一种基于口蹄疫病毒3B表位蛋白的化学发光检测试剂盒的制作方法

本发明属于免疫学检测领域，具体涉及一种基于口蹄疫病毒3b表位蛋白的化学发光检测试剂盒。

背景技术：

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的危害偶蹄动物的一种急性、烈性、高度接触性传染病。目前，我国对于口蹄疫的防控主要实行普遍的疫苗免疫、血清学监测和扑杀政策。因此，从口蹄疫疫苗免疫过的动物中区分出感染的动物至关重要。对于口蹄疫的诊断来说一直存在一个挑战，存在于灭活疫苗中的非结构蛋白污染而造成的假阳性问题很难解决。这是由于口蹄疫的灭活疫苗是当前使用最为普遍的口蹄疫疫苗。在灭活疫苗的纯化过程中，非结构蛋白不会完全被除去。当动物被多次免疫口蹄疫灭活疫苗后，其机体内会出现不同程度的非结构蛋白抗体，从而给区分疫苗免疫动物与病毒感染动物带来了一定的困难。

申请号为201611052512.8的中国专利申请公开了“一种牛口蹄疫3abc抗体发光检测试剂盒”，其公开的技术方案中化学发光免疫分析板上包被的是3abc融合蛋白，但是因为在灭活疫苗中必然会存在3abc的相关成分，因此在多次免疫灭活疫苗后，健康动物的血清中就会出现一定程度的3abc抗体，从而引起检测的假阳性。申请号为201611051539.5的中国专利申请公开了“一种猪口蹄疫3abc和2c抗体化学发光检测试剂盒”，其公开的技术方案中化学发光反应板上混合包被3abc和2c蛋白，虽然能够区分疫苗免疫的猪与口蹄疫感染的猪，但检出率并不高，只有36.03%，而且不能避免会有假阳性。当前也存在利用非结构蛋白3b单克隆抗体检测口蹄疫病毒的情况，但大多采用全蛋白，除制备过程复杂耗费人力物力外，特异性并不高，检测结果假阳性较多，而且制备的检测试剂盒检测时间较长，一般都需要1-2h，无形中增加了时间成本。因此仍需开发新的检测抗原或检测方法来解决该问题。

技术实现要素：

面对上述难题，本发明的目的在于提供一种可区分口蹄疫病毒感染和免疫动物的化学发光免疫分析试剂盒，该试剂盒中的化学发光反应板混合包被3b非结构蛋白区域的两种表位蛋白3bepi1和3bepi2，首次建立了基于口蹄疫非结构表位蛋白的clia方法，该试剂盒能够较为准确地区分出口蹄疫病毒感染和疫苗免疫动物，尤其在免疫过5次灭活疫苗的动物检测中，准确率高达97.14%，且检测用时较短，在15分钟内即可完成检测。

一种基于口蹄疫病毒3b表位蛋白的化学发光检测试剂盒，包括化学发光反应板、酶标抗体、血清稀释液、化学发光底物和化学发光增强剂，其特征在于：所述化学发光反应板混合包被口蹄疫病毒3b非结构蛋白区域中的3bepi1和3bepi2两种表位蛋白。

进一步地，所述3bepi1和3bepi2两种表位蛋白均经基因获取、表达载体的构建、蛋白的表达和纯化制备而成，其中，在基因获取过程中，首先设计引物，然后各组引物直接退火形成分别编码3bepi1和3bepi2表位蛋白的双链dna分子。

更进一步地，所述引物的组成包括各表位序列和pre-nick限制性酶切位点；其中，编码3bepi1的双链dna的引物序列如seqidno：5和seqidno：6所示，编码3bepi2的双链dna的引物序列如seqidno：7和seqidno：8所示。

进一步地，所述3bepi1和3bepi2两种表位蛋白在化学发光反应板上的包被条件均为25ng/孔。

更进一步地，化学发光反应板的包被过程为：用碳酸盐缓冲液稀释含有3bepi1和3bepi2表位蛋白的混合液，使混合液中3bepi1和3bepi2的浓度均为250ng/ml；将混合液以100µl/孔加入到化学发光反应板上，于4℃过夜进行包被；然后以300µl/孔加入封闭液，于37℃作用2h即完成包被。

