方差分析及Tukey′s post hoc检验对数据进行分析。柱状图代表平均数±标准差(n＝4，一式三份)，*P＜0.05。

图2.Trem1可以促进成年APP/PSEN1小鼠的小胶质细胞对Aβ的吞噬作用。为了进一步在AD相关的背景下证实TREM1对Aβ吞噬作用的调节作用，我们通过慢病毒机制操纵7月龄APP/PSEN1小鼠小胶质细胞中Trem1的表达。在转导72h后，分别利用qRT-PCR和ELISA技术证实了Trem1 mRNA的表达水平(a)和Trem1蛋白水平(b)的改变。之后，应用Griciuc等人提供的离体试验方法检测小胶质细胞对Aβ_1-42的吞噬和降解作用。(c)将小鼠原代小胶质细胞置于5μMAβ_1-42培育6h。利用ELISA技术对内化的Aβ_1-42数量进行检测(t＝0h)。(d)继而，将培养基中剩余的Aβ_1-42清洗出去，将原代小胶质细胞进一步培养6h以使得Aβ_1-42充分降解。利用ELISA技术对细胞内Aβ_1-42水平进行测定(t＝6h)。(e)将Aβ_1-42剩余量(t＝6h)与总的Aβ_1-42内化量(t＝0h)的比值视为Aβ_1-42降解指数。降解指数越高，代表降解Aβ_1-42的能力越低。利用单因素方差分析及Tukey′s post hoc检验对数据进行分析。柱状图代表平均数±标准差(n＝4，一式三份)，*P＜0.05。

图3.敲除Trem1可促进APP/PSEN1小鼠中Aβ神经病理发生。将含有Trem1shRNA的慢病毒或其对照组慢病毒注入7月龄APP/PSEN1小鼠及与其年龄相匹配的WT小鼠的双侧大脑皮层和海马中。(a)注射2个月后，通过qRT-PCR证实了APP/PSEN1小鼠大脑内小胶质细胞中Trem1mRNA的表达发生的改变。(b)注射2个月后，通过ELISA证实了APP/PSEN1小鼠大脑内小胶质细胞中Trem1蛋白的表达发生的改变。(c)代表接受载体，对照组病毒或含有Trem1shRNA的慢病毒注射的APP/PSEN1小鼠大脑皮层的淀粉样斑块照片。根据免疫化学法，使用抗Aβ抗体检测淀粉样斑块。在×200显微镜下观察这些斑块。比例尺＝200μm。(d)在注射2个月之后，利用ELISA法检测APP/PSEN1小鼠大脑皮层中可溶性及不可溶形式的Aβ_1-42。(e)在注射2个月之后，利用ELISA法检测APP/PSEN1小鼠海马组织中可溶性及不可溶形式的Aβ_1-42。通过单因素方差分析及Tukey′s post hoc检验对数据进行分析。柱状图代表平均数±标准差。每组n＝12，*P＜0.05。

图4.过表达Trem1可以减弱APP/PSEN1小鼠中Aβ病理水平。将含有Trem1 cDNA的慢病毒或其对照组 慢病毒注入7月龄APP/PSEN1小鼠及与其年龄相匹配的WT小鼠的双侧大脑皮层和海马中。(a)注射2个月后，通过qRT-PCR证实了APP/PSEN1小鼠大脑内小胶质细胞中Trem1mRNA的表达发生的改变。(b)注射2个月后，通过ELISA证实了APP/PSEN1小鼠大脑内小胶质细胞中Trem1蛋白的表达发生的改变。(c)代表接受载体，对照组病毒或含有Trem1 shRNA的慢病毒注射的APP/PSEN1小鼠大脑皮层的淀粉样斑块照片。根据免疫化学法，使用抗Aβ抗体检测淀粉样斑块。在×200显微镜下观察这些斑块。比例尺＝200μm。(d)在注射2个月之后，利用ELISA法检测APP/PSEN1小鼠大脑皮层中可溶性及不可溶形式的Aβ_1-42。(e)在注射2个月之后，利用ELISA法检测APP/PSEN1小鼠海马组织中可溶性及不可溶形式的Aβ_1-42。采用单因素方差分析及Tukey′s post hoc检验对数据进行分析。柱状图代表平均数±标准差。每组n＝12，*P＜0.05。

