一种核酸及其蛋白在诊断主体类风湿性关节炎风险中的应用及试剂盒的制作方法

本申请涉及核酸及其蛋白在诊断主体类风湿性关节炎风险中的应用及其试剂盒，特别涉及使用ifi202b、ifi203、ifi204和ifi205基因或其蛋白质来诊断主体是否存在患有类风湿性关节炎风险和/或患有类风湿性关节炎。

背景技术：

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，缩写为RA)是一种常见多发病。目前对已经形成的类风湿性关节炎的药物治疗还没有重大突破。发病前期或者是前发病期治疗效果最好。尤其一些免疫调节类药物在发病前期疗效最好。因此对易感人群的预测在类风湿性关节炎的防治中极为重要。虽然目前在基因记忆遗传因子的预测方面有些进展，但类风湿病是由非常复杂的多因素导致，基因预测方面急需完善以提高预测效果。

根据目前遗传病理方面的知识，在表型的病理变化出现之前体内生理生化方面的变化首先发生。一些基因表达的变化是某些疾病的最直接的前期变化。因此找到致病密切相关的基因是准确预测疾病的关键。

近年来，已阐明类风湿性关节炎中的不可逆关节破坏比常规预测的更早开始，并且因此已推荐从早期开始积极使用显示出高关节破坏抑制性作用的生物制剂，这增加类风湿性关节炎的早期诊断的重要性。

传统的类风湿性关节炎诊断主要通过症状来进行。但近年来，以患者血清中所含的物质为标志物的诊断方法受到关注。作为这样的物质，已知有类风湿因子(rheumatoid factor)(针对变性IgG的自身抗体)、抗环状瓜氨酸化肽抗体(抗CCP抗体)等。

然而，在迄今为止的报道中，类风湿因子的灵敏度为75-80％、特异性为50-70％，抗CCP抗体的灵敏度为50-75％、特异性为85-95％。因此，类风湿性关节炎诊断的灵敏度和特异性等方法尚有待提高。

技术实现要素：

为了克服现有技术中的上述缺点，发明人经过深入研究，提出了一种通过测定与患类风湿性关节炎密切相关的基因的转录水平来诊断受试主体是否存在患有类风湿性关节炎的风险和/或是否患有类风湿性关节炎。其中与患类风湿性关节炎密切相关的基因为ifi202b、ifi203、ifi204和ifi205，这也是首次提出使用ifi202b、ifi203、ifi204和ifi205作为标志物对受试主体是否存在患有类风湿性关节炎的风险和/或是否患有类风湿性关节炎进行诊断。本发明具有以下突出的优点：1)可以对来自活组织检测样品、血液、血浆、血清和淋巴液的细胞中的相关基因(如ifi202b、ifi203、ifi204和ifi205)的RNA进行定量分析，例如可以通过芯片法和/或荧光定量PCR法来进行定量；2)可以重复测定；3)个体间转录水平上的差异显著，容易测量；4)本发明的RNA定量检测比蛋白质检测方法更敏感。

因此，本发明的目的之一在于提供了一种核酸在制备用于诊断主体是否存在患有类风湿性关节炎的风险和/或是否患有类风湿性关节炎的试剂盒中的应用，所述核酸的序列包括如SEQ ID No.1所示的序列中的任意一段序列、如SEQ ID No.2所示的序列中的任意一段序列、如SEQ ID No.3所示的序列中的任意一段序列和如SEQ ID No.23所示的序列中的任意一段序列中的至少一种；或所述核酸的序列包括来源于人，且与如SEQ ID No.1所示的序列中的任意一段序列、如SEQ ID No.2所示的序列中的任意一段序列、如SEQ ID No.3所示的序列中的任意一段序列、如SEQ ID No.4所示的序列中的任意一段序列和如SEQ ID No.23所示的序列中的任意一段序列同源和/或具有序列一致性，且功能相同的序列中的至少一种。其中上述来源于人的序列与如SEQ ID No.1所示的序列中的任意一段序列、如SEQ ID No.2所示的序列中的任意一段序列、如SEQ ID No.3所示的序列中的任意一段序列和如SEQ ID No.23所示的序列中的任意一段序列具有50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上或80％以上的一致性。具体来讲，经过序列比对分析，人源cDNA MNDA(myeloid cell nuclear differentiation antigen)与本发明中的鼠源ifi204、ifi205和Mndal为直系同源基因，其序列如SEQ ID No.28所示。因此，优选所述核酸的序列包括如SEQ ID No.28所示的序列中的任意一段序列。

使用本发明的核酸进行类风湿性关节炎的风险和/或类风湿性关节炎的诊断，可以通过生物芯片(又称为微阵列，或微阵列芯片)的方式来进行相关基因的转录水平的检测，也可以通过反转录荧光定量PCR来进行相关基因的转录水平的检测。也就是说，使用这两种方法都可以达到检测上述基因的转录水平高低的目的。当检测的相关基因的转录水平高于正常水平(作为对照的水平)，则说明受试主体有风险和/或正在罹患类风湿性关节炎；当检测的相关基因的转录水平低于正常水平(作为对照的水平)，则可以认为受试主体基本上没有风险和/或没有罹患类风湿性关节炎。

在本发明中，所述核酸的序列可以为单链，也可以为双链，本领域的技术人员可以根据实际情况确定所述核酸的序列具体为单链还是双链。所述核酸的序列的单链长度可以为40-300nt。当通过生物芯片的方式来进行检测时，所述核酸的序列的单链长度可以为40-200nt，优选核酸序列的单链长度为50-100nt。如果选用双链形式表示的话，所述核酸的序列的长度可以为40-200bp，优选核酸序列的长度为50-100bp。