进一步地，所述酶标抗体为hrp标记的兔抗牛igg抗体；所述血清稀释液为pbs缓冲液，其中包含体积分数为0.1%的吐温和体积分数为1%的大肠杆菌裂解液；所述化学发光底物为0.1mmol/l的鲁米诺溶液；所述化学发光增强剂包含0.07mmol/l的ipp、3mmol/l的h2o2和体积分数为0.002%的tween。

本发明还提供一种利用上述化学发光检测试剂盒的检测方法，步骤为：将待检血清样品和标准阴阳性对照血清用血清稀释液稀释5-40倍，37℃作用5min，再用pbst洗涤，加入用血清稀释液稀释20000倍的hrp标记的兔抗牛igg抗体，37℃作用5min，经pbst漂洗后，加入化学发光底物和化学发光增强剂，5min后用化学发光免疫分析检测仪器检测发光值。

本发明的有益效果：

本发明所述化学发光检测试剂盒以3bepi1和3bepi2两种表位蛋白混合包被化学发光反应板，首次建立了基于口蹄疫非结构表位蛋白的clia方法，在检测感染或免疫动物的血清时具有较强的特异性和免疫原性，进而在相关试剂和检测方法的配合下，能够较为准确地区分出口蹄疫病毒感染动物和疫苗免疫动物，假阳性概率极低，尤其在免疫过5次灭活疫苗的动物检测中，准确率高达97.14%。而且，该试剂盒检测方法用时较短，在15分钟内即可完成检测，相对于常规试剂盒1-2h的检测时间，大大节约了时间成本，具有良好的应用前景。

本发明所用的3bepi1和3bepi2两种表位具有强烈的免疫原性，这两种表位可以在灭火疫苗的纯化过程中被除去，因此检测这些表位所产生的抗体就可完全区分口蹄疫病毒感染与免疫的动物；另外，3bepi1和3bepi2表位蛋白相对于全蛋白的制备，制备简单、较易获得，使用的引物由表位序列和限制性酶切位点组成，采用pre-nick技术，由引物直接退火形成pre-nick双链dna分子，之后将其连接到表达载体上构建原核表达系统制备表位蛋白并进行纯化，纯度较高，与其他小rna病毒科的病毒不具有交叉反应性，且与口蹄疫阳性牛血清反应较为强烈，具有良好的免疫反应性，对基于此制备区分口蹄疫感染和免疫的化学发光检测试剂盒提供了前提和条件。

附图说明

图1是3aepi1和3aepi2蛋白表达的电泳图；其中，m：蛋白分子量标准；1、3aepi1诱导后大肠杆菌裂解液；2、3aepi1诱导前大肠杆菌裂解液；3、3aepi2诱导后大肠杆菌裂解液；4、3aepi2诱导前大肠杆菌裂解液；

图2是3bepi1、3bepi2和3bepi3蛋白表达的电泳图；m:蛋白分子量标准；1、3bepi1诱导前大肠杆菌裂解液；2、3bepi1诱导后大肠杆菌裂解液；3、3bepi2诱导前大肠杆菌裂解液；4、3bepi2诱导后大肠杆菌裂解液；5、3bepi3诱导前大肠杆菌裂解液；6、3bepi3诱导后大肠杆菌裂解液；

图3是表位蛋白纯化的电泳图；其中：1、3aepi1；2、3aepi2；3、3bepi1；4、3bepi2；5、3bepi3；

图4是westernblot结果图；其中：1、3aepi1；2、3aepi2；3、3bepi1；4、3bepi2；5、3bepi3；

图5是本发明所述clia检测的指标优化分析图；其中，p是指阳性，n是指阴性；

图6是本发明所述检测方法的roc曲线图；

图7是本发明所述检测方法交互式点状图；其中，0代表阴性样品，1代表阳性样品。

具体实施方式

下面通过具体的案例对本发明作进一步的解释说明。

试验例1表位蛋白载体的构建、表达和纯化

现有研究表明，口蹄疫病毒非结构蛋白在口蹄疫病毒检测方面具有较好的反应，尤其是3a和3b蛋白，因此，本发明人以3a和3b为研究对象，首先根据位于3a与3b上的共五组表位，设计一系列的引物，这些引物的组成包括各表位序列与pre-nick限制性酶切位点。编码3aepi1的基因的上下有引物的核苷酸序列分别如seqidno：1和seqidno：2所示，编码3aepi2的上下游引物如seqidno：3和seqidno：4所示，编码3bepi1的如seqidno：5和seqidno：6所示，编码3bepi2的如seqidno：7和seqidno：8所示，编码3bepi3的如seqidno：9和seqidno：10所示。引物序列如下表1所示。