图5.表达Trem1可以挽救APP/PSEN1小鼠的AD相关的空间认知损害。将含有Trem1 cDNA的慢病毒或其对照组慢病毒注入7月龄APP/PSEN1小鼠及与其年龄相匹配的WT小鼠的双侧大脑皮层和海马中。慢病毒注射2个月后，利用Y-迷宫试验检测Trem1过表达对小鼠短期空间记忆的影响。在暴露期，将小鼠放置在“起始”臂末端，并允许其在5分钟内自由探索Y-迷宫的第一臂部分(定义为“起始”臂)和第二臂部分(定义为“其它”臂)。该阶段，我们将通往迷宫第三臂部分(定义为“新”臂)的入口临时阻断。我们计算了相对于“起始”臂，小鼠在“其它”臂区域内所花费的时间(a)。采用单样本t检验(与50％机会相比，用红色虚线表示)或单因素方差分析及Tukey′s post hoc检验(组间差异)对数据进行分析。之后，小鼠被从迷宫中转移到其居住的笼子里待上2min。在试验阶段，将小鼠再次放入迷宫的“起始”臂内。同时，“新”臂入口被打开，并允许小鼠在迷宫中自由探索1min。(b)对于试验期，我们计算了一个鉴别指数＝[新臂时间/(新臂时间+其它臂时间)]×100。采用单因素方差分析及Tukey′s post hoc检验对数据进行分析。柱状图代表平均数±标准差，*P＜0.05。在处死小鼠前的最后5天，通过Morris水迷宫试验对小鼠的空间认知功能进行测定。(c)代表5天测试中各组的游泳速度。采用单因素方差分析及Tukey′s post hoc检验对数据进行分析。(d)代表各组在水迷宫试验中的路径长度。采用二因素重复测量方差分析及Bonferroni多重比较检验对路径长度数据进行分析。#相对于对照组WT小鼠，P＜0.05；*相对于接受对照组病毒注射的APP/PSEN1小鼠，P＜0.05。(e)探索试验所得数据的呈现形式为：相对于在其它三个象限(A.O.)内花费的时间，小鼠在在靶象限(Q1)内所花费的时间比例。采用独立样本t检验对数据进行分析。*相对于在其它三个象限(A.O.)内花费的时间，P＜0.05。柱形图代表平均数±标准差。每组n＝24。

图6.激动性Trem1抗体激活Trem1信号途径可以减弱APP/PSEN1小鼠脑内Aβ病理及挽救其空间认知损害。为了进一步证实TREM1在AD进展期的保护性作用，我们使用微型渗透泵持续6周向7月龄APP/PSEN1小鼠大脑第三脑室背侧灌入一种激动性Trem1抗体以激活Trem1信号途径。之后，我们测定了Trem1信号途径的激活对Aβ病理的影响。(a)利用ELISA法检测APP/PSEN1小鼠大脑皮层中可溶性及不可溶形式的Aβ_1-42。采用单因素方差分析及Tukey′s post hoc检验对数据进行分析，P＜0.05.每组n＝12。(b)利用ELISA法检测APP/PSEN1小鼠海马组织中可溶性及不可溶形式的Aβ_1-42。采用单因素方差分析及Tukey′s post hoc 检验对数据进行分析，P＜0.05.每组n＝12。继而，利用Y-迷宫试验评估小鼠的短期空间记忆功能。(c)对于试验期，我们计算了一个鉴别指数＝[新臂时间/(新臂时间+其它臂时间)]×100。采用单样本t检验(与50％机会相比，用红色虚线表示)或单因素方差分析及Tukey′s post hoc检验(组间差异)对数据进行分析，每组n＝24。(d)对于试验期，我们计算了一个鉴别指数＝[新臂时间/(新臂时间+其它臂时间)]×100。采用单因素方差分析及Tukey′s post hoc检验对数据进行分析。柱状图代表平均数±标准差，*P＜0.05，每组n＝24。才处死小鼠前的最后5天，通过Morris水迷宫试验对小鼠的空间认知功能进行测定。(e)代表5天测试中各组的游泳速度。采用单因素方差分析及Tukey′s post hoc检验对数据进行分析，每组n＝24。(f)代表各组在水迷宫试验中的路径长度。采用二因素重复测量方差分析及Bonferroni多重比较检验对路径长度数据进行分析。#相对于对照组WT小鼠，P＜0.05；*相对于接受对照组病毒注射的APP/PSEN1小鼠，P＜0.05，每组n＝24。(g)探索试验所得数据的呈现形式为：相对于在其它三个象限(A.O.)内花费的时间，小鼠在在靶象限(Q1)内所花费的时间比例。采用独立样本t检验对数据进行分析。*相对于在其它三个象限(A.O.)内花费的时间，P＜0.05。柱形图代表平均数±标准差。每组n＝24。

具体实施方式

本发明中所指的TREM1，英文全称为triggering receptor expressed on myeloid cells-1，即1型髓样细胞触发受体，是表达于单核巨噬细胞表面的一种受体，其与受体酪氨酸蛋白激酶偶联，进而调控免疫反应。

本发明首先发现了小胶质细胞膜表面的TREM1对于小胶质细胞吞噬Aβ的关键性促进作用。下调的TREM1表达直接导致小胶质细胞吞噬能力下降，即使在某些Aβ的生成速度并未加快的生理情形下，仍然不能清除Aβ使得后者在中枢神经系统中大量累积，进而产生神经毒性作用，进展到一定程度即发生阿尔茨海默病(AD)。虽然阿尔茨海默病的病因非常复杂，难以用单一原因或诱因概而论之，但是如果检出单核细胞中TREM1表达量显著下调，这一情形可能与阿尔茨海默病有很强的关联。