在一个实施方式中，所述核酸的序列如SEQ ID Nos.5和/或6所示的序列。

在一个实施方式中，所述核酸的序列为cDNA序列和/或RNA序列。

当通过反转录荧光定量PCR的方式来进行检测时，所述核酸的序列的单链长度可以为80-300nt，优选核酸序列的单链长度为80-200nt，更优选核酸序列的单链长度为80-110nt。如果选用双链形式表示的话，所述核酸的序列的长度可以为80-300bp，优选核酸序列的长度为80-200bp，更优选核酸序列的长度为80-110bp。

在一个实施方式中，所述核酸的序列如SEQ ID Nos.7-10和24所示的序列中的至少一种。

在一个实施方式中，扩增如SEQ ID No.7所示序列的上下游引物的序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示，如SEQ ID No.7所示序列的探针的序列如SEQ ID No.13所示；扩增如SEQ ID No.8所示序列的上下游引物的序列如SEQ ID No.14和SEQ ID No.15所示，如SEQ ID No.8所示序列的探针的序列如SEQ ID No.16所示；扩增如SEQ ID No.9所示序列的上下游引物的序列如SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示，如SEQ ID No.19所示序列的探针的序列如SEQ ID No.19所示；扩增如SEQ ID No.10所示序列的上下游引物的序列如SEQ ID No.20和SEQ ID No.21所示，如SEQ ID No.10所示序列的探针的序列如SEQ ID No.22所示；扩增如SEQ ID No.24所示序列的上下游引物的序列如SEQ ID No.25和SEQ ID No.26所示，如SEQ ID No.24所示序列的探针的序列如SEQ ID No.27所示。

在一个实施方式中，其中的引物为双链DNA和/或单链DNA；其中的探针为单链DNA，例如cDNA。

本发明的目的之二在于提供了一种用于诊断主体是否存在患有类风湿性关节炎的风险和/或是否患有类风湿性关节炎的试剂盒，在所述试剂盒中包括如上任意一种核酸序列。其中该核酸序列可以根据利用生物芯片的检测原则来确定，例如具体的核酸序列可以为如SEQ ID Nos.5和/或6所示的序列等等；也可以根据反转录荧光定量PCR的检测原则来确定，例如具体的核酸序列可以为如SEQ ID Nos.7-10和24所示的序列中的至少一种等等。

当利用生物芯片来检测时，在所述试剂盒中除包括上述用于生物芯片检测所选用的核酸序列外，还包括能够固定所述核酸序列的芯片，优选所述芯片的材质选自尼龙膜、玻璃片、塑料、硅胶晶片和微型磁珠中的一种；并且在所述试剂盒中还任选地包括从来自所述主体的待检测样品中提取RNA所用的试剂和/或芯片杂交用试剂；优选所述待检测样品为活组织检测样品、血液、血浆、血清和淋巴液中的至少一种；更优选所述活组织检测样品为来自脾脏的活组织检测样品

具体的提取RNA的试剂可以包括：美国Life Technoligies公司的Trizol Reagents和Qiagen公司的Rneasy试剂盒。

芯片杂交用试剂可以包括：美国Illumina公司的TotalPrep^TM RNA Amplification试剂盒及HumanHT-12v4Expression芯片。

当利用反转录荧光定量PCR的检测时，在所述试剂盒中除包括如上用于反转录荧光定量PCR的核酸序列外，还包括进行荧光定量PCR所用的试剂，并且在所述试剂盒中还任选地包括从来自所述主体的待检测样品中提取RNA所用的试剂和/或反转录荧光定量PCR用试剂；优选所述待检测样品为活组织检测样品、血液、血浆、血清和淋巴液中的至少一种；更优选所述活组织检测样品为来自脾脏的活组织检测测样品，但在临床上很难获得，所以优选使用血样检测。

具体的反转录荧光定量试剂盒包括：美国Life Technoligies公司的TaqMan^TMgene expression探针，TaqMan^TM real-timepcr master mixes和Reverse Transcription Reagents试剂盒。

在本发明中，术语“受试主体”或“主体”是指哺乳动物，例如鼠(包括大鼠和小鼠)和人。不过一般来讲，本发明中的“主体”是指人。本领域的技术人员公知，用于研究人的类风湿性关节炎的模型一般为本发明中使用的患有自发性关节炎的小鼠模型。因此，本发明中的小鼠的自发性关节炎的研究结果可以用于人的类风湿性关节炎中，即本发明的研究结果可以用于诊断人是否存在患有类风湿性关节炎的风险和/或是否患有类风湿性关节炎，只是两者在序列上有所差异。

本发明中的术语一般均为本领域的常规术语，本领域的技术人员根据本领域的常规技术能够清楚的确定其含义。在另有说明的情况下，则以本发明中的解释为准。

在本发明中，小鼠亚系的名称可以使用省去部分信息的简写，同时也没有对大小写字母进行区分。例如BALB与Balb等同。

附图说明

图1：与DBA/1野生型小鼠的转录水平相比，在BALB.D1-1小鼠中转录水平下调的基因。图中纵坐标应该是基因上调或下调的倍数，横坐标标明的是基因的名称。

图2：与DBA/1野生型小鼠的转录水平相比，在BALB.D1-1小鼠中转录水平上调的基因。图中纵坐标应该是基因上调或下调的倍数，横坐标标明的是基因的名称。

图3：GeneNetwork显示鉴定出的基因转录水平均不与II1rn和其他白介素-1家族基因转录水平直接关联。由于该网络图中的部分基因名称被网络线所掩盖，因此，本发明对其中被掩盖的基因名称利用箭头进行了标识。

