口蹄疫病毒重组病毒样粒子及其制备方法和应用与流程

本发明涉及口蹄疫病毒重组病毒样粒子及其制备方法和应用，属于基因工程疫苗领域。

背景技术：

口蹄疫(foot-and-mouthdisease,fmd)是由微rna病毒科口蹄疫病毒属的口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus,fmdv)所引起偶蹄动物以蹄、口、鼻等部位发生水疱为主要特征的一种急性、烈性传染病。该病对牛、猪、羊等主要畜种危害尤为严重，不仅能够引起感染动物的死亡，大大降低感染畜群的生产性能；还会对发生疫情的国家的国际动物及其制品贸易产生一定的负面影响，造成巨大的经济损失。国际动物卫生组织(oie)将fmd列为法定上报的动物疫病首位，我国也将其列于一类动物传染病。我国是fmd疫区，该病已成为危害我国养殖业最严重的动物疫病之一。

fmdv在含有七种血清型，分别为a、o、c、asia1、sat1、sat2和sat3。各个血清型fmdv生物学特性及发病特征相似，但各型间无交叉免疫反应。fmdv属于单股负链rna病毒，基因组全长约8.5kb，含有一个orf编码框，编码一个多聚蛋白。p1区结构蛋白在病毒自身蛋白酶3c的作用下裂解为vp0、vp3和vp1，该三种蛋白单体相互结合形成5s单体，并自动组装14s五聚体，12个五聚体进一步组装形成病毒衣壳。基因组rna与病毒衣壳作用促使vp0自催化裂解为vp4和vp2蛋白，形成完整成熟的病毒粒子。

疫苗免疫是fmd的重要手段，其中，传统疫苗灭活疫苗在现阶段fmd防疫中发挥重要的作用。随着疫苗学和病毒结构生物学等领域的不断发展，新型疫苗开发研究是国内外一致关注的热点领域。病毒样颗粒(viruslikeparticles,vlps)疫苗是由一种或多种病毒结构蛋白组装成的空衣壳结构，形态上与真正的病毒粒子相似。vlps不含有病毒基因组，在宿主体内无法进行复制，不具有感染性。vlps类似天然病毒粒子结构的特性，使其保留了大部分病毒的特异性抗原表位，也能够模拟病毒对宿主感染过程，有效的刺激机体产生高水平的免疫应答，是潜在安全的候选疫苗。目前，多种商品化vlps疫苗应用于市场，如pcv-2，ev-71等。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种口蹄疫病毒样粒子的构建方法及其在制备疫苗中的应用。

基于上述发明目的，本发明提供了一种用于制备重组口蹄疫病毒样粒子的dna分子组合物，包括o型口蹄疫vp0基因、o型口蹄疫vp1基因和o型口蹄疫vp3基因；其中，o型口蹄疫vp0基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示；o型口蹄疫vp1基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示；o型口蹄疫vp3基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示。

进一步的，所述的用于制备重组口蹄疫病毒样粒子的dna分子组合物，由所述o型口蹄疫vp0基因、所述o型口蹄疫vp1基因和所述o型口蹄疫vp3基因和绿色荧光蛋白egfp基因组成，其中，绿色荧光蛋白egfp基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示。

上述含有所述dna分子组合物的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒也属于本发明的保护范围。

所述重组载体按照下述步骤构建：

1)将o型口蹄疫vp0基因插入到pfbdm载体的ecori和xbai酶识别位点之间，得到插入了o型口蹄疫vp0基因的重组载体，命名为pfbdm-vp0；将o型口蹄疫vp1基因插入到pfbdm-vp0的smai和kpni酶识别位点之间，得到插入了o型口蹄疫vp0基因和o型口蹄疫vp1基因的重组载体，命名为pfbdm-vp0/vp1；

2)将绿色荧光蛋白egfp基因插入到pfbdm载体的ecori和xbai酶识别位点之间，得到插入了绿色荧光蛋白egfp基因的重组载体，命名为pfbdm-egfp；将o型口蹄疫vp3基因插入到pfbdm-egfp的smai和kpni酶识别位点之间，得到插入了绿色荧光蛋白egfp基因和o型口蹄疫vp3基因的重组载体，命名为pfbdm-egfp/vp1；

3)将pfbdm-vp0/vp1质粒经spei/nrui酶切得到的大片段，与经过avrii/pmei酶切的pfbdm-egfp/vp3质粒产生的小片段连接，得到插入o型口蹄疫vp0、vp1基因、vp3基因和egfp基因的重组质粒，命名为pfbdm-vp0/vp1/vp3/egfp，即上述的含有所述dna分子组合物的重组载体。