同时，本发明也发现，对于Aβ累积的情形，上调TREM1的表达量或者激活其通路，能够显著增强小胶质细胞吞噬Aβ的能力，加快清除累积的Aβ，消除其对神经系统的毒性作用，并且可能改善已经出现的症状。因此，本发明新发现了TREM1是一个阿尔茨海默病的诊断和治疗的靶点。

本发明所指的检测TREM1的表达量，指的是根据本领域常用的检测技术，包括但不限于qRT-PCR，ELISA，免疫印迹，免疫组织化学等等方法，检测TREM1的mRNA和/或蛋白的表达水平，其特异性的引物/探针/抗体/结合物等可以是自行设计的，也可以是商品化的。

本发明所指的上调TREM1的表达量，指的是通过向单核巨噬细胞转入TREM1基因本身，或转入其上游强启动子，或相应的转录因子，或消除抑制其表达的因素，或其他能够达到类似效果的、已知的其他手段或方案，实际达到TREM1分子表达数量增加的效果。在一个具体的实施例中，通过向活体脑内注射TREM1-载体颗粒实现，所述的载体优选地是病毒载体，更优选地是慢病毒载体。

本发明所指的活化TREM1通路，指的是通过激动性配体、激动性抗体或模拟分子活化TREM1，并进而激活下游信号转导。本发明所指的活化TREM1通路，也包括本领域所公知的，直接活化TREM1的下游分子，例如DAP12等。

实施例1 本发明所采用的实验材料与方法

人类研究对象

本研究遵循赫尔辛基宣言并经南京医科大学伦理委员会审批通过。研究对象来源于南京市第一医院在职及退休员工中的健康青年人和老年人，所有参与对象均为汉族中国人，且彼此无任何血缘关系。每一名参与者均签署了书面同意书。

人体循环血中单核细胞的纯化和培养

依据Zondler及其同事所描述的方法^[6]，从人体静脉全血中分离得到单核细胞。大体过程为：使用 (Sigma-Aldrich公司)仪器，采用密度梯度离心及CD-14阳性磁珠分离技术(Miltenyi Biotec公司)实现细胞分离。在添加10％胎牛血清(FBS)和1％盘尼西林/链霉素(P/S)的RPMI 1640培养基中进行细胞的再悬浮。通过免疫细胞化学方法控制分离得到单核细胞的纯度。继而，将单核细胞以1×10⁶细胞/mL的密度转移至裸96孔板中，放置24小时以备功能分析。

动物

申请人从南京医科大学实验动物中心获取了雄性APP/PSEN1转基因小鼠及与其年龄相匹配的野生型(WT)小鼠。整个研究方案经南京医科大学动物关怀和管理委员会批准。本研究所进行的所有实验均遵守美国国立卫生研究院实验动物关怀和使用指导意见。

小鼠小胶质细胞的分离

依据申请人以前描述的方法^[7]，从产后1天的野生型幼鼠脑组织中分离出小胶质细胞。利用细胞免疫化学法对小胶质细胞的纯度进行确认。

申请人对Bliederhaeuser及其同事描述的方法^[8]进行了微调后，利用其从APP/PSEN1成年小鼠和野生型小鼠脑组织中分离出小胶质细胞。大体过程为：小鼠被深度麻醉后，经贲门灌入冰的Ringer溶液。用解剖刀将小鼠大脑切碎，在37℃温度和5％CO₂浓度的条件下，将脑组织置于含有木瓜蛋白酶的酶溶液中孵育60min。随后添加含20％FBS的Hanks平衡盐溶液(HBSS)对酶溶液进行酸碱中和，并在200g(转速)下离心4min。往离心出的颗粒状物中再次加入2ml含0.5mg/mlDNA酶的HBSS溶液实现再悬浮，并在室温下继续孵育5min。利用经火打磨过的巴氏吸管对脑组织进行轻度破坏，然后经70μm细胞筛过滤(Thermo Fisher Scientific公司)，并在200g(转速)下离心4min。然后将所得到的颗粒状物在20ml含20％(Sigma-Aldrich公司)的HBBS等渗溶液中实现再悬浮。小心地将纯的HBSS(20ml)置于percoll层的上方， 然后在200g(转速)下离心20min。丢弃含有髓磷脂和细胞碎片的交界层，将含有混合胶质细胞群的颗粒样物质用HBSS洗脱下来，并在含有10％FBS，1％P/S，1×丙酮酸盐，1×GlutaMAXTM(Thermo Fisher Scientific公司)以及5ng/mL不含载体的小鼠重组粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，R&D systems公司)的杜氏改良培养基中再悬浮。在37℃温度，5％CO₂浓度条件下，将细胞悬浮液转移至15cm²的多聚-1-赖氨酸涂层板上培养。每隔3天更换一次基质直至整个底面被一层细胞覆盖。在胶质细胞层形成后，小胶质细胞会形成一层(与底部)不粘连的悬浮细胞层。申请人可以较容易地对这些细胞进行收集、转移和进一步培养。收集完悬浮细胞层后，将小胶质细胞置于无GM-CSF的条件下孵育3天，然后进行转导操作或功能分析。采用免疫细胞化学方法对所收集小胶质细胞的纯度进行确认。

