一种口蹄疫病毒2c3abc重组蛋白及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种蛋白质及其制备方法和应用，特别涉及一种口蹄疫病毒2C3ABC 重组蛋白及其制备方法和应用，属于医药生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫（Foot-and-mouthdisease，FMD)是偶蹄类动物高度传染且严重影响全球 经济、贸易的疾病，其病原为口蹄疫病毒（Foot-and-mouthdiseasevirus，FMDV)，属于小 核糖核酸病毒科的口蹄疫病毒属，目前发现已经有7个血清型0、A、C、AsiaI、SAT1、SAT2、 SAT3。在亚洲、非洲、南美洲都有流行，包括中国、东南亚、中国台湾等地。中国大陆在过去 的50年，主要流行0、AsiaI、A型口蹄疫。
[0003] FMDV为单链线状RNA，大约有8500个核苷酸组成。基因组由5'端非编码区 (Untranslationregion，UTR)、开放阅读框（Openreadingfragment，0RF)和 3'-UTR及 Poly(A)组成。ORF由L基因、Pl结构蛋白基因、P2和P3非结构蛋白基因以及起始密码子 和终止密码子组成，长约6. 5kb，共同编码一多聚蛋白。多聚蛋白经3次裂解后，形成3~ 4种病毒结构蛋白（VP0或VP4、VP2、VP3、VP1)，8种非结构蛋白（L、2A、2B、2C、3A、3B、3C和 3D) 〇
[0004] 除发达国家外，在FMD流行的大多数发展中国家和地区需要进行疫苗的接种来控 制该病的流行。因此区分FMD自然感染和免疫动物是FMD预防的一项重要内容。目前FMD弱毒疫苗已经停止使用，而灭活疫苗的生产工艺都将非结构蛋白除去。动物接种灭活疫苗 后主要产生FMDV结构蛋白抗体，很少产生非结构蛋白抗体；而自然感染动物即产生结构蛋 白抗体，也产生非结构蛋白抗体。所以，FMD非结构蛋白作为抗原检测动物体内NSP抗体，是 一种很好的区分自然感染动物和疫苗免疫动物生物诊断方法。在病毒复制、表达，急性或感 染口蹄疫病毒的动物体内有非结构蛋白（NSP)抗体存在。高度纯化的灭活口蹄疫疫苗除去 了细胞蛋白和病毒非结构蛋白，免疫后产生结构蛋白抗体。在FMDV感染动物中存在口蹄疫 非结构蛋白抗体，各血清型病毒有共同非结构蛋白，高度保守，动物口蹄疫非结构蛋白3AB 或3ABC或2C、3C等NSP抗体是口蹄疫病毒感染动物的标志。因此检测抗口蹄疫病毒非结 构蛋白抗体可区别动物免疫和感染。在近几年，用血清学方法检测口蹄疫病毒非结构蛋白 抗体评估动物中口蹄疫的病毒流行，包括胶体珠血凝法、酶联免疫吸附转移斑点法、多重发 光法，这些方法需要在实验室用不同的仪器和设备，限制了这些方法在田间的使用，延长了 口蹄疫防控应对和诊断的时间。目前，口蹄疫结构蛋白3ABC和2C3AB为诊断抗原，研制了 多种血清学诊断试剂，用于活的家畜以及产品贸易管理，以及口蹄疫疾病检测。
【发明内容】
[0005] 口蹄疫在亚洲、非洲、南美洲一些国家流行，经常在暴露于FMDV的动物中流行， 控制和根除口蹄疫需要可区分免疫动物和感染动物，口蹄疫非结构蛋白3ABC抗原是可靠 的诊断标志抗原，但3ABC基因在昆虫等真核细胞表达往往产生截断的3ABC多肽，如3AB、 3C、3A。针对以上问题，本发明采用全长完整的不被酶解的突变2C3ABC多肽为抗原，突变 2C3ABC多肽，克隆到质粒PBV220,转化大肠杆菌DH5a、实现高水平大量表达。mu2C3ABC以 包涵体形式表达于细胞质中，经分离、变性、复性、CM阳离子交换层析、DEAE阴离子交换层 析、S-300分子筛层析纯化。以此高度纯化完整全长、分子量为72kDa多肽为抗原，检测口 蹄疫病毒试验性感染猪和自然没有感染猪的灵敏度分别为98. 4%和100%，检测自然没有 感染猪、疫苗免疫猪的特异性分别为100%和98%。和商用试剂盒Ceditest和UBI比较， 有高度一致性，K= 0. 823 (p〈0. 05)，可用于区别感染动物和免疫动物。
[0006] 为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0007] -种突变的口蹄疫病毒2C3ABC重组蛋白，其特征在于，在原始口蹄疫病毒3C蛋白 酶基因的基础上进行了以下位点的突变：Cysl42 -Ser，Cysl63 -Gly。
[0008] 在本发明中，优选的，所述的口蹄疫病毒的血清型为国内流行的0型。
[0009] 在本发明中，优选的，所述的口蹄疫病毒3C蛋白酶基因来源于猪、牛、羊以及骆驼 的口蹄疫病毒。
[0010] 进一步的，本发明提供了所述的突变的口蹄疫病毒2C3ABC重组蛋白的制备方法， 其特征在于，包括以下步骤：