图4：与DBA-/-小鼠的表达水平相比，在BALB.D1-1小鼠中表达水平下调的基因。图中纵坐标应该是基因上调或下调的倍数，横坐标表明的是基因的名称。

图5：与DBA-/-小鼠的表达水平相比，在BALB.D1-1小鼠中表达水平上调的基因。图中纵坐标应该是基因上调或下调的倍数，横坐标表明的是基因的名称。

图6：GeneNetwork的数据分析表明，鉴定出的基因表达水平和II1rn家族基因表达水平无紧密联系。

图7：与BALB/c小鼠的表达水平相比，在BALB.D1-1小鼠中表达水平上调的基因。图中纵坐标应该是基因上调或下调的倍数，横坐标表明的是基因的名称。

图8：与BALB/c小鼠的表达水平相比，在BALB.D1-1小鼠中表达水平下调的基因。图中纵坐标应该是基因上调或下调的倍数，横坐标表明的是基因的名称。

图9：GeneNetwork表明，鉴定出的基因表达水平均不与Il1rap或其他白细胞介素1家族基因表达水平直接联系。

图10：BALB.D-型同类系小鼠中的下调基因。

水平轴上为探针/基因名称。纵坐标左侧数字为差异转录数值。

在图10中，BALB.D-1型同类系转录水平下降，因此它变得比敏感品系BALB/c-/-更抵抗关节炎。通过与BALB/c-/-比较，ifi204基因转录降低超过13倍，与此同时ifi203基因降低33倍以上。因此，当ifi基因的转录水平降低，对关节炎的易感性也降低(图10)。

图11：基于脾脏基因表达谱的基因网络。

图12：基于T(辅助)细胞基因表达谱的基因网络。

图13：基于T(调控)细胞基因表达谱的基因网络。

图14：来自Ensembl数据库的基因组图谱显示ifi簇位于QTL基因组区中的染色体1上，QTL是非-MHC基因座。MHC基因座位于染色体17上。其是不同的染色体。

图15：通过多系别比较确定BALB.D-1型同类系ifi基因转录降低。

同类系组12个基因的转录水平同其他四组的比较。

纵坐标左侧数字为倍数变化。横坐标为探针/基因的名称。四个不同系别用不同颜色标记。同类系BALB.D-1与BALB-/-和BALB/c系比较，基因转录水平下调，但同DBA-/-和DBA/1比较，没有显著性差异。

数据表明，ifi202b、ifi203、ifi204和ifi205基因的表达水平在脾脏和血液(干细胞)之间有很强的正相关。

图16：Balb.D1-1-/-同系表现型的严重程度。Balb.D1-1-/-同类系严重程度降低。

图17：Balb.D1-1-/-同系表现型的发病率。Balb.D1-1-/-同类系发病率降低。

其中，如图22所示，与DBA/1-/-比较，同类系DBA.B-1IFI基因的转录水平增强。在接下来的两个图显示，ifi基因转录水平增加导致对关节炎抵抗降低。

图18：与DBA/1-/-比较，DBA.B-1-/-同系表现型的发病率增加。

图19：DBA.B-1同类系小鼠相对于DBA/1系小鼠的关节炎发病水平严重程度同样增加。

概括以上数据，ifi202b、ifi203、ifi204和ifi205基因转录水平与关节炎成正相关。ifi202b、ifi203、ifi204和ifi205基因转录水平可以通过血液样本检测到。因此，本发明的专利是通过使用血液样本检测ifi基因转录水平来检验对关节炎的易感性。

图20：说明ifi204基因在血液和脾细胞中的转录水平呈显著正相关。ifi204基因在脾和血细胞之间转录为0.724，P值为2.39e-0.3，显示有明显的正相关关系。

如图10和图15显示，Balb.D1-1-/-同类系IFI基因转录水平降低。我们用接下来的两个图表明，由于IFI基因转录降低，Balb.D1-1-/-同类系对关节炎抵抗增加或者说关节炎发病程度也降低。

图21：同类系中ifi202b、ifi203、ifi204和ifi205基因转录水平与其他四组中相应基因的转录水平的比较。

纵坐标为倍数变化。比较组系别名称在下面的轴上标出。三个探针用不同的颜色标记。同类系(DBA.B-1)同DBA-/-和DBA/1系比较，基因的转录水平升高，但同BALB-/-和BALB/c系比较无差别。同类系(DBA.B-1)包含类风湿性关节炎的ifi基因的基因组区域，因此易患关节炎。DBA-/-是一种抵抗关节炎的系别。因此当ifi基因的转录水平增加，通过与DBA-/-比较，同类系(DBA.B-1)变得易患类风湿关节炎。同抵抗系别DBA-/-比较，ifi204基因转录水平增加了327倍并且ifi205基因转录水平增加到46倍(图22)。RNA水平的显著增加，使本发明的技术更容易使用和容易识别的转录差异。

图22：说明ifi203基因在血液和脾细胞中的转录水平呈显著正相关。ifi203基因在脾和血细胞之间转录为0.776，P值为5.99e-0.4，显示有明显的正相关关系。

具体实施方式

下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。

如无特别说明，本申请的实施例中的原料和催化剂均通过商业途径购买。

实施例1

通过下调同类系小鼠Tcrb基因的表达使ifi基因表达水平下调导致对自发性关节炎抵抗增强。

实验动物

BALB/c系小鼠因为缺乏IL-1(白细胞介素1)受体拮抗剂蛋白(Il-1ra)而产生自发关节炎疾病(SAD)，而DBA/1IL1rn^-/-系小鼠有这一缺陷却不发病。先前，我们定位了一个自发性关节炎1号染色体QTL(数量性状基因座)，然后开发了一种BALB.D1-1^-/-同类系小鼠。这种同类系小鼠以BALB/c^-/-为背景抵抗包含来自DBA/1^-/-的与抗关节炎有关的QTL基因片段。