Aβ_1-42吞噬和降解试验

采用Griciuc等人提供的离体试验方法对单核细胞或小胶质细胞对Aβ_1-42的吞噬和降解能力进行测定^[9]。将人单核细胞或小鼠小胶质细胞与5μM的Aβ_1-42共同孵育6h，利用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定内化Aβ_1-42的数量，以评估细胞对Aβ_1-42的吞噬作用。先将人单核细胞或小鼠的小胶质细胞与5μM的Aβ_1-42共同孵育6h，继而用新鲜培养液将细胞洗脱下来并置于无Aβ_1-42的血清中继续培养6h，以测定细胞对Aβ_1-42的降解能力。之后，利用ELISA法测定细胞内Aβ_1-42的剩余水平。用Aβ_1-42的剩余量与内化总量的比值表示细胞对Aβ_1-42的降解能力。比值越高意味着细胞对Aβ_1-42的降解能力越低。

慢病毒颗粒的准备

为了使小胶质细胞选择性地过表达Trem1蛋白，申请人利用现有方法^[10]，构建出在髓系分化CD11b启动子调控下可以编码小鼠WT Trem1 cDNA(NM_021406.5)的慢病毒载体及对照组病毒。为了敲除Trem1，申请人利用现有方法^[11]，在慢病毒载体中合成并利用U6启动子克隆了以下短发夹序列(Trem1：5’-AATTCAAAAAAGACCAAGGGTTCT-3’和对照序列：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’)。将纯化后的慢病毒载体与套装载体共转染至293FT细胞内。48小时后收集上清液，然后利用超速离心法将上清液中慢病毒颗粒浓度浓缩至1∶100，用磷酸盐缓冲盐水进行悬浮回收。利用商业滴定ELISA试剂盒(Takara Bio公司)对病毒滴度进行测定，未发现含有Trem1 cDNA或Trem1 shRNA的慢病毒颗粒及其对照组之间在滴度上存在显著差异。

小胶质细胞转导

关于小胶质细胞转导过程，将纯化后的小胶质细胞以4×10⁵细胞/mL密度种植于24孔板上。向培养基中添加慢病毒颗粒和8μg/mL聚凝胺，并离心90min。转染后立即除去上清液并替换成含10％FBS及50％胶质培养上清液(转染前从培养基中获得)的基础培养基。72h后，利用时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和ELISA法对转染效率进行测定。

慢病毒颗粒脑内注射

注射过程遵循“盲法”，即负责立体定向颅内注射慢病毒颗粒的技术人员对实验组情况不知情。大体过 程为：将七月龄APP/PSEN1及与其年龄相匹配的WT小鼠麻醉后固定于立体定向操作架上(David Kopf Instruments公司)。使用与汉密尔顿注射器相连接的30-gauge微量移液管(Sigma-Aldrich公司)将慢病毒制剂(2μl)注入小鼠每侧大脑半球的大脑皮层(两处注射点)和海马(一处注射点)。注射位置的立体定向坐标从前囟开始依次为：(1)大脑皮层：前后：-0.3，中间外侧：2，背腹侧：-1.5mm和前后：-2，中间外侧：1.2，背腹侧：-1.2mm；及(2)海马：前后：-2；中间外侧：1.2；背腹侧：-2mm。完成注射2个月后对敲除效率和Trem1过表达情况进行验证。

脑室内抗体输送

依据已有方法完成向脑室内输送抗体的操作^[12]。将激动性Trem1抗体(100μg，catalog#：MAB1187-100，R&D Systems公司)或者其IgG_2A同型对照抗体(100μg，catalog#：MAB006，R&D Systems公司)加入到200μL人造脑脊液中再悬浮，并注入微型渗透泵(model 2006，ALZET公司)中。关于泵移植的操作：将七月龄APP/PSEN1小鼠及与其年龄相匹配的WT小鼠麻醉后固定于立体定位操作架上(David Kopf Instruments公司)。将借乙烯塑料管与渗透泵相连的脑灌注套管(ALZET公司)移植进第三脑室背侧(前囟后方0.5mm，颅骨表面下方3mm)。同时将渗透泵置于小鼠两侧肩胛骨间的皮下位置。在以后6周时间内，以0.15μL/h的泵度，持续将抗体泵入脑内。术后，将手术切口仔细缝合关闭。在整个手术过程中，未观察到小鼠出现任何神经毒性表现。