[0011] (1)合成口蹄疫病毒非结构蛋白2C3ABC基因，基因合成后，插入到PGEM-T克隆质 粒；
[0012] (2)以口蹄疫病毒全长2C3ABC蛋白基因为模板，采用PCR方法进行口蹄疫病毒3C 蛋白酶基因Cysl42 -Ser，Cysl63 -Gly的突变，突变后产物连接到pGEM-Teasy克隆质 粒上，连接产物转化大肠杆菌，挑选阳性克隆，酶切和测序正确后，再将突变后产物克隆到 表达载体PBV220,克隆产物转化大肠杆菌，挑选阳性克隆，酶切和测序正确后，获得重组质 粒PBV220-mu2C3ABC;
[0013] (3)将含有重组质粒PBV220-mu2C3ABC的大肠杆菌接种到含氨苄青霉素的LB培养 液中，以225rpm转速30°C培养10小时，然后按照体积比1:100转接到含氨苄青霉素的LB 培养液中，225rpm转速30°C培养10小时，即为发酵种子液，将发酵种子液体积比1:100~ 1:1000转接到发酵培养基中，30°C培养4小时后，升温到42°C诱导培养4~5小时，获得大 肠杆菌培养液；
[0014] (4)重组蛋白2C3ABC提取和纯化
[0015] a重组蛋白2C3ABC提取
[0016] 将步骤（3)得到的大肠杆菌培养液离心收集细胞，收集到的细胞加入裂解液重 悬，用超声仪在冰浴中破碎细胞壁，超声破碎后在4°C以10,OOOg离心20分钟分离上清和沉 淀，沉淀用变性溶解缓冲液重悬，离心取上清，上清液进行透析，透析平衡后用含0. 5%二巯 基乙醇的复性液稀释，获得重组蛋白2C3ABC的粗制溶液；
[0017] 其中，所述的裂解液含有 50mMTris,IOOmMNaCl, 0? 1 %TritonX以及 0? 2mM EDTA，pH7.2 ;
[0018] 所述的变性溶解缓冲液含有50mMNaH2PO4, 300mMNaCl以及8M尿素，pH8. 0 ;
[0019] 所述的复性液含有 50mMNaH2POjPIOOmMNaCl,pH7. 2 ;
[0020] b重组蛋白2C3ABC纯化
[0021]将重组蛋白2C3ABC的粗制溶液依次经CM-S印haroseFF阳离子交换层析、 DEAE-SepharoseFF阴离子交换层析和Sephcryl-400HR分子筛复性纯化，洗脱收集蛋白峰， 洗脱液用PBS缓冲液透析，透析液用截留值30kDa的滤器浓缩备用，测定重组蛋白2C3ABC 的分子量、纯度、含量和活性。
[0022] 在本发明中，优选的，步骤（1)所述的合成口蹄疫病毒全长2C3ABC蛋白基因的引 物为SEQIDNO:1和SEQIDNO:4所示；步骤⑵所述的PCR方法中的引物为SEQIDNO: I-SEQIDNO:6 所示。
[0023] 2C3ABC在细胞或动物体内自行裂解为2C、3A、3B、3C(pro)，在大肠杆菌中表达自 然的2C3ABC或多为包涵体，且蛋白多肽被截短。本发明对自然的2C3ABC基因142和163 半胱氨酸残基定点突变为色氨酸和甘氨酸，阻止了蛋白酶活性克服了细胞内酶解2C3ABC， mu2C3ABC与试验性感染FMDV猪血清反应强烈，与疫苗免疫猪血清的反应微弱。表明本发明 克服了 3C(pro)的蛋白酶活性获得完整的mu2C3ABC蛋白。
[0024] 更进一步的，本发明提供了所述的突变的口蹄疫病毒2C3ABC重组蛋白在制备抗 口蹄疫病毒非结构蛋白2C3ABC抗体中的应用。以及
[0025] 所述的突变的口蹄疫病毒2C3ABC重组蛋白在制备检测口蹄疫病毒非结构蛋白 2C3ABC抗体试剂中的应用。
[0026] 在本发明中，优选的，采用层析条检测动物血清中口蹄疫病毒非结构蛋白2C3ABC 抗体。
[0027] 在本发明中，优选的，采用便携式扫描仪对层析条的颜色密度进行分析，进而得到 动物血清中口蹄疫病毒非结构蛋白2C3ABC抗体的浓度。
[0028] 本发明公开的层析条能在猪感染早期检测到猪感染口蹄疫病毒，在猪感染口蹄疫 病毒8天就能测出3ABC抗体，在猪感染后10-34天测定90%猪为阳性，灵敏度与商用试剂 盒Ceditest和UBI的相当，但优于CHEKIT试剂盒，猪感染0天、2天血清用层析条检测阳性， 中和试验和ELISA法检测确证为假阳性。本发明的免疫层析条检测FMDV感染猪的灵敏性为 96. 8%，检测未感染猪的特异性为100%，对疫苗免疫猪的检测特异性为98. 8%。对6个猪 水泡炎病毒血清样品检测阴性，更加显示了层析条的检测特异性，和商用试剂盒Ceditest 和UBI性能相当。
[0029] 层析条可立时检测、既能定性又能定量，在1小时内获得动物待检血清的检测结 果，适合实验室和田间大量样本的筛选、处理、快速检测，适合养殖场和农场使用，可缩短检 测和应对爆发流行的时间，