材料和方法

从BALB.D1-1同类系和四个其他系别(BALB/c野生型，DBA/1，DBA/1IL1rn^-/-缺陷型和BALB/c IL1rn^-/-小鼠的脾脏获得全基因组表达谱。然后比较同类系和四个亲本的异同。在差异表达水平和基因功能的基础上筛选出潜在的致病基因。

结果

在同类系和三个亲本系BALB/c，DBA/1，和DBA/1^-/-小鼠中有相当数量的基因存在差异表达。然而仅有很少的差异表达基因通过同类系和BALB/c-/-系小鼠之间的比较被确定。这些差异表达基因主要来自T细胞受体β链(Tcrb)和干扰素激活蛋白(ifi)基因。这些基因也同样在同类系和BALB/c系小鼠中具有差异表达。然而，在同类系中表达水平与在DBA/1和DBA/1^-/-小鼠中的表达相似。Tcrb-j基因的表达水平与ifi基因家族的两个基因呈正相关。

结论

通过下调同类系小鼠Tcrb基因的表达使ifi基因表达水平下调从而增强对自发性关节炎的抵抗。

实施例2

材料与方法

同类系BALB.D1-1，BALB/c和DBA/1野生型小鼠，BALB/c和DBA/1Il1rn基因敲除型的4个月雌性小鼠，使用Illumina平台生成基因转录数据。BALB.D1-1系小鼠是在BALB/c的基因组背景上，包含来自DBA/1的第一染色体上于D1Mit55与D1Mit209两个DNA标记之间的DNA区域。

基因型分型

在RNA抽提和微阵列分析之前确认插入同类系BALB.D1-1小鼠基因型：通过耳穿孔获得提取基因组DNA的组织。大致上过程是，从组织中提取DNA并通过聚合酶链反应(PCR)进行微卫星标记扩增。PCR产物用Mega-Ge双重高通量垂直电泳系统(C.B.S.Scientific,Del Mar,CA)进行丙烯酰胺凝胶电泳分析。

RNA抽提

采用Trizol试剂(Invitrogen，CA)进行脾脏RNA的抽提，总RNA通过RNeasy MinElute Cleanup Kit(Qiagen，CA)试剂盒进行纯化，RNA的质量和完整性使用安捷伦生物分析仪进行分析^[1]。

微阵列程序

起始量采用200ng高质量总RNA，并且RIN(RNA完整性得分)数值大于7，用TotalPrep^TM RNA Amplification Kit(Ambion)试剂盒获得cDNA和cRNA。根据制造商的说明书中多个步骤程序，五个独立样本每一个取1.5ug的cRNA样本同Illumina公司mouse-6v1.1表达磁珠芯片混合过夜。清洗干燥然后用BeadArray Reader(Illumina，CA)扫描芯片，使用BeadStudio 2.3.41(Illumina，CA)生成原始数据^[2]。

微阵列数据的分析

原始数据使用BeadStudio软件分位数方法规范化处理。四组比较。并就小鼠基因表达谱将BALB.D1-1同BALB/c-/-系，BALB/c野生型，DBA/1-/-系及DBA/1野生型小鼠分别进行比较。通过分位数方法得出Diff分数是将P值进行转化，并且基于参考组和对照组间信号平均技术的差异提供P值方向性。假定P值为0.05，Diff分数＝±13；假定P值为0.01，Diff分数＝±22；设定P值为0.001，Diff分数＝±33；我们初步分析将Diff值设定为±10，以确保不会丢失潜在的候选基因^[2]。

候选基因，通路分析和构建

为了确定候选基因和构建通路/连接，在QTL区域和Il1rn，包括Il1a、Il1b、Il1r1、Il1r2的候选基因之间建立了相关表达。在通路分析上，充分利用了GeneNetwork网站(网址http://www.genenetwork.org/webqtl/main.py)基因表达谱的现有数据。使用了从脾脏获得来自C57BL/6j(B6)和DBA/2j(D2)的重组自交系(RI)基因表达数据^[3-4]。数据是由Affymetrix GeneChip小鼠基因第1.0ST阵列生成(http://www.genenetwork.org/webqtl/main.py？FormID＝sharinginfo&GN_AccessionId＝283)生成的。在多个探针的情况下，选择其中表达水平最高的进行分析。使用GeneNetwork应用工具构建GeneNetwork。基于相关矩阵结合的网络图表来构建GeneNetwork。网络图通常用来显示多组相互作用。弹簧模型设计(力量减弱)被用于所有图形样本的图解法。我们遵循强相关性、相关性、不相关性为标准条件。当R值等于或超过±0.7，被认为强烈的正相关或负相关。当R值在0.5到0.69或-0.5到-0.69之间，被认为存在很弱的相关性。当R值为0至±0.5，作为没有到弱相关^[2]。使用PGMapper初步分析关节炎基因相关性^[5]。

结果

不同类系别小鼠的全基因表达谱具有相似性

BALB.D1-1同类系包含BALB/c背景下的DBA/1中D1Mit55和D1Mit209标记两侧的基因组片段^[1]。首先研究BALB.D1-1系同其他四个系别小鼠全基因组表达的相似性。Illumina小鼠-6v1.1表达磁珠芯片包含代表29940个小鼠基因的30774个探针(46632个片段)。计算BALB.D1-1系和其他四个系别探针表达水平的R值(相关性)。尽管另四个系别的R值表明BALB.D1-1的表达谱与这四个系别显著相关，但是有轻微的差异。因为BALB.D1-1系缺乏白介素1受体拮抗剂蛋白(IL-1RA)，相对于野生型的BALB/c和DBA/1系别，其表达谱更接近于敲除DBA^-/-和BALB/c^-/-的系别，由于插入DBA/1的片段，BALB.D1-1系的行为类似于DBA^-/-，显示出抵抗自发性关节炎的基因图谱同DBA^-/-类似。然而，因为BALB.D1-1在BALB/c背景上，至少与DBA/1相关，R值为0.976964。

