粗基质中的核酸的检测的制作方法
【专利说明】
[0001 ]本申请是中国发明专利申请，【申请号】201080042456.4,题目：粗基质中的核酸的 检测的分案申请。
[000。相关申请案交叉参考
[0003] 本申请案主张于2009年9月25日提出申请的美国专利公开案第61/245,758号的优 先权，所述案件的全部内容W引用方式并入本文中。
技术领域
[0004] 本掲示内容设及通过扩增方法检测粗基质中的核酸。
【背景技术】
[0005] 等溫扩增方法能够使核酸祀标在几分钟内W特异性方式从痕量水平扩增到极高 且可检测水平。所述等溫方法(例如重组酶聚合酶扩增(RPA))可使基于核酸的诊断的应用 扩大到例如重点照护测试与现场和消费者测试(field and consumer testing)等新兴领 域。所述技术的等溫和宽溫度范围可允许用户避免使用复杂的需求电力的仪器。
【发明内容】
[0006] 本发明至少部分是基于W下发现:可不进行核酸提取和/或纯化在粗基质中检测 各种病原性有机体。使用粗基质不进行核酸提取和/或纯化可为上述等溫核酸扩增方法的 优点增加简单试样制备的优点。在一些情形下，简单处理(例如碱裂解或裂解酶处理)对于 检测即足够。在一些其它情形下，可W高敏感性检测有机体的祀核酸序列，而无利用常规裂 解溶液预处理试样的任何需要。相反，使试样与等溫扩增反应接触可足够W高敏感性检测 有机体。
[0007] 在一个方面中，本掲示内容的特征在于包括W下的方法:使粗基质与祀核酸物质 的等溫核酸扩增反应的组份接触，由此提供混合物;在足W进行等溫核酸扩增反应的条件 下培育所述混合物，由此提供产物;和确定所述产物中是否存在所述祀核酸物质的指示物。 [000引在另一方面中，本掲示内容的特征在于包括W下的方法:使粗基质与祀核酸物质 的核酸扩增反应的组份接触，由此提供混合物;将所述混合物在低于95°C (例如，低于90°C、 低于85°C、低于80°C、低于75°C、低于70°C、低于65°C、低于60°C、低于55°C、低于50°C、低于 45Γ或低于4(TC)的溫度下维持足W进行核酸扩增反应的时间，由此提供产物;和确定所述 产物中是否存在所述祀核酸物质的指示物。
[0009] 在另一方面中，本掲示内容的特征在于包括W下的方法:使粗基质与祀核酸物质 的核酸扩增反应的组份接触，由此提供混合物；将所述混合物的摄氏溫标溫度改变小于 30% (例如，小于25%、小于20%、小于15%、小于10%或小于5%)或小于20°C (例如，小于15 °C、小于10°C、小于5°C、小于2°C或小于rC)达足W进行核酸扩增反应的时间，由此提供产 物;和确定所述产物中是否存在所述祀核酸物质的指示物。
[0010] 在另一方面中，本掲示内容的特征在于包括W下的方法:实施混合物的等溫反应 w提供产物，所述混合物包含粗基质和祀核酸物质的核酸扩增反应的组份;和确定所述产 物中是否存在所述祀核酸物质的指示物。
[0011] 在另一方面中，本掲示内容的特征在于包括W下的方法:使混合物在最高80°C (例 如，最高75°C、最高70°C、最高65°C、最高60°C、最高55°C、最高50°C、最高45°C或最高40°C) 的溫度下反应W提供产物，所述混合物包含粗基质和祀核酸物质的核酸扩增反应的组份； 和确定所述产物中是否存在所述祀核酸物质的指示物。