上述重组载体的构建过程中，根据o/mya98p1段序列和绿色荧光蛋白egfp基因序列，设计用于扩增fmdv结构蛋白基因vp0、vp1、vp3和egfp的引物，设计的引物也在本发明保护范围内。

所述o型口蹄疫vp0基因是以o型口蹄疫o/mya98株基因组cdna为模板，以引物vp0f和vp0r扩增获得；o型口蹄疫vp1基因是以o型口蹄疫o/mya98株基因组cdna为模板，以引物vp1f和vp1r扩增获得；o型口蹄疫vp3基因是以o型口蹄疫o/mya98株基因组cdna为模板，以引物vp3f和vp3r扩增获得；绿色荧光蛋白egfp基因是以pegfp-n1为模板，以引物egfpf和egfpr扩增获得；引物序列如下所示：

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本发明的又一个目的是提供一种制备重组口蹄疫病毒样粒子的方法，包括以下步骤：

1)将所述的dna分子组合物通过重组载体转化dh10bac感受态细胞，通过筛选鉴定，得到重组杆状病毒表达质粒；

2)步骤1)获得的重组杆状病毒表达质粒转染sf9细胞，经培养传代3次，细胞培养冻融处理3次，离心，过滤除菌后，获得重组杆状病毒。

所述重组载体优选为上述的重组载体。

上述的方法制备得到的重组病毒样颗粒。

本发明的再一目的是保护一种重组口蹄疫病毒样粒子，所述重组口蹄疫病毒样粒子是由所述的dna分子组合物中的组分共同组装表达的。

更进一步的，所述重组口蹄疫病毒样粒子是按照上述的方法制备得到的重组杆状病毒样颗粒。

本发明还要求保护一种预防和/或治疗口蹄疫感染的疫苗，其活性成分为所述的重组口蹄疫病毒样粒子。

所述的重组口蹄疫病毒样粒子在制备预防和/或治疗口蹄疫感染的疫苗中的应用也属于本发明的保护范围。

关于fmdvvlps研究方面，研究人员尝试通过痘病毒载体、腺病毒载体、杆状病毒载体及大肠杆菌载体等系统建立fmdvvlps的模型。其中，杆状病毒系统在fmdvvlps的开发及应用中具有其他载体系统无可比拟的优势。

基于上述的技术方案，本发明的口蹄疫病毒重组病毒样粒子，利用fmdv结构蛋白vp0、vp3和vp1自组装成口蹄疫病毒重组病毒样粒子(fmdvvlps)的特性，改良fmdvvlps杆状病毒重组载体的构建方法，并在载体中加入了绿色荧光蛋白标记，通过pfbdmbac-to-bac系统成功制备出fmdvvlps，提供了一种优异的基因工程疫苗。

本发明的另一个进步在于解决3c蛋白的细胞毒性问题及vlps组装效率低下的问题。由于3c蛋白酶的细胞毒性及p1蛋白不能切割完全，这些在昆虫细胞表达的重组蛋白组装效率及产量普遍偏低。构建能够同时表达vp0、vp1和vp3三种衣壳蛋白的重组杆状病毒，有效的避免了之前杆状病毒系统表达fmdvvlps研究中3c蛋白酶的细胞毒性问题和p1基因切割不完全造成vlps组装效率低下的问题。

本发明还解决细胞病变的可观察性不强方面的问题。杆状病毒的感染滴度、感染复数、感染时间等参数的确定是制约杆状病毒系统大规模生产的主要因素。其中，杆状病毒的滴度的确定是其扩大应用的基础。实验室通常通过噬斑试验和tcid50试验确定病毒的滴度，由于杆状病毒感染时细胞病变可观察性对操作人员具有一定的要求，具有较大的不可控性。本发明在构建重组fmdv衣壳蛋白杆状病毒时加入了绿色荧光标签egfp蛋白，可通过细胞在荧光显微镜下是否能够表达egfp来确定是否存在病毒的感染，能够很好的解决细胞病变的可观察性不强方面的问题。此外，egfp蛋白不参与fmdvvp0、vp1和vp3三种衣壳蛋白自组装vlps生物过程，在后续vlps纯化过程中可通过相应的策略有效的去除，对后续的应用无影响。

试验证明，本发明病毒样颗粒rbac-fluofmdv感染sf9细胞过程中能够表达fmdv的衣壳蛋白vp0、vp1和vp3，初步纯化的病毒样颗粒rbac-fluofmdv样品负染后进行透射电镜观察，可见其直径大小为25～30nm病毒样颗粒，并且中间发亮，表明rbac-fluofmdv感染sf9细胞过程中表达的vp0、vp1和vp3衣壳蛋白能够组装成vlps。以tcid50方法检测rbac-fluofmdvp3代病毒滴度为10^-7.5/0.1ml。