表1：各表位的引物核苷酸序列

所述引物均由上海生物工程公司合成。

表达载体的构建：将上述各组引物直接进行退火，形成带有酶切位点缺口的pre-nick双链dna分子。具体操作为：将100µmol/l的上游引物与100µmol/l的下游引物各10µl，去离子水70µl和10×t4连接酶的buffer10µl进行混合均匀，形成混合物。将该混合物置95℃水浴锅中反应5min，然后关掉水浴锅电源使其温度慢慢降为室温（约50min-60min）。此时该混合物就为带有酶切位点缺口的双链dna分子。可直接进行载体的连接。对pgex4t-1载体进行双酶切后，各组退火的pre-nick双链dna通过bamhⅰ和notⅰ限制性酶切位点连接到pgex4t-1载体上。经过酶切鉴定和测序正确后，将构建成功的五组表达载体进行后续的蛋白表达。

蛋白的表达：将测序正确的五组表达载体分别转化bl21（de3）大肠杆菌感受态细胞，在过夜培养的lab平板上挑取单克隆于5ml具有氨苄抗性的lb培养基中，37℃220rpm培养16h。然后，将该5ml菌液转接到500ml具有氨苄抗性的lb中，37℃220rpm培养3h后，待菌液的od600约为0.4-0.6时，加入终浓度为1mmol/l的iptg进行诱导表达。37℃220rpm诱导表达6h后，收集菌液沉淀。沉淀用20ml的1×gstbindingbuffer（4.3mmol/lna2hpo4；1.4mmol/lkh2po4；13.7mmol/lnacl；2.7mmol/lkcl；ph：7.3）重悬，置于冰浴中超声破菌15min，然后10000g离心30min分离上清与包涵体，进行sds-page电泳，如图1和2。结果表明，五株蛋白均以可溶性的形式表达。

蛋白的纯化：根据gst标签蛋白的纯化过程对五株蛋白进行纯化。简言之，2.5ml的gst树脂装入层析柱中，用5倍体积的1×gstbindingbuffer洗涤树脂后，将样品蛋白液加入层析柱中，并与树脂孵育30min。然后，用10倍体积的1×gstbindingbuffer洗涤树脂。最后用3倍体积的1×gstelutionbuffer（10mmol/l还原性谷胱甘肽溶于50mmol/ltris-hcl；ph：8.0）洗脱目的蛋白。sds-page电泳鉴定纯化效果，如图3。结果表明，五株蛋白具有很高的纯度。其中，3aepi1的氨基酸序列如seqidno：11所示，3aepi2的氨基酸序列如seqidno：12所示，3bepi1的氨基酸序列如seqidno：13所示，3bepi2的氨基酸序列如seqidno：14所示，3bepi3的氨基酸序列如seqidno：15所示。

westernblot鉴定五株蛋白的免疫反应性：将纯化好的五株蛋白电转到pvdf膜上，加入1：200倍稀释的口蹄疫病毒感染的阳性牛血清室温孵育1h。经过pbst漂洗后，加入1：2000倍稀释的hrp标记的兔抗牛的igg（sigma-aldrich）室温孵育1h。经过pbst漂洗后加入dab底物显色，如图4。结果表明，五株蛋白均与口蹄疫阳性牛血清反应强烈。间接elisa表明，3bepi1与3bepi2与口蹄疫牛阳性血清反应最为强烈。