[0012] 在另一方面中，本掲示内容的特征在于包括W下的方法:使混合物反应，同时将混 合物的摄氏溫标溫度改变至多30% (例如，至多25%、至多20%、至多15%、至多10%或至多 5%)或至多20°C (例如，至多15°C、至多10°C、至多5°C、至多2°C或至多rC似提供产物，所 述混合物包含粗基质和祀核酸物质的核酸扩增反应的组份;和确定所述产物中是否存在所 述祀核酸物质的指示物。
[001引在上述方面的一些实施例中，粗基质包括生物试样，例如血液、尿、唾液、疲、淋己、 血浆、精液、肺吸出物和脑脊液中的至少一者。在一些实施例中，生物试样包括至少一种选 自由W下组成的群组的试样：咽拭子、鼻拭子、阴道拭子或直肠拭子。在一些实施例中，生物 试样包含活检试样。
[0014] 在上述方面的一些实施例中，粗基质未经受裂解处理。
[0015] 在上述方面的一些实施例中，粗基质未用离液剂、洗涂剂或裂解酶制剂处理。
[0016] 在上述方面的一些实施例中，粗基质未经受高溫(例如，80°C或更高、85°C或更高、 90°C或更高或95°C或更高)热处理步骤。
[0017] 在上述方面的一些实施例中，粗基质未经受裂解处理且祀核酸物质是葡萄球菌 (例如，金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA))核酸。
[0018] 在上述方面的一些实施例中，粗基质未经受裂解处理且祀核酸物质是支原体核 酸。
[0019] 在上述方面的一些实施例中，粗基质可经受裂解处理。例如，用洗涂剂和/或裂解 酶(例如隧菌体溶菌素(例如，链球菌Cl隧菌体溶菌素 (PlyC)))处理粗基质。
[0020] 在上述方面的一些实施例中，粗基质经受裂解处理且祀核酸物质是链球菌(例如， A组链球菌或B组链球菌)核酸。
[0021] 在上述方面的一些实施例中，粗基质经受裂解处理且祀核酸物质是沙口氏菌（例 如，鼠伤寒沙口氏菌)核酸。
[0022] 在上述方面的一些实施例中，祀核酸是来自（例如)选自W下的细菌或来自本文所 述另一细菌的细菌核酸:沙眼衣原体、奈瑟氏淋病双球菌、A组链球菌、B组链球菌、难辨梭状 芽抱杆菌、埃希氏大肠杆菌、结核分枝杆菌、幽口螺杆菌、阴道加德纳氏菌、人型支原体、活 动弯曲杆菌属、普雷沃氏菌属和红栋色单胞菌属。
[0023] 在上述方面的一些实施例中，祀核酸是哺乳动物核酸，例如核酸与肿瘤细胞有关。
[0024] 在上述方面的一些实施例中，祀核酸是(例如)来自HIV、流感病毒或登革病毒或来 自本文所述另一病毒的病毒核酸。
[0025] 在上述方面的一些实施例中，祀核酸是(例如)来自白色念珠菌或本文所述另一真 菌的真菌核酸。
[0026] 在上述方面的一些实施例中，祀核酸是(例如)来自毛滴虫或本文所述另一原生动 物的原生动物核酸。
[0027]在上述方面的一些实施例中，等溫核酸扩增反应是重组酶聚合酶扩增。在一些实 施例中，等溫核酸扩增反应是转录介导的扩增、基于核酸序列的扩增、信号介导的RNA扩增、 链置换扩增、滚环扩增、环介导的DNA等溫扩增、等溫多重置换扩增、解链酶依赖性扩增、单 引物等溫扩增、环解链酶依赖性扩增或切口和延长扩增反应。
[00%]在上述方面的一些实施例中，反应条件包含（例如）浓度大于1 %的聚乙二醇 (PEG)o
[0029] 在另一方面中，本掲示内容的特征在于检测特定DM或RNA物质的方法，其中使试 样在未经离液剂、洗涂剂先前裂解处理、无高溫热处理步骤或裂解酶制剂的情况下与反应 再水合缓冲液或水合反应系统接触，并且扩增到可检测水平。在一些实施例中，祀核酸物质 包括金黄色葡萄球菌或MRSA的基因组DNA。在一些实施例中，扩增方法是重组酶聚合酶扩增 (RPA)方法。在一些实施例中，再水合缓冲液或完全再水合扩增环境中包括浓度大于1%的 聚乙二醇。
