奶牛PAG1检测试纸条及其制备方法与流程

本发明涉及一种胶体金检测试剂盒，特别是涉及一种针对牛pag1抗原的胶体金试纸条及其制备方法。

背景技术：

反刍动物胎儿胎盘的滋养层双核细胞在与母体子宫上皮细胞融合时，会释放包括妊娠相关糖蛋白(pregnancy-associatedglycoprotein，pag)等物质到母畜血液中。这些蛋白质对胎盘组织具有特异性，所以可以以母体血液中的pag含量作为确定妊娠的指标。

使用pag-elisa法检测pag含量，已成为目前国际上比较流行的奶牛早期妊娠诊断方法。但目前这些pag检测方法依旧难以在养殖场现场独立完成。因此，目前养殖业中尚需要一种准确、快速且方便的pag检测方法用来快速诊断奶牛妊娠。

在还原剂作用后的氯金酸(haucl4)中，金颗粒可以聚合形成一定规模、带负电荷的、疏水性的胶溶液，由于静电相互作用而成为稳定的胶体状态，因此称为胶体金。胶体金标记本质上是一种蛋白质的聚合物吸附到胶体金颗粒表面的涂覆工艺。可能的吸附机理是胶体金颗粒表面带有负电荷，与带正电荷的组蛋白进行静电吸附和固体组合。不同粒径、不同颜色的胶体金粒子可以通过氯金酸还原法制备。

胶体金球形颗粒对蛋白质的吸附功能十分强大。据报道，胶体金颗粒可以和金黄色葡萄球菌免疫球蛋白、毒素、酶、抗生素、激素、蛋白、牛血清白蛋白多肽缀合物和其他非共价蛋白质结合，因此，胶体金技术在基础研究和临床试验中是一个非常有用的工具。

胶体金免疫层析技术已经在人快速妊娠诊断技术中得到了广泛的应用，其原理是将两个有不同结合位点特异单克隆抗体分别固定在硝酸纤维素膜的一个线性区域和干燥的干燥玻璃纤维中，当样品(尿液或血清)经过标记有特异性抗体胶体金的干燥玻璃纤维时，通过毛细现象，样品会在层析条涌动，若样品中含有相应抗原，在其通过玻璃纤维中的金标抗体时会发生第一步免疫反应，第一步免疫反应复合物经过线性包被区发生第二次免疫反应，这之后形成的复合物将不再向前泳动。同时，在线性区形成颜色条带(t线)，游离的抗体标记物则继续涌动，到达包被着标记有二抗的胶体金线性区域与之结合而被截留显现颜色(c线)。因此，如果t线和c线均显色，检测样品为阳性；t线不显色c线显色，说明样品为阴性：c线不显色，检测结果无效。

利用胶体金免疫层析试纸条的这些特点，可以研发适合在基层养殖单位进行早期妊娠快速诊断的pag1蛋白检测试纸条产品，以能够精确、灵敏、快速地诊断母牛妊娠。

要实现这一目的，则需要提供能够识别pag蛋白不同抗原表位的可配对的单抗，而目前市场上还没有此类抗体在售。

本申请人申请号为201710204079.3的专利申请中，涉及了一种氨基酸序列为asnasnilehisargleuileglyalaileproargglysergluhistyrvalprocyssergluvalasnthr的奶牛pag1多肽，以及以该多肽为抗原免疫动物获得的多克隆抗体。该奶牛pag1多肽作为奶牛妊娠检测试剂使用，特异性好，效价高，为抗pag1单克隆抗体的制作奠定了基础。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种奶牛pag1检测试纸条，以及所述奶牛pag1检测试剂条的制备方法。

本发明所述的奶牛pag1检测试纸条包括底板，以及粘贴在所述底板上的上样垫、胶体金垫、nc膜和吸样垫，在所述nc膜上设置有检测线和质控线，所述nc膜的检测线端依次叠加粘贴有胶体金垫和上样垫，质控线端叠加粘贴吸样垫。其中，在所述胶体金垫上包被有pag1单克隆抗体，nc膜的检测线上包被antipag1重组抗原，质控线上包被羊抗鼠igg抗体。