BALB.D1-1和DBA/1野生型基因表达谱

与DBA/1小鼠的表达水平相比，BALB.D1-1小鼠的264个探针的表达水平下调而472个探针的表达水平上调(图1，2)。在472个上调的探针中，344个是已知基因。通过PGMapper的搜索引擎我们发现，在344个已知基因中，61个是与关节炎相关的。在472个探针中的Darc和Fcgr4两个基因位于QTL区域(补充材料表S1)。在264个下调探针中，Kmo，Fcrla和Ephx1三个基因位于QTL区域内。264个探针中的189个是已知基因。其中26个已知基因在PGMapper中被归类为关节炎相关基因。(通过GeneNetwork分析61个上调基因，26个下调基因和Il1a，Il1b，Il1r1，Il1r2，Il1rap，Il1rapl1，Il1rn基因，经UTHSC Affy MoGene 1.0ST Spleen(http://www.genenetwork.org/webqtl/main.py？FormID＝sharinginfo&GN_AccessionId＝283)确认为162个探针。去除重复探针后，138个探针用于GeneNetwork构建。GeneNetwork显示这些基因均不与II1rn和其他白介素-1家族基因直接关联(图3)。

BALB.D1-1和DBA^-/-基因表达谱

与DBA^-/-小鼠的表达水平相比，BALB.D1-1小鼠的241个探针的表达水平下调而310个探针的表达水平上调(图4，5)。在310个上调的探针中，235个是已知基因。2013年10月2日我们通过PGMapper搜索引擎发现，在已知基因中43个是关节炎相关基因。在241个下调的探针中，212个是已知基因。2013年10月2日我们通过PGMapper搜索引擎发现，在已知基因中29个是关节炎相关基因。经UTHSC Affy MoGene 1.0ST Spleen确认，138个探针中有43个上调基因，29个下调基因和七个II1rn家族基因。去除重复探针后，101个探针用于分析。与DBA野生型小鼠表达相似，GeneNetwork的数据分析表明，这些基因和II1rn家族基因表达水平无紧密联系(图6)。

BALB.D1-1和BALB/c基因表达谱

与BALB/c小鼠的表达水平相比，BALB.D1-1小鼠的31个探针的表达水平下调而70个探针的表达水平上调(图7，8)。70个上调探针均是已知基因。且ifi202b基因位于在QTL区域内。在31个下调探针中，30个是已知基因。比较QTL区域的基因列表，ifi203基因位于该区域内。70个上调基因和30个下调基因经PGMapper分析发现Siglec 1是关节炎相关基因。128个探针分别代表70个上调基因，30个下调基因和II1rn，去除重复探针后，92个探针用于GeneNetwork构建。GeneNetwork表明，这些基因均不与Il1rap或其他白细胞介素1家族基因直接连系(图9)。

BALB.D1-1和BALB/c^-/-基因表达谱

与BALB/c^-/-小鼠的表达水平相比，BALB.D1-1小鼠12个探针的表达水平下调而无探针表达显著上调(图10)。在12个下调探针中，9个是已知基因或序列，LOC100040462(Mndal)，LOC639001(T-细胞受体β链V区的C5前体)，ifi203，LOC665425(T-细胞受体β链V区LB2前体)，Lefty1，TRBV6，LOC638301，ifi204，ifi202b。PGMapper的搜索引擎结果显示，这些已知基因中无关节炎相关基因。干扰素活化基因(ifi202b，ifi203，ifi204，Mndal)和Lefty1基因均位于QTL区域内。

11个探针中的6个(Rnpep，ifi203，ifi204，ifi205，Lefty1，ifi202b)在UTHSC Affy MoGene 1.0ST脾脏数据库内，这6个探针与Il1a，Il1b，Il1r1，Il1r2，Il1rap，Il1rapl1，Il1rn进行GeneNetwork分析。通过脾脏的全基因组转录图谱，我们构建了基因网络(图11)，结果表明IL1rn家族和干扰素活化蛋白(IFi)家族成员的转录水平无显著相关性。我们通过HZI辅助性T细胞Affymetrix M430v2(http://www.genenetwork.org/webqtl/main.py？FormID＝sharinginfo&GN_AccessionId＝319)和HZI调节性T细胞(CD4+CD25+)(http://www.genenetwork.org/webqtl/main.py？FormID＝sharinginfo&GN_AccessionId＝122)的全基因表达图谱构建GeneNetwork。辅助性T细胞和调节性T细胞的GeneNetwork数据显示，IL1rn家族和ifi家族成员表达水平无显著相关性(图12和13)。即使进一步降低阈值至0.35，IL1rn和IFi家庭成员仍然没有直接相关性。

干扰素激活蛋白和T细胞受体β链基因潜在参与抵抗SAD

接下来我们将同类系和四个亲本株间的所有12个基因的表达水平进行比较。如图6所示，与BALB^-/-小鼠相比较，同类系中12个基因中的11个下调，而与BALB/c野生型小鼠比较也下调。与DBA^-/-和DBA/1野生型小鼠比较，无基因表达下调。数据表明，这些基因在BALB/c和BALB^-/-小鼠中的表达水平很高，而在DBA^-/-和DBA/1野生型小鼠中表达水平很低。考虑到DBA^-/-小鼠对SAD具有抗性而BALB^-/-小鼠对SAD的敏感性这一事实，同类系中这些基因表达水平的降低可能正是同类系小鼠抗性增强的原因。