Y-迷宫测试

在动物被处死前的最后一天，按照之前描述的方法^[10]，采用“盲法”进行了Y-迷宫试验以评估动物的短期空间记忆功能。在暴露期，将小鼠放置在“起始”臂末端，并允许其在5分钟内自由探索Y-迷宫的第一臂部分(定义为“起始”臂)和第二臂部分(定义为“其它”臂)。该阶段，将通往迷宫第三臂部分(定义为“新”臂)的入口临时阻断。之后，小鼠被从迷宫中转移到其居住的笼子里待上2min。在试验阶段，将小鼠再次放入迷宫的“起始”臂内。同时，“新”臂入口被打开，并允许小鼠在迷宫中自由探索1rnin。利用追踪系统(Noldus Information Technology公司)记录下每一只小鼠于两个阶段内在迷宫每一臂区内花费的时间。对于暴露期，我们计算了小鼠待在“其它”臂的总时间与待在“起始”臂的总时间的比值。对于试验期，我们计算了一个鉴别指数＝[新臂时间/(新臂时间+其它臂时间)]×100。

Morris水迷宫测试

在处死实验动物前的最后6天内，依据前述方法^[7]，采用“盲法”进行了水迷宫试验。在连续5天内给予小鼠4次/天的试验训练。并记录下小鼠从起始处至找到水下隐藏平台之间路线的总长度，同时计算出四次试验所用时间的平均值。在最后一天，对小鼠进行一个移除平台后的探索试验，并利用追踪系统(Noldus Information Technology公司)记录下其游泳路径。

qRT-PCR(实时定量-聚合酶链反应)

利用Trizol试剂从人单核细胞或小鼠小胶质细胞中提取得到总RNA。利用PrimeScript^TM RT Master Mix (Takara Bio公司)在标准条件下使等量的总RNA发生逆转录反应。接着根据厂商说明书，利用SYBR Green Premix Ex Taq(Takara Bio公司)和特定小鼠引物(GAPDH正向链：GGTGGTCTCCTCTGACTTCA，GAPDH反向链：TCCTTGGAGGCCATGTGGGC；Gapdh正向链：CAACAGCAACTCCCACTCTTC，Gapdh反向链：GGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT；TREM1正向链：AGTGGGGAGGATCATACTAGAAGAC，TREM1反向链：AGGCTGGTAGATCACACACTGATAC；Trem1正向链：TGCTGTGCGTGTTCTTTGTCT，Trem1反向链：CTTCTGGCTGTTGGCATACTT；TREM2正向链：CTATGACTCCATGAAGCA，TREM2反向链：GATTCCGCAGCGTAATGG；Trem2正向链：GACCTCTCCACCAGTTTCTCC，Trem2反向链：TACATGACACCCTCAAGGACTG；TYROBP正向链：AGCGATTGCAGTTGCTC，TYROBP反向链：GTGATACGCTGTTTCCGGGT；Tyrobp正向链：CGTACAGGCCCAGAGTGAC，Tyrobp反向链：CACCAAGTCACCCAGAACAA)进行了实时定量-聚合酶链反应。

ELISA(酶联免疫吸附测定)

为测定全长TREM家族蛋白在细胞膜上的水平，收集人类单核细胞和小鼠小胶质细胞，并依照Geumann及其同事所描述的办法^[13]提取了细胞膜蛋白。依据厂商提供的手册，我们利用特殊的ELISA试剂盒(对于人类TREM1：catalog#：EHTREM1，Thermo Fisher Scientific公司；对于小鼠Trem1：catalog#：EMTREM1，Thermo Fisher Scientific公司；对于人类TREM2：catalog#：MBS2022102，MyBioSource，Inc.；对于小鼠Trem2：catalog#：MBS2023874，MyBioSource，Inc.)对全长TREMs蛋白进行检测。

为了评估细胞内Aβ_1-42的水平，我们参照之前方法^[7]收集并裂解了人类单核细胞和小鼠小胶质细胞。为检测脑内可溶性和不可溶性Aβ_1-42水平，我们在4℃条件下，利用10个体积的含5mM乙二胺四乙酸(EDTA)的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水(TBS)，磷酸酶抑制剂，不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物及2mM 1，10-邻二氮杂菲对大脑皮层和海马组织独立地进行了均质化处理。得到的匀浆在4℃，100,000g(转速)条件下离心1h。我们对上清液进行了收集以测定可溶性Aβ_1-42的含量。得到的颗粒状物质加入70％甲酸(FA，所用甲酸的体积等于用来离心的TBS匀浆的体积)作均质化处理。样本在4℃，100,000g(转速)条件下离心1h并收集上清液。用1Mtris碱中和含有FA的上清液，所得样本用来测定不可溶性Aβ1-42的含量。根据厂商提供手册，利用Aβ1-42 ELISA试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)测定Aβ1-42的水平。

免疫组化分析

我们依据之前方法准备了脑组织切片以供免疫组化分析使用^[7]。将脑组织与小鼠抗Aβ的单克隆抗体(Covance公司)一起孵育，然后加入生物素化的羊抗小鼠IgG抗体(Zhongshan Golden Bridge公司)。利用二氨基联苯胺对免疫反应进行检测。之后，将组织脱水、制片并置于光学显微镜下观察。依据我们之前描述的方法^[7]，采用“盲法”对总的淀粉样蛋白水平进行测定。