具体地，本发明所述的antipag1重组抗原是本申请人申请号为201710204079.3的专利申请中公开的，根据ncbi公布的pag1氨基酸序列，经大肠杆菌密码子优化，克隆得到的重组蛋白antipag1(54～380aa)。

进而，本发明所述的pag1单克隆抗体则是以上述antipag1重组抗原的表位n端284～308位的25个氨基酸，即氨基酸序列为nnihrligaiprgsehyvpcsevnt的奶牛pag1多肽作为靶标免疫小鼠，经细胞融合，筛选得到的杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体。

本发明所述的奶牛pag1检测试纸条可以采用下述方法制备得到：

1)以氯金酸-柠檬酸钠还原法制备胶体金溶液，向每1ml胶体金溶液中加10µl0.11mol/l碳酸钾溶液调节胶体金溶液的ph值；

2)在每1ml胶体金溶液中加入5～10µgpag1单克隆抗体，摇匀后静置5min，用bsa溶液封闭；沉淀出胶体金标记的抗体复合物，以胶体金稀释液稀洗涤沉淀，并用胶体金稀释液稀释至原体积的1/10，得到胶体金标记pag1单克隆抗体溶液；

3)取nc膜固定在底板上，将稀释的antipag1重组抗原和羊抗鼠igg抗体分别作为检测线和质控线包被在nc膜上，干燥保存；

4)取聚酯纤维膜置于喷金划膜仪的工作台上，将胶体金标记pag1单克隆抗体溶液均匀喷涂于聚酯纤维膜上，干燥制成胶体金垫；

5)在玻璃纤维膜上均匀涂上玻纤处理液，干燥后制成上样垫；

6)在固定有nc膜的底板上nc膜检测线端依次叠加粘贴胶体金垫和上样垫，质控线端粘贴吸样垫。

本发明上述制备方法中，所述用于包被检测线的antipag1重组抗原以及用于包被质控线的羊抗鼠igg抗体的浓度均为1.5～2.5mg/ml。

进而，本发明将所述胶体金标记pag1单克隆抗体溶液以5µl/cm²均匀喷涂于聚酯纤维膜上。

更进一步地，本发明所述制备方法中，是在每1ml胶体金溶液中加入20µl10%bsa溶液，混匀后静置5min，对所述胶体金标记pag1单克隆抗体进行封闭。

具体地，本发明用于制备所述检测试纸条的底板为聚氯乙烯板，nc膜为硝酸纤维素膜。

需要说明的是，检测试纸条的制备方法可以多种多样，本发明上述方法只是一种比较典型的方法，并非唯一的制备方法。进而，上述制备方法制备出的检测试纸条为裸条，在大规模生产中，也可以制作成带卡壳的检测试纸条。

本发明以antipag1重组抗原与pag1单克隆抗体配对制备奶牛pag1检测试纸条，其中的pag1单克隆抗体特异性好、效价高，基于其开发的检测试纸条具有较高的灵敏度，经实际应用，能够快速诊断出奶牛的早期妊娠，结果准确，在我国奶牛养殖业中具有很强的应用前景。

附图说明

图1是本发明检测试纸条的结构示意图。

图2是使用实施例1试纸条检测妊娠奶牛阳性和阴性血清的检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明技术方案进行进一步的说明。本发明所述实施例仅用于解释本发明，而不应理解为对本发明范围的限制。在不背离本发明技术方案的前提下，对本发明所作出的本领域技术人员容易实现的任何改动，都应认为是本发明的内容。