我们多个比较证实，在同类系T细胞受体β链和ifi集群的基因表达水平下降是导致同类系小鼠关节炎发病抵抗较BALB/c^-/-系小鼠高的主要改变。这些基因的表达水平类似于抵抗SAD的DBA系小鼠和DBA^-/-系小鼠。这些基因的表达低于SAD易感的BALB/c和BALB/c^-/-系小鼠。有相当数量的基因，由于不同基因组背景和Il1r突变，在同类系和其他三个亲系DBA，DBA-/-和BALB/c小鼠之间差异表达。然而，在同类系和BALB/c^-/-系小鼠间只有一个区别。这一差别就是在同类系小鼠1号染色体上的QTL基因组区域被来自DBA的片段所取代，而BALB/c^-/-基因组的剩余部分全部来自BALB/c系小鼠。我们的分析提示这一区域候选基因数量少，为我们最终找到同类系小鼠的致病基因提供了可能。

初始数据显示，ifi基因200集群包含同类系小鼠抵抗SAD最佳候选基因。在同类系和BALB/c^-/-系小鼠差异表达的基因中，ifi202b、ifi203、ifi204和ifi205四个基因位于ifi基因200集群和同类系转基因片段上。这些基因位于小鼠1号染色体转移QTL基因片段的D1Mit110(167758517-167758517)和D1Mit209(191493187-191493284)之间。ifi202位于这个区域并被认为是一个可激活干扰素狼疮易感性基因(图14)。封闭耐受CD8+Ti细胞的ifi202b基因能够消除这些细胞的抑制能力。目前已经开始研究ifi204在应对细菌感染方面的作用^[6]。预计在不久的将来可以确定ifi家族基因在感染和免疫先天性免疫应答方面更广泛的功能^[7]。因此，未来对他们的候选资格进行研究是非常重要的。

T细胞受体β链对关节炎易感性的调节作用众所周知^[8-10]。当前信息表明T细胞受体β链基因不位于同类系QTL区域的转移基因片段中。然而，研究T细胞受体β链家族和ifi家族间的基因是否通过相互作用下调同类系小鼠SAD是十分必要的。

除了T细胞受体β链和ifi基因，我们也检测了位于QTL区域Lefty1表达的差异。早期的研究表明，Lefty1，Lefty2和Nodal在发育中小鼠胚胎的左侧表达，并与L-R的测定有关联。目前，由于Lefty具有使细胞对不同分化因子如Nodal，或者需要Egfcfc作为共受体的其他信号无响应的改变细胞命运的独特能力，Lefty已成为被视为细胞干性或分化的一个决定因素。其在关节炎，炎症或感染中的作用无相关报道。目前，没有充分的信息解释其在同类系中的作用。

本项研究设三个重复，每次选择每个系别中的雌性小鼠。性激素已被证明差异调控ifi202的表达^[11]。然而，每一系别在同一年龄段都进行了测量。因此，这种差异至少反映了同类系和其他系别雌性小鼠基因组的变化。我们使用脾脏作为提取RNA和全基因组基因谱的器官^[3-4]。尽管脾脏是重要的免疫器官，但这些小鼠中SAD的表现型是基于关节。因此，我们不排除数据可能不能完全反映发生在关节上的所有事。然而，我们认为从本次研究中检测到的分子机制对于阐明同类系因果基因是很重要的。将候选基因与疾病的直接联系开展进一步的研究是十分必要的。由于ifi家族基因在脾和血细胞之间的表达水平具有较强的相关性，所以这些检测也可使用血液细胞来测试。

实施例3

该实施例说明类风湿性关节炎易感性与ifi202b、ifi203、ifi204和ifi205基因的表达水平的相关性。

下面是ifi202b、ifi203、ifi204和ifi205基因低表达水平系别小鼠和ifi202b、ifi203、ifi204和ifi205基因高表达水平系别小鼠间发病差异的证据。ifi202b、ifi203、ifi204和ifi205基因低表达水平的两个系别在两种情况下低发病率或不发病，然而ifi202b、ifi203、ifi204和ifi205基因高表达的两个系别小鼠有较高的发病率和较高的发病平均数。

BALB.D1-1^-/-同类系表型

小鼠BALB.D1-1-/-和BALB/c-/-种系是在相同的动物实验设施条件下饲养的。饲养条件为无需任何药物或特殊处理的正常条件。小鼠四个月大时，观察疾病的发生及分析疾病的进程。每只小鼠至少每周三次通过外表观察关节炎的发病程度。每一个肢体的得分都是0-4分。利用与我们先前描述的相同的统计学方法分析关节炎的严重程度和发病率((0—无红斑和肿胀，1—关节和踝关节轻度红肿，2—明确肿胀，3—所有肢体严重肿胀，4—肢体损坏变形)。四个肢体被计算出明确的分数。每个小鼠得分的最大值为16^[12,4]。一个系别得病的严重程度是通过所有小鼠总分除以小鼠的总量计算得出的。发病率是通过患病小鼠的量除以小鼠总量计算得出的。用费舍尔精确检验分析发病率和用方差分析严重程度的差别。

BALB.D1-1^-/-的表型的研究使用18只BALB D1-1^-/-系小鼠和18只BALB/c^-/-系小鼠。如图16所示，同类系已经显著减少并延缓自发性关节炎的的发病率(P值分别为3.4287E-07和3.4287E-06)。到100天时，虽然同类系发病小鼠低于BALB/c^-/-系小鼠，但是同系和BALB/c-/-系的发病率仍然几乎相同，达到100％。

Balb.D1-1^-/-同系表现型的结果可以参见图16和图17。

类似地，DBA.B-1^-/-同系表现型的结果可以参见图18。

BALB.D1-1^-/-和BALB.D1-2^-/-同类系，以及DBA/1^-/-包含BALB/c^-/-的1号染色体上的QTL区域来自DBA.D-1^-/-系。与另外两个同类系相比，在DBA/1背景下的BALB/c的QTL区域的一片基因组DNA增加了疾病的风险。DBA.B-1^-/-的表型研究使用14只小鼠。相比DBA/1^-/-的14只小鼠，同系明显增加了严重程度和自发性关节炎的发生率(P值分别为5.33637E-10和9.68472E-12)。