统计分析

使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software公司)进行数据分析。使用单样本t检验，独立样本t检验或 单因素方差分析(ANOVA)以及Tukey′s post hoc检验对平均数之间差异进行比较。对于Morris水迷宫这一隐藏平台试验，用二因素重复测量方差分析及Bonferroni多重比较检验对路径长度数据进行分析。本研究中，数据表达形式为：平均数±标准差。将P＜0.05视为具有统计学意义。

实施例2 Trem1可以调节小鼠小胶质细胞对Aβ的吞噬作用

作为中枢神经系统(CNS)唯一的单核吞噬细胞，小胶质细胞通过吞噬活动参与Aβ的清除。为弄清TREM1在小胶质细胞吞噬Aβ中的作用，我们利用慢病毒机制操纵从WT幼鼠中分离出的小胶质细胞中Trem1的表达。在转导72h后，分别利用qRT-PCR和ELISA技术对Trem1 mRNA的表达水平和Trem1蛋白水平的改变进行测定。之后，应用Griciuc等人提供的离体试验方法检测小胶质细胞对Aβ_1-42的吞噬和降解作用。敲除Trem1导致WT幼鼠小胶质细胞内化Aβ_1-42水平下降52％(P＜0.05)，而Trem1过表达导致小胶质细胞内化Aβ_1-42水平增加将近1.7倍(P＜0.05)。值得注意的是：操纵Trem1表达水平并未显著影响WT幼鼠源性小胶质细胞对Aβ_1-42的降解指数。

据以往的研究发现：APP/PSEN1小鼠7月龄时会出现显著的AD相关表型^[7]。因此，为了进一步在AD相关的背景下证实以上发现，我们通过慢病毒机制操纵7月龄APP/PSEN1小鼠小胶质细胞中Trem1的表达。在完成转导72h后，分别应用qRT-PCR和ELISA法对Trem1mRNA表达和Trem1蛋白水平改变进行测定。敲除Trem1使7月龄APP/PSEN1小鼠小胶质细胞内化Aβ_1-42的水平显著下降46％(P＜0.05)。相反，Trem1过表达导致小胶质细胞内化Aβ_1-42水平增加将近1.5倍(P＜0.05)。然而，操纵Trem1表达水平的改变并未对7月龄APP/PSEN1小鼠小胶质细胞对Aβ_1-42的降解速率造成显著影响。

实施例3 在APP/PSEN1小鼠的疾病进展期，Trem1在小胶质细胞上的表达水平相对稳定。

由于TREM1在AD条件下可以促进小胶质细胞介导的Aβ吞噬作用，我们合理地作出如下假设：TREM1可能在AD进展中起关键作用。为了验证这一假设，我们首先探索了APP/PSEN1小鼠在1，4，7和10月龄时，小胶质细胞Trem1及其适配器蛋白Tyrobp水平的动态改变。在APP/PSEN1小鼠疾病进展期间，Trem1或Tyrobp的表达水平未发生显著变化(Trem1 mRNA水平：P＝0.31；Trem1蛋白水平：P＝0.4；Tyrobp mRNA水平：P＝0.77)。同时，我们也未发现APP/PSEN1小鼠及与其年龄相匹配的WT小鼠在小胶质细胞Trem1或Tyrobp表达水平上存在任何显著差异。

实施例4 敲除Trem1可促进Aβ神经病理发生

为进一步探索TREM1蛋白在AD进展中的作用，我们利用慢病毒机制敲除了7月龄APP/PSEN1小鼠大脑内小胶质细胞中Trem1的表达，并观察其对Aβ病理的影响。慢病毒注射2个月后，我们通过RT-PCR和ELISA法证实了APP/PSEN1小鼠大脑内小胶质细胞中Trem1的表达发生了下调改变。APP/PSEN1小鼠大脑中总的 淀粉样蛋白水平在敲除Trem1后上升了1.66倍。此外，敲除Trem1使APP/PSEN1小鼠大脑皮层中不可溶性和可溶性Aβ_1-42的水平分别显著增加2.48倍(n＝12，P＜0.05)和1.57倍(n＝12，P＜0.05)。而且，敲除Trem1使APP/PSEN1小鼠大脑海马中不可溶性和可溶性Aβ_1-42的水平分别显著增加1.89倍(n＝12，P＜0.05)和1.58倍(n＝12，P＜0.05)。以上结果表明：敲除Trem1可以加重APP/PSEN1小鼠大脑的Aβ病理水平，这意味着TREM1可作为保护因子抑制AD的进展。

实施例5 过表达Trem1可以减弱Aβ病理及挽救AD相关的空间认知损害

为验证TREM1在AD进展中的保护作用，我们对7月龄APP/PSEN1小鼠大脑内小胶质细胞的Trem1进行了选择性过表达。慢病毒注射2个月后，我们通过RT-PCR和ELISA法证实了APP/PSEN1小鼠大脑小胶质细胞中Trem1的表达发生了上调改变。