[0030] 在另一方面中，本掲示内容的特征在于包括等溫核酸扩增反应的组份和裂解酶的 试剂盒。等溫核酸扩增反应的组份可包括(例如)重组酶。在一些实施例中，裂解酶包括隧菌 体溶菌素，例如链球菌Cl隧菌体溶菌素(PlyC)。
[0031] 在另一方面中，本掲示内容的特征在于包括等溫核酸扩增反应的组份和侧向流动 或微流体装置(例如，用于检测反应产物）的试剂盒。等溫核酸扩增反应的组份可包括（例 如)重组酶。
[0032] 在另一方面中，本掲示内容的特征在于包括等溫核酸扩增反应的组份和拭子(例 如，用于获得生物试样)的试剂盒。等溫核酸扩增反应的组份可包括(例如)重组酶。
[0033] 在上述试剂盒中任一者的一些实施例中，试剂盒不包括用于核酸纯化或提取的试 剂，例如离液剂和/或核酸结合介质。
[0034] 如本文所用"粗基质"是包括来自生物来源的核酸的基质，其中基质未经受核酸提 取和/或纯化。在一些实施例中，生物来源包括细胞和/或生物试样(例如，来自患者)和/或 环境试样。细胞和/或生物试样和/或环境试样可未裂解或经受裂解步骤。
[0035] 除非另有说明，否则本文所用所有技术和科学术语皆具有与所属领域技术人员通 常所了解的含义相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可使用与彼等本文所述者类似 或等效的方法和材料，但下文仍对适宜方法和材料加 W阐述。本文所提及的所有出版物、专 利申请案、专利和其它参考文献的全部内容都W引用方式并入本文中。如果出现冲突，则W 本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实例仅具有阐释性而非限制性。
[0036] 本发明的其它特征和优点从下列实施方式和权利要求书将显而易见。
【附图说明】
[0037] 图1A-B是绘示10，000cfu、lOOOcfu和lOOcfu鼠伤寒沙口氏菌在未裂解下（1A)或碱 裂解之后（1B)检测的线形图。
[0038] 图2是绘示未裂解(无裂解）、用变溶菌素和溶菌酶(ML/LZ)处理、用PlyC(PLYC)处 理或用变溶菌素、溶菌酶和PlyC(ML/LZ/PLYC)处理的Strep A的检测的线形图。
[0039] 图3是绘示用0、1、2或3个单位溶葡萄球菌素处理的患者试样中的金黄色葡萄球菌 的检测的线形图。
[0040] 图4是绘示煮沸45分钟（煮沸）、用溶葡萄球菌素处理并煮沸5分钟（溶葡萄球菌 素）、或于室溫下在水中培育45分钟的患者试样中的金黄色葡萄球菌的检测的线形图。将试 样与具有50或1000个祀核酸拷贝的阳性对照比较。
[0041] 图5是绘示未裂解(Unlysed)或用溶葡萄球菌素裂解并提取(清洁）的患者试样中 的金黄色葡萄球菌的检测的线形图。将试样与具有50或1000个祀核酸拷贝的阳性对照进行 比较。
[0042] 图6是绘示未裂解的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)试样的检测的线形图， 所述试样具有约10个有机体(10个细菌)或约100个有机体(100个细菌）。将试样与具有50个 祀核酸拷贝（50个PCT产物拷贝）的阳性对照或作为阴性对照(NTC)的水进行比较。
[0043] 图7是绘示50cfu、100c化或lOOOcfu未裂解支原体或培养基对照的检测的线形图。
【具体实施方式】
[0044] 本发明提供粗基质中的核酸的等溫扩增方法，其用于检测核酸祀标。
[0045] 在一些实施例中，使粗基质与祀核酸物质的等溫核酸扩增反应(例如，RP