因此，选择3bepi1与3bepi2两株蛋白制备化学发光检测试剂盒。

试验例2区分口蹄疫病毒感染与疫苗免疫动物的clia方法的优化与建立

利用棋盘滴定法确定抗原的包被浓度和血清稀释度。简言之，3bepi1与3bepi2的浓度分别稀释为200ng/孔、100ng/孔、50ng/孔、25ng/孔，然后将相同浓度的两个蛋白混合后4℃过夜包被。标准阴阳性血清分别做了1：5、1：10、1：20、1:40的稀释，如图5所示。最后综合考虑信噪比和p/n等因素，确定抗原包被条件为25ng/孔的3bepi1与25ng/孔的3bepi2，血清稀释度为1：5。

试验例3血清盘的建立

1、共106份样品采集于未免疫过口蹄疫疫苗的并且临床上健康的牛。经兰州兽医研究所开发的口蹄疫液相阻断elisa试剂盒检测结果表明，这些样品没有口蹄疫a、asia1、o型的结构蛋白抗体（抗体滴度<1:4）。这些样品用于确定该clia的临界值和诊断特异性。

2、共175份样品采集于免疫过4-5次口蹄疫灭活疫苗的并且临床上健康的牛。液相阻断elisa检测结果表明，这些样品的结构蛋白抗体效价在1：128-1：1024之间。这些样品用于确定该clia的临界值和诊断特异性。

3、共161份样品采集于口蹄疫爆发期间的具有典型口蹄疫症的牛，这些样品采集于2010年之前，并于-80℃存放。这些样品用于确定该clia的临界值和诊断敏感性。

4、应用二次攻毒的高感染滴度的牛血清作为标准对照阳性血清，该血清应用兰州兽医研究所开发的3abc单抗阻断elisa试剂盒的阻断率为98%。应用商品化的新生胎牛血清作为标准阴性对照血清。

5、共523份田间随机样品采集于口蹄疫可疑疫区，这些样品用于比较该clia方法同商品化试剂盒的符合率。

试验例4具体操作步骤的实施

用ph=9.6的碳酸盐缓冲液稀释含有3bepi1和3bepi2表位蛋白的混合液，使混合液中3bepi1和3bepi2的浓度均为250ng/ml；将混合液以每孔100µl包被到化学发光反应板上，于4℃过夜；然后以每孔300µl加入封闭液，于37℃作用2h即完成包被。然后每孔加入封闭液300µl并于37℃作用2h。加入1：5倍稀释的待检样品与标准阴阳性对照血清，所有样品用血清稀释液进行稀释37℃作用5min，pbst洗涤5次后，加入用血清稀释液稀释20000倍的hrp标记的兔抗牛的igg。37℃作用5min。经过pbst漂洗后，加入化学发光底物和化学发光增强剂，5min后用化学发光免疫分析检测仪器检测发光值。

其中，所述封闭液为pbs缓冲液，其中包含质量分数为5%的酪蛋白、体积分数为0.1%的吐温-20和体积分数为2%的马血清

所述血清稀释液为为pbs缓冲液，其中包含体积分数为0.1%的吐温-20和体积分数为1%的大肠杆菌裂解液；

所述化学发光底物为0.1mmol/l的鲁米诺溶液；

所述化学发光增强剂包含0.07mmol/l的4-(4’-iodo)-phenylphenol(ipp)、3mmol/l的h2o2和体积分数为0.002%的tween。

试验例5临界值的确定

根据上述步骤，对442份已知口蹄疫背景的血清进行检测。所有样品最终以阳性百分率表示（positivepercentpp），pp=（检测样品发光值-标准阴性样品发光值）*100%/（标准阳性样品发光值-标准阴性样品发光值）。应用medcacl软件做roc曲线分析，如图6、7和下表2所示。结果表明，当临界值为9.63%时，其诊断敏感性为90.06%，诊断特异性为96.44%。

表2：不同临界值所对应的诊断敏感性与诊断特异性

试验例6比较3bepi1-3bepi2-clia与3abcclia试剂盒以及国外进口的priocheck@nspelisa试剂盒的诊断特性

应用本发明制备的clia检测试剂盒与两种商品化elisa试剂盒对465份已知口蹄疫背景的牛血清和523份田间随机样品进行检测并比较三种方法的诊断特性。如下表3。对于未免疫的阴性血清来说，三种方法都具有较高的准确性分别为96.23%、95.28%和95.28%。对于疫苗免疫过的阴性血清，尤其是对于免疫过5次灭活疫苗的动物来说，该clia则显现出较强的优势，具有较高的准确性为97.14%，而两种商品化试剂盒的准确率只有85.71%和89.14%。但对于未免疫的