首先，我们观察了Trem1过表达对大脑Aβ病理水平的影响。Trem1过表达使大脑内总淀粉样蛋白水平下降了65.4％。同时，Trem1过表达分别使APP/PSEN1小鼠大脑皮层中不可溶性和可溶性Aβ_1-42水平下降了61.7％(n＝12，P＜0.05)和32.5％(n＝12，P＜0.05)。此外，Trem1过表达分别使APP/PSEN1小鼠海马中不可溶性和可溶性Aβ_1-42水平下降了58％(n＝12，P＜0.05)和35.9％(n＝12，P＜0.05)。

下一步，我们利用Y-迷宫试验检测了Trem1过表达对短期空间记忆的影响。在暴露期，各组小鼠在两臂区域花费的时间差不多，可认为各组小鼠对迷宫的探索程度相同。在试验期，我们发现WT小鼠的“鉴别指数”(反映相对“其它臂区域”，动物探索“新臂区域”的偏好倾向)大于50％(n＝24，P＜0.05)。当与WT小鼠相比较，APP/PSEN1小鼠对“新臂区域”的探索倾向出现受损(n＝24；与50％比较：P＜0.05；与WT小鼠比较：P＜0.05)。而过表达Trem1可以完全逆转这一损害(n＝24；与50％机率比较：P＜0.05；与接受对照组慢病毒注射的APP/PSEN1小鼠比较：P＜0.05)。值得注意的是，注射慢病毒操作并未影响两种小鼠在试验期的表现。同时，WT小鼠中Trem1的过表达对试验表现没有影响。

之后，在处死动物前的最后5天里，我们利用水迷宫试验对动物进行了测试。首先，我们比较了两种小鼠的游泳速度，未观察到显著差异。慢病毒注射或Trem1过表达操作并未对两种小鼠(WT和APP/PSEN1小鼠)的游泳速度产生明显影响。这些结果确保我们排除动机和感觉运动因素对试验表现的干扰。接下来我们利用一个隐藏平台试验来测试动物的空间学习功能。如图5d所示：从第2至第5天时间里，WT小鼠找到平台位置所游过的距离均要比APP/PSEN1小鼠短(第2天：8.45±1.03vs.9.14±1.04m；第3天：7.52±0.98vs.8.96±0.84m；第4天：6.05±0.42vs.8.11±0.57m；第5天：5.38±0.79vs.7.56±0.72m；n＝24/每组，P＜0.05)。二因素重复测量方差分析表明：在整个任务期间，WT小鼠的表现较好(F_genotype(1，230)＝148.8，P＜0.05；F_days(4，230)＝173.9，P＜0.05；F_{genotype×days}(4，230)＝15.59，P＜0.05)，该结果证实了9月龄APP/PSEN1小鼠确实表现出空间记忆学习功能的损害。重要的是，Trem1过表达可以挽救APP/PSEN1小鼠的这一功能损害(F_treatment(1，230)＝59.72，P＜0.05；F_days(4，230)＝85.07，P＜0.05；F_{treatment×days}(4，230)＝7.49，P＜0.05)。值得注意的是：慢病 毒注射操作并未影响两种小鼠在水迷宫试验中的表现。同时，Trem1过表达也未对WT小鼠的测试表现产生影响(F_treatment(1，230)＝2.27，n.s.；F_days(4，230)＝168.4，P＜0.05；F_{treatment×days}(4，230)＝0.95，n.s.)。为了检测Trem1过表达对空间记忆的影响，我们将平台从水下移除，并在上一次训练试验结束24h后再次让小鼠进行空间探索试验。与WT小鼠表现相反，APP/PSEN1小鼠在目标象限和其它任何象限花费的探索时间几乎完全相同，意味着动物出现了明显空间记忆损害。重要的是，我们发现接受Trem1慢病毒注射的APP/PSEN1小鼠在目标象限花费的时间要比其它任何象限都要长，差异具有统计学意义(n＝24；37.57±1.38％vs.20.81±0.46％；P＜0.05)，这表明动物的空间记忆功能得到恢复。值得注意的是，慢病毒注射操作并未影响两种小鼠在探索试验中的表现。同时Trem1过表达也未影响WT小鼠在试验中的表现。

实施例6 通过激动性抗体激活Trem1信号通路可以缓和Aβ病理及AD相关空间认知损害

为了将以上发现转化到临床相关背景，我们使用微型渗透泵持续6周向7月龄APP/PSEN1小鼠大脑第三脑室背侧灌入一种激动性Trem1抗体以激活Trem1信号途径。

首先，我们测定了Trem1信号途径的激活对Aβ病理的影响。激动性Trem1抗体的注入使APP/PSEN1小鼠大脑皮层中非可溶性和可溶性Aβ_1-42的水平分别显著降低了31.4％(n＝12，P＜0.05)和24.6％(n＝12，P＜0.05)。同时，激动性Trem1抗体的注入使APP/PSEN1小鼠海马中非可溶性和可溶性Aβ_1-42的水平分别显著降低了6.1％和22.6％(n＝12，P＜0.05)。