附图说明

图1：o型fmdvvp0、vp1、vp3及egfp基因的克隆；1:dl5000dnamaker；2:egfp基因；3：vp0基因；4：vp1基因；5：vp3基因。

图2a：vp0、vp1、vp3片段的克隆流程示意图。

图2b：egfp片段的克隆流程示意图。

图3：重组质粒构建示意图。

图4：rbac-fluofmdvp3感染sf9细胞绿色荧光的观察。

图5：rbac-fluofmdv感染sf9细胞重组蛋白的表达的westernblot检测；

1:sf9细胞正常组；2:rbac-fluofmdvp2代感染的sf9细胞培养物；3：rbac-fluofmdvp3代感染的sf9细胞培养物；4：蛋白maker。

图6：sf9细胞感染表达rbac-fluofmdvvlps电镜图片。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1重组载体pfbdm-vp0/vp1/vp3/egfp的构建

以o/mya98/xj/2010株基因组cdna为模板(o/mya98/xj/2010株基因组cdna可由市售的含有o/mya98/xj/2010株的口蹄疫o型灭活疫苗中提取rna经反转录获得)，分别设计相应的引物(见表1)。以引物vp0f和vp0r扩增获得o型口蹄疫vp0基因，该片段长909bp，测序表明，其核苷酸序列为序列表中序列1所示。以引物vp1f和vp1r扩增获得o型口蹄疫vp1基因，该片段长639bp，测序表明，其核苷酸序列为序列表中序列2所示。以引物vp3f和vp3r扩增获得o型口蹄疫vp3基因，该片段长660bp，测序表明，其核苷酸序列为序列表中序列3所示。上述扩增的示意图请见图2a,扩增产物的电泳图请见图1。

pegfp-n1质粒本实验室保存，以pegfp-n1为模板，根据egfp基因序列，设计相应的引物(见表1)，以引物egfpf和egfpr扩增获得绿色荧光蛋白egfp基因，片段长度为720bp，测序表明，其核苷酸序列为序列表中序列4所示。上述扩增的示意图请见图2b,扩增产物的电泳图请见图1。

表1.各片段的扩增引物

分别将扩增得到的o型口蹄疫vp0基因和绿色荧光蛋白egfp基因片段经ecori/xbai酶切消化后得到的片段，与经过相同的限制性内切酶酶切的pfbdm载体(普如汀生物技术(北京)有限公司)连接，将连接产物转化e.colidh10b感受态细胞，涂布含有氨苄青霉素的lb平板，37℃过夜培养。挑取平板上的单菌落，在含有氨苄青霉素的液体lb培养基中培养6h，分别利用表1中vp0和egfp的克隆引物进行菌液pcr鉴定，阳性菌落送生工测序。将测序正确的菌液以1:500加入到新鲜的含有氨苄抗生素的lb培养基中，培养过夜，提取质粒，即得到插入o型口蹄疫vp0基因的重组质粒阳性克隆和插入绿色荧光蛋白egfp基因的重组质粒阳性克隆，将测序表明插入了o型口蹄疫vp0基因的重组质粒命名为pfbdm-vp0，将测序表明插入绿色荧光蛋白egfp基因的重组质粒命名为pfbdm-egfp。保存备用。上述重组质粒构建示意图见图3。

进一步将扩增得到的vp1基因和vp3基因片段经smai/kpni酶切消化后得到的片段，分别与经过相同的限制性内切酶酶切的pfbdm-vp0和pfbdm-egfp重组载体连接，将连接产物转化e.colidh10b感受态细胞，涂布含有氨苄青霉素的lb平板，37℃过夜培养。挑取平板上的单菌落，在含有氨苄青霉素的液体lb培养基中培养6h，分别利用表1中vp1和vp3的克隆引物进行菌液pcr鉴定，阳性菌落送生工测序。将测序正确的菌液以1:500加入到新鲜的含有氨苄抗生素的lb培养基中，培养过夜，提取质粒，即分别得到插入o型口蹄疫vp0和vp1基因的重组质粒阳性克隆、和插入vp3基因和egfp基因的重组质粒阳性克隆。将测序表明插入o型口蹄疫vp0和vp1基因的重组质粒命名为pfbdm-vp0/vp1；将测序表明插入vp3基因和egfp基因的重组质粒命名为pfbdm-egfp/vp3。将重组质粒保存备用，上述重组质粒构建示意图见图3。