DBA.B-1同类系小鼠相对于DBA/1系小鼠的关节炎发病水平(平均得分(严重程度)，发病率)的结果可以参见图18和图19。

实施例4

该实施例用于说明ifi202b、ifi203、ifi204和ifi205基因转录水平与类风湿性关节炎发病几率的关系。

第一部分：测定基因表达水平的技术

·总RNA的提取和纯化

取小鼠脾脏组织用于总RNA的提取。使用Trizol试剂盒提取总RNA(Lifetechnology,CA,USA)。实验步骤被修改和优化如下：

RNA的提取：

(1)匀浆：使用PRO200均质器在1mL的TRIZOL试剂中研磨少于50mg的样本组织(Proscientific，CT，USA)。匀浆组织样本时体积不能超过TRIZOL试剂体积的5％。使用少于50mg组织有利于提高总RNA的质量和产量。

(2)相分离：每1mLTRIZOL试剂加入0.2ml氯仿。样本管盖紧。用力充分涡旋振荡15秒，室温孵育2-3分钟。12,000x g，2-8℃离心15分钟。小心将上层水相转移至管1，注意不要碰到两相界面。将剩余的上层水相和两相界面转移到管2。将管2于12,000x g离心15分钟，将上层水相转移到管1中。测量管1中液体的体积(水相体积是匀浆时使用TRIZOL试剂体积的65％)。

第二次水相离心将最大限度地获得总RNA。

(3)RNA沉淀：加入650μL冷的异丙醇，4℃孵育样本1h，然后2-4℃，12,000x g离心10分钟。

(4)RNA洗涤：弃掉上清液。加入至少1ml的80％冷乙醇，洗涤RNA一次。涡旋振荡混合样本，2-8℃，7,500x g离心5分钟，重复上面的洗涤程序一次，去除所有残留的乙醇。

(5)RNA纯化：

加入100μL的无核酸酶水将RNA溶解。加入10μL 3M醋酸钠，混合均匀；加入300μL100％乙醇；充分混匀-20℃孵育过夜(16小时)。

我们发现孵育过夜可最大程度重新获得总RNA沉淀。

将过夜后的液体4℃，12,000g离心30分钟，小心移除并弃掉上清。加入500μL80％冷乙醇清洗沉淀。4℃，8,000g离心5min，小心移除弃掉80％乙醇。重复80％乙醇洗涤两次。若要去掉残留的乙醇，迅速旋转样本管，用移液器吸出残留液体。空气干燥沉淀。用无核酸酶水重悬RNA沉淀，使终浓度为100ng/μL左右。

(6)使用NanoDrop 2000检测RNA浓度。

(7)安捷伦光度计2100检测RNA的质量和完整性。

2.基因芯片的测试和表达水平的分析

(1).测试过程：

使用TotalPrep^TM RNA检测试剂盒(Ambion，CA，USA)。使用200ng，RIN(RNA完整系数)值大于8的高质量总RNA，合成第一条互补DNA链(cDNA)，cDNA互补链的合成，cDNA的纯化，体外转录合成cRNA，cRNA的扩增和纯化。cRNA的溶液浓度用NanoDrop 2000分光光度计检测在260nm/280nm处的吸收率，生物素化的cRNAs(1600ng/样本)在58℃与芯片杂交19小时。这些直接杂交了的芯片用reader扫描(Illumina,San Diego,CA,USA)。

(2)微阵列芯片的基因信息

ifi202b、ifi203、ifi204和ifi205基因：在Illumina数据支持服务的小鼠的注释文件6_V2_0_R3_11278593_A中搜索ifi202b、ifi203、ifi204和ifi205(表1)。

表1 Illumina BeadChip小鼠全基因组表达谱芯片上的IFI基因信息

(3)基因表达水平的分析

使用Illumina专有的软件对原始数据的误差和质量检测进行处理。基因表达数据使用Partek Genomics Suite软件6.6版(Partec，MI，USA)进行归一化处理和总结。非配对t检验筛选出P≤0.05差异显著的并且平均差异倍数≥1.5的探针。

四组进行比较。D1.BALB-1的基因表达片段同BALB/c^-/-，BALB/c野生型，DBA/1^-/-和DBA/1野生型进行比较。分位数法得到的Diff值是提供该基于参考组和比较组平均信号之间的差异的P值的转化来的，同时提供了P值的方向性。当P值为0.05，Diff值为±13；当P值为0.01，Diff值为±22；当p值为0.001，Diff值为±33。最初的分析将Diff值设立为±13，以确保不会错过潜在候选基因。

3.realtime PCR(即实时荧光定量PCR)技术检测基因表达水平

(1)realtime PCR测试过程：

a.总RNA的分离

总RNA的分离步骤和试剂盒同样采用上文描述的Trozol试剂。我们实验室独特的优化步骤：最大限度地重新收集总RNA的量和消除基因组DNA污染。

b.靶基因特异性引物设计

使用自定义TaqMan分析设计工具为ifi202b、ifi203、ifi204、ifi205和mndal基因设计特异性引物(表2)。引物设计遵循下面的点进行优化，为了更好的评价不同样本组间表达水平的差异：

引物对儿绑定两个以上的外显子；每个基因片段在80-110bps之间；有目标序列中DBA1和Balb/c之间没有SNP(单核苷酸多态性)；目标序列最好覆盖，重叠或接近微阵列芯片探针序列。