下一步，我们利用Y-迷宫试验评估了Trem1信号途径的激活对短期空间记忆的影响。在暴露期，各组小鼠探索两臂区域花费的时间差不多。在试验期，APP/PSEN1小鼠呈现出来的“新臂”探索倾向受损(n＝24；与50％机率相比：n.s.；与WT小鼠相比：P＜0.05)可被激动性Trem1抗体所挽救(n＝24；与50％机率相比：P＜0.05；与接受对照组抗体注射的APP/PSEN1小鼠相比：P＜0.05)。需要指出的是，微型渗透泵的移植并未对两种小鼠在试验期的表现产生影响。同时，WT小鼠在试验期的表现也未受激动性Trem1抗体的影响。

此后在动物处死前的最后5天，我们应用Morris水迷宫试验对动物进行了测试。WT和APP/PSEN1小鼠的游泳速度均未受到微型渗透泵移植操作或激动性Trem1抗体注入操作的明显影响。我们接着利用隐藏平台试验测定了动物的空间学习功能。激动性Trem1抗体的注入成功挽救了APP/PSEN1小鼠受损的空间学习能力(F_treatment(1，230)＝62.79，P＜0.05；F_days(4，230)＝103.4，P＜0.05；F_{treatment×days}(4，230)＝4.02，P＜0.05)。值得注意的是，微型渗透泵的植入操作并未影响两种小鼠在隐藏平台试验中的表现。同时，激动性Trem1抗体的注入并未对WT小鼠试验期的表现产生任何影响(F_treatment(1，230)＝0.18，n.s.；F_days(4，230)＝203，P＜0.05；F_{treatment×days}(4，230)＝2.31，n.s.)。为了检测Trem1信号通路的激活对空间记忆的影响，我们将平台移除并在上个训练试验结束后24h再次让小鼠进行空间探索试验。接受激动性Trem1抗体的注入的APP/PSEN1小鼠在目标象限花费的时间要比其它任何象限长，差异具有统计学意义(F_treatment(1，230)＝0.18，n.s.；F_days(4，230)＝203，P＜0.05；F_{treatment×days}(4，230)＝2.31，n.s.)，表明小鼠空间记忆功能得到改善。值得注意的是，微 型渗透泵的植入并未影响两种小鼠在探索试验中的表现。同时，激动性Trem1抗体的注入对WT小鼠试验期的表现没有影响。

参考文献：

1.Scheltens P，Blennow K，Breteler MM，et al.Alzheimer′s disease.Lancet 2016.

2.Jiang T，Yu JT，Tian Y，et al.Epidemiology and Etiology of Alzheimer′s disease：From Genetic to Non-Genetic Factors.Curr Alzheimer Res 2013；10：852-67.

3.Hardy J，Selkoe DJ.The amyloid hypothesis of Alzheimer′s disease：progress and problems on the road to therapeutics.Science 2002；297：353-6.

4.Mawuenyega KG，Sigurdson W，Ovod V，et al.Decreased clearance of CNS beta-amyloid in Alzheimer′s disease.Science 2010；330：1774.

5.Jiang T，Yu JT，Zhu XC，et al.Temsirolimus promotes autophagic clearance of amyloid-beta and provides protective effects in cellular and animal models of Alzheimer′s disease.Pharmacol Res 2014；81：54-63.

6.Zondler L，Muller K，Khalaji S，et al.Peripheral monocytes are functionally altered and invade the CNS in ALS patients.Acta Neuropathol 2016.

7.Jiang T，Tan L，Zhu XC，et al.Upregulation of TREM2 ameliorates neuropathology and rescues spatial cognitive impairment in a transgenic mouse model of Alzheimer′s disease.Neuropsychopharmacology 2014；39：2949-62.

8.Bliederhaeuser C，Grozdanov V，Speidel A，et al.Age-dependent defects of alpha-synuclein oligomer uptake in microglia and monocytes.Acta Neuropathol 2016；131：379-91.

9.Griciuc A，Serrano-Pozo A，Parrado AR，et al.Alzheimer′s disease risk gene CD33 inhibits microglial uptake of amyloid beta.Neuron 2013；78：631-43.

10.Jiang T，Zhang YD，Chen Q，et al.TREM2 modifies microglial phenotype and provides neuroprotection in P301S tau transgenic mice.Neuropharmacology 2016；105：196-206.

11.Jiang T，Tan L，Zhu XC，et al.Silencing of TREM2 exacerbates tau pathology，neurodegenerative changes，and spatial learning deficits in P301S tau transgenic mice.Neurobiol Aging 2015；36：3176-86.

12.Tan MS，Yu JT，Jiang T，et al.IL12/23 p40 inhibition ameliorates Alzheimer′s disease-associated neuropathology and spatial memory in SAMP8 mice.J Alzheimers Dis 2014；38：633-46.

13.Geumann C，Gronborg M，Hellwig M，et al.A sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for the quantification of insoluble membrane and scaffold proteins.Anal Biochem 2010；402：161-9.