将提取的pfbdm-vp0/vp1质粒经spei/nrui酶切消化后得到的大片段，与经过avrii/pmei酶切的pfbdm-egfp/vp3质粒产生的小片段连接，将连接产物转化e.colidh10b感受态细胞，涂布含有氨苄青霉素的lb平板，37℃过夜培养。挑取平板上的单菌落，在含有氨苄青霉素的液体lb培养基中培养6h，分别利用表1中vp1和vp2的克隆引物进行菌液pcr鉴定，阳性菌落送生工测序。将测序正确的菌液以1:500加入到新鲜的含有氨苄抗生素的lb培养基中，培养过夜，提取质粒，即得到插入o型口蹄疫vp0、vp1基因、vp3基因和egfp基因的重组质粒阳性克隆，将该测序正确的插入o型口蹄疫vp0、vp1基因、vp3基因和egfp基因的重组质粒命名为pfbdm-vp0/vp1/vp3/egfp。将重组质粒保存备用，其构建示意图见图3。

实施例2重组杆状病毒rbac-fluofmdv的制备

将pfbdm-vp0/vp1/vp3/egfp重组质粒转化dh10bac感受态细胞，在含有四环霉素和卡那霉素的液体lb培养基中培养4h，涂布含有庆大霉素、四环霉素和卡那霉素的lb平板，通过两轮蓝白斑筛选，挑取白色菌落，用m13f/vp1f和vp0f/m13r引物对(m13f/r引物是根据invitrogen公司bac-to-bac说明书提供的序列合成)，进行菌液pcr检测鉴定，扩大培养正确菌株，提取重组杆状病毒表达质粒，将其命名为bacmid-vp0/vp1/vp3/egfp，保存备用。

将对数生长期的sf9细胞铺于六孔板，重组杆状病毒表达质粒bacmid-vp0/vp1/vp3/egfpdna按照转染试剂lipofectamine3000的转染方法要求，进行稀释，与转染试剂混合，转染sf9细胞。27℃恒温培养箱中培养96h，收集细胞培养上清，经8000rpm离心5min，收集上清，经过滤除菌后，获得重组杆状病毒p0代病毒，保存备用，将该重组杆状病毒命名为rbac-fluofmdv。

实施例3重组杆状病毒rbac-fluofmdv的扩增与毒价测定

将rbac-fluofmdvp0代病毒按照病毒与培养基1/10(v/v)比例接种处于对数生长期的sf9细胞，27℃恒温培养箱中培养96h，收集细胞培养上清，经8000rpm离心5min，收集上清，获得p1代病毒。以p1代病毒进行扩增得到p2代，以p2病毒进行扩增得到p3代。以tcid50方法检测rbac-fluofmdvp3代病毒滴度为10^-7.5/0.1ml。

实施例4重组蛋白在昆虫细胞sf9中的表达及鉴定

将对数生长期的sf9细胞铺于六孔板，接种代及p3代rbac-fluofmdv病毒，感染后60h，利用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白egfp表达的情况。结果如图4所示，重组杆状病毒能够大量表达绿色荧光蛋白，而未感染重组病毒的sf9细胞对照组无绿色荧光，说明绿色荧光蛋白获得了成功的表达。

为进一步鉴定fmdv各结构蛋白的表达情况，将p2代及p3代细胞样品进行westernblot分析，以o型fmdv猪多抗血清作为一抗，hrp标记羊抗猪igg为上海生工公司产品。用ecl显色试剂盒显色，使用化学发光曝光显色。结果如图5所示，与猪抗o型fmdv高免血清发生特异性反应的条带与fmdv衣壳蛋白vp0(约33kd)、vp1和vp3(约24kd)分子量大小相符，表明rbac-fluofmdv感染sf9细胞过程中能够表达fmdv的衣壳蛋白vp0、vp1和vp3。

实施例5病毒样颗粒的大量制备

将合适密度的sf9细胞接种于摇瓶中，27℃110rpm恒温培养箱中振荡培养，待其密度达到2×10⁶cells/ml，以moi为5接种p3代重组杆状病毒rbac-fluofmdv，27℃110rpm恒温培养箱中振荡培养72h，离心收集细胞沉淀，用1/20体积的ph8.0的pbs重悬细胞，与-80℃和室温反复冻融3次，12000g离心10min，收集上清，即为初始病毒样颗粒溶液。

实施例6病毒样颗粒的初步纯化

将实施例5中获得的病毒样颗粒溶液用0.22μm的滤膜过滤，取上清溶液做30％蔗糖垫层处理，35000g离心3.5小时，用1/10体积的pbs重悬，保存备用。

实施例7病毒样颗粒的鉴定

实施例6初步纯化的病毒样颗粒样品负染后进行透射电镜观察，结果如图6所示，可见其直径大小为25～30nm病毒样颗粒，并且中间发亮，表明rbac-fluofmdv感染sf9细胞过程中表达的vp0、vp1和vp3衣壳蛋白能够组装成vlps。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

序列表

<110>中牧实业股份有限公司

<120>口蹄疫病毒重组病毒样粒子及其制备方法和应用

<130>whoi170046

<160>4

<210>1

<211>909

<212>dna

<213>

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