表2.引物序列信息

c.逆转录生成cDNA

TaqMan逆转录试剂(Cat#N808-0234,ABI,CA,USA)进行cDNA生成的步骤，但本实验室对其进行了修改。以1200ng纯净的总RNA为模板。反应混合物50℃孵育10分钟，然后37℃60分钟，95℃15分钟。为精确cDNA的量，我们遵照Qiagen MinElute Reaction Cleanup Kit(Cat#28204，Qiagen，CA，USA)试剂盒生产手册来定量cDNA的量。我们用NanoDrop 200量化已经转录好的cDNA。所有cDNA样本使用去离子水稀释至realtime PCR反应设置的5ng/μL浓度。

d.PCR反应

TaqMan Gene Expression Master Mix(Cat#4369016，ABI，CA，USA)和自定义引物设计进行的PCR反应均按照制造商协议，本实验室同样进行修改。为了模板更加准确取20ng cDNA(4μL稀释cDNA)采用20μL反应体系。管家基因、β-肌动蛋白和GAPDH基因为内参基因。我们使用多个管家基因是为了利用每个基因表达实验，来解释对单个管家基因表达的实验条件产生的任何影响。为了准确性，每个实验设置复孔，加到超细的96孔板。标准的PCR反应设置为：50℃2分钟，95℃10分钟，95℃15秒40个循环，60℃1分钟，应用ABI Prism 7900 Detection System(Applied Biosystems，CA，USA)。

(2)个体之间基因表达水平差异的分析

检测出循环数(CT值)并计算出相关转录水平。数据按照计算出的相关表达式绘制，循环阈值是以探针固定的对数扩增为起始，ΔCt是目的基因CT值与管家基因的CT值之间的差值。经计算数据为2(每个循环增加的探针信号)为ΔCt的负指数值，以对照组和TNF-α刺激组的相关变化而绘制。根据ΔCt多个管家基因，我们确定每个靶基因最适合的一个。设置DBA1和Balb/c的亲本对照组分别作为两个同类系BALB.D1-1^-/-和BALB.D1-1^-/-的对照组。

第二部分：根据基因表达水平预测风湿病的机率

1.把在DBA的表达水平作为0，把在BALB/C的表达水平作为100。用DBA，BALC及同类系的表达水平来划一条直线，这样形成一个预测发病机率的预测公式。

2.ifi家族基因的表达水平与风湿关节炎成正比。

(1)小鼠背景介绍

BALB/c系小鼠缺乏IL-1受体拮抗蛋白(Il-1ra)引起自发性关节炎(SAD)而有这一缺陷的DBA/1IL1rn^-/-系小鼠没发病^[13]。之前，我们绘制了SAD 1号染色体数量性状位点(QTL)图，然后研发出BALB.D1-1^-/-系小鼠，此小鼠包含与BALB/c^-/-背景上DBA/1^-/-抵抗有关的QTL基因片段。

(2)结果

在同类系与BALB/c，DBA/1和DBA/1^-/-三个亲系之间有相当大数量的基因差异表达。然而通过同类系和BALB/c^-/-系比较只有少数差异表达基因被确定。这些基因的差异表达主要来自T细胞受体β链(Tcrb)和干扰素激活蛋白(ifi)基因。这些基因在同类系和BALB/c之间差异表达，然而他们在同类系的表达水平同DBA/1和DBA/1-/-系相似。Tcrb-j基因的表达水平已明确与ifi基因200集群中的两个基因相关。

小结：

通过以上方法和步骤说明通过测定ifi202b、ifi203、ifi204和ifi205的转录水平可以预测风湿病发病的几率。任何其它生物技术用来测定基因转录的方式方法都可以用来测定IFI基因组里的基因转录水平。因此，任何用测定IFI基因组里的基因转录水平来预测风湿病发病几率的方式方法都应该在本申请的范围之内。

实施例5

该实施例用于说明ifi202b、ifi203、ifi204和ifi205基因在脾细胞和人类造血细胞之间的表达水平的相关性。

采用与实施例3基本相同的方法进行试验。

试验步骤包括：确定来自脾和血细胞样本中的ifi203和ifi204基因的表达水平，并对它们的表达水平进行比较。

鉴定脾脏样品中ifi203和ifi204基因的表达水平，操作步骤如下：1)打开GeneNetwork网址http://www.genenetwork.org/webqtl/main.py；2)从“Type”类别中选择脾脏；3)在“Data Set”类别中选择UTK脾脏ILM6.1；4)在“Get any”类别中输入ifi203或者ifi204，然后搜索这两个基因的探针。

鉴定造血细胞样品中ifi203和ifi204基因的表达水平，操作步骤如下：1)打开GeneNetwork网址http://www.genenetwork.org/webqtl/main.py；2)从“Type”类别中选择造血细胞mRNA；3)在“Data Set”类别中选择UMCG干细胞ILM6v1；4)在“Get any”类别中输入ifi203或者ifi204，然后搜索这两个基因的探针。

确定每个基因的探针样本后，使用“添加”键将样本收集到的数据收集表中。在数据采集表中，选择了两个探针用于比较，使用命令“矩阵”来构建比较矩阵。在矩阵中，单击rho值的符号获取两个探针的相关图表。

首先进行了ifi203基因在脾脏样品和造血细胞的比较，然后比较ifi204基因在脾脏样品和造血细胞的情况。分析数据是来自上述GeneNetwork的脾细胞和造血细胞这两个细胞类型的ILM6.1芯片(Illumina公司)。试验结果示于图16、图20中。这两组数据表明，这两种类型的细胞的表达水平是高度相关的。其中，血液细胞和脾细胞之间采用相同的探针进行比较。对于ifi203，探针是ILM6420102(SEQ ID No.5)。对于ifi204，探针是ILM6520601(SEQ ID No.6)。

由图16和图20可得知，ifi204基因在血液和脾细胞中的表达水平也均呈显著正相关(图16)，ifi203基因在血液和脾细胞中的表达水平均呈显著正相关(图20)。

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以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。