阳性血清来说，该clia方法具有相对较低的准确率为90.06%，而两种商品化试剂盒的准确率都较高为95.03%和96.89%。对于田间随机523份样品，3beip1-3bepi2clia与3abcclia试剂盒的符合率为87.38%，与进口elisa试剂盒的符合率为89.48%。因此，从以上数据可以看出，该基于表位蛋白的clia方法在诊断疫苗免疫过的动物中具有较高的准确性。

表3：比对试验结果表

因此，本发明所述基于口蹄疫病毒3b表位蛋白的化学发光检测试剂盒，相比于3abcclia试剂盒和其他市售试剂盒，最突出的优点在于可较准确的区分口蹄疫病毒感染动物和疫苗免疫动物。对于免疫过5次灭活疫苗的动物检测中，3abcclia与procheck@fmdvnspelisa试剂盒产生了较高的假阳性，而3bepi1-3bepi2clia仍具有很高的准确性。此外，该检测方法可在15min内完成检测。在实践中，可配合检测3abcclia方法，进一步确定动物的感染状态。从而更加准确的诊断口蹄疫。

需要说明的是，以上试验例仅为解释说明性的，本发明的保护范围以权利要求书为准。凡在本发明基础上所做的等同性的、无创造性付出的修改或替换，均在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>一种基于口蹄疫病毒3b表位蛋白的化学发光检测试剂盒

<130>1

<160>15

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>60

<212>dna

<213>人工合成

<400>1

gatcctagaattcaacgagtacatcgacaaagccaacatcaccacagatgacaagtaagc60

<210>2

<211>60

<212>dna

<213>人工合成

<400>2

gatcttaagttgctcatgtagctgtttcggttgtagtggtgtctactgttcattcgccgg60

<210>3

<211>60

<212>dna

<213>人工合成

<400>3

gatcctagaattcacagatgacaagactcttgacgaggcggaaaagaaccctctgtaagc60

<210>4

<211>60

<212>dna

<213>人工合成

<400>4

gatcttaagtgtctactgttctgagaactgctccgccttttcttgggagacattcgccgg60

<210>5

<211>60

<212>dna

<213>人工合成

<400>5

gatcctagaattcccactcgagcgtcagaaacctctgaaagtgagagccaagctctaagc60

<210>6

<211>60

<212>dna

<213>人工合成

<400>6

gatcttaagggtgagctcgcagtctttggagactttcactctcggttcgagattcgccgg60

<210>7

<211>60

<212>dna

<213>人工合成

<400>7

gatcctagaattcccgatggagagacagaaaccactgaaagtgaaagcaaaagcctaagc60

<210>8

<211>60

<212>dna

<213>人工合成

<400>8

gatcttaagggctacctctctgtctttggtgactttcactttcgttttcggattcgccgg60

<210>9

<211>60

<212>dna

<213>人工合成

<400>9

gatcctagaattcccggtgaagaaacctgtcgctttgaaagtgaaagcaaagaactaagc60

<210>10

<211>60

<212>dna

<213>人工合成

<400>10

gatcttaagggccacttctttggacagcgaaactttcactttcgtttcttgattcgccgg60

<210>11

<211>14

<212>prt

<213>大肠杆菌

<400>11

asnglutyrileasplysalaasnilethrthraspasplys

1510

<210>12

<211>14

<212>prt

<213>大肠杆菌

<400>12

thraspasplysthrleuaspglualaglulysasnproleu

1510

<210>13

<211>14

<212>prt

<213>大肠杆菌

<400>13

proleugluargglnlysproleulysvalargalalysleu

1510

<210>14

<211>14

<212>prt

<213>大肠杆菌

<400>14

prometgluargglnlysproleulysvallysalalysala

1510

<210>15

<211>14

<212>prt

<213>大肠杆菌

<400>15

provallyslysprovalalaleulysvallysalalysasn

1510