本发明所述实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。

实施例1。

1、胶体金试纸条生产所需溶液及处理液的配制。

1%氯金酸溶液：1g氯金酸，用超纯水定容至100ml。

2%柠檬酸钠溶液：2g柠檬酸钠，超纯水定容至100ml。

0.11mol/l碳酸钾溶液：0.456g碳酸钾，用超纯水定容至30ml。

10%氯化钠溶液：1g氯化钠，用超纯水定容至10ml。

10%bsa：1gbsa，超纯水定容至10ml。

1×pbs：10×pbs与超纯水按1∶9稀释。

玻纤处理液：tris0.18g、bsa0.15g、蔗糖0.15g、triton-10030µl，pbs定容至30ml。

胶体金稀释液：磷酸二氢钠0.213g、bsa0.3g、蔗糖0.3g、pbs定容至30ml。

antipag1重组抗原：用pbs溶液稀释至1.5mg/ml。

羊抗鼠igg抗体：用pbs溶液稀释至1.5mg/ml。

pag1单克隆抗体：用ddh2o稀释至1mg/ml。

2、胶体金溶液的制备。

将1000ml锥形瓶重铬酸钾浸泡过夜，蒸馏水反复冲洗后高压灭菌，于75℃烘箱中干燥过夜备用。

将全新的磁力搅拌器转子洗净后置于锥形瓶中，量取665ml超纯水，搅拌加热，漩涡不得接触锥形瓶底部。

水煮沸后，量取14g1%氯金酸和14g2%柠檬酸钠溶液，分别一次倒入锥形瓶中，瓶内溶液由黄变黑最终变为酒红色后，继续加热10分钟，停止加热，继续搅拌冷却至室温。

将上一步制备的溶液倒出，锥形瓶保留转子，超纯水冲洗三次，重复上一步实验。

所得胶体金溶液封口，4℃保存备用。

3、胶体金标记最适合ph值的确定。

分别取1ml胶体金溶液，置于8只1.5mlep管中，其中一管为对照，其余7管分别加入0µl、2µl、4µl、6µl、8µl、10µl、12µl碳酸钾溶液，混匀后继续加入3µl1mg/ml的pag1单克隆抗体进行显色。目测ep管中溶液的颜色变化，加入10µl碳酸钾溶液的胶体金溶液稍变深而不显紫色，是最适宜的ph值。因此，选定在每ml胶体金溶液中加入10µl的碳酸钾溶液。

4、胶体金标记最小蛋白量的确定。

分别取1ml胶体金溶液置于8只1.5mlep管中，其中一管为对照，其余7管先加入10ml碳酸钾溶液，混匀后分别加入0µl、2µl、4µl、6µl、8µl、10µl、12µl的1mg/mlpag1单克隆抗体，混匀，加入100ml10%氯化钠溶液，静置观察颜色变化。溶液变蓝说明蛋白结合量过低。结果显示最小蛋白结合量可定为8µg/ml。

5、金标抗体溶液的配制。

取5ml胶体金溶液于离心管中，滴加50µl0.11mol/l碳酸钾溶液，混匀；吸取45µlpag1单克隆抗体缓慢滴入胶体金溶液，摇匀后静置5min。取100µl10%bsa溶液加入抗体标记后的胶体金溶液，混匀，静置5min。

金标抗体复合物在4℃下8000rpm离心30min，弃上清；用胶体金稀释液将沉淀稀释至原体积，4℃8000rpm离心30min，弃上清；胶体金稀释液将沉淀稀释至原体积的1/10，4℃保存备用。

6、胶体金试纸条的组装。

聚酯纤维膜置于喷金划膜仪工作台，纯化后的金标抗体以5µl/cm²均匀喷涂于聚酯纤维膜上，制成胶体金垫5，长度10cm，烘箱中干燥过夜，4℃保存。

将nc膜2固定在pvc底板1上，1.5mg/mlantipag1重组抗原和1.5mg/ml山羊抗鼠二抗分别作为检测线3(t线)和质控线4(c线)涂于nc膜2上，烘箱中干燥2h后，在装有干燥剂的铝箔袋中保存。

用移液枪将玻纤处理液均匀涂于玻璃纤维膜上，制成上样垫6，烘箱中干燥过夜后4℃保存。

依次将裁剪好的胶体金垫5、玻璃纤维膜上样垫6、吸水纸吸样垫7粘贴在固定有nc膜2的pvc底板1两侧，并分别用max膜条和绿色pe膜条固定nc膜2与胶体金垫5、nc膜2与吸样垫7的连接处，用裁条机将组装后的pvc底板1裁成4mm宽的试纸条。

实施例2。

向实施例1制备的试纸条的上样垫6滴加60µl的妊娠30d奶牛血清作为阳性血清，静置5min观察结果，同时用阴性样品进行测试，结果如图2所示。

图2中右侧的阳性血清检测结果显示t线和c线均明显显色，而左侧的阴性血清检测结果中t线不显色c线显色，实施例1试纸条检测结果灵敏、准确。