一种原核细胞表达类病毒颗粒的纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种原核细胞例如大肠杆菌表达的类病毒颗粒的纯化方法。具体的， 本发明涉及一种大肠杆菌表达乙肝病毒表面抗原或核心抗原类病毒颗粒的纯化方法。
【背景技术】
[0002] 类病毒颗粒或者病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs)是含有某种病毒的一 个或多个结构蛋白的空心颗粒，没有病毒核酸，不能自主复制，在形态上与真正病毒粒子相 同或相似，俗称伪病毒。
[0003] 近年来发现多数病毒的衣壳蛋白基因在真核表达系统以及少数病毒的衣壳蛋白 基因在原核表达系统中都能够有效地实现自我组装。这为病毒的基础研究及疫苗的开发提 供了便利条件。由于VLPs没有感染性，作为免疫原，它可通过和病毒感染一样的途径呈递 给免疫细胞，有效地诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应。因此，本领域中需要一种优化 的大肠杆菌表达的类病毒颗粒的制备和纯化方法，尤其需要一种可用于大规模生产的低成 本纯化方法。
[0004] 乙肝病毒（HBV)属于嗜肝DNA病毒（Hepadnaviridae)科，是导致人类肝炎疾 病的主要致病因素，每年约有450万人感染HBV，其中四分之一的人发展成肝病，每年 约导致 60 多万人死亡（A.R.Zanetti, P. van Damme，D.Shouval, The global impact of vaccinationagainst hepatitis B: a historical overview, Vaccine26 (2008)6266 - 6273. )。HBV主要由外层外膜蛋白表面抗原（HBsAg)，以及内层包裹病毒基因组DNA 和病毒聚合酶的核心抗原（HBcAg)组成（M.Nassal，H. Schaller, Hepatitis B virus replication, Trends Microbiol. 1 (1993) 221 - 228)。在 HBV 感染的病人体内，最显著的特 征之一是产生较高滴度的针对HBcAg的IgM或者IgG抗体（G. Hess, W. Arnold, The clinical relevance of the antibody to hepatitis B coreantigen(anti-HBc) :a review, J. Virol. Methods2 (1980) 107 - 117. )。HBcAg可以自发组装成类病毒颗粒（VLP)，并且在乙 肝病人体内诱导T细胞依赖型以及T细胞非依赖型两种强烈的B细胞、T细胞以及细胞 毒 T 细胞反应（D. R. Milich, A. McLachlan, The nucleocapsid of hepatitis B virus is both aT-cel1-independent and a T-cel1-dependent antigen, Science234 (1986) 1398 -1401)，因此可以应用于预防性或者治疗性乙肝疫苗和乙肝病人感染检测试剂盒的开发 (P. Pumpens, R. Ulrich, K. Sasnauskas, A. Kazaks, V. Ose, E. Grens, Constructionof novel vaccines on the basis of the virus-like particles. Hepatitis B virusproteins as vaccine carriers,in:Y.Khudyakov(Ed. ), Medicinal ProteinEngineering, CRC Press, 2008, pp. 205 - 248. )〇
[0005] HBcAg可以自发形成类病毒颗粒，也是目前研究较多的VLP载体，其可作为外源蛋 白表位的蛋白载体，同时携带多拷贝插入的表位，引起针对外源表位的强烈体液免疫以及 细胞免疫效应（P. Pumpens, E. Grens, Determination of the fold of the core proteinof hepatitis B virus by electron cryomicroscopy, FEBS Lett. 442 (1) (1999) 1 - 6.), 低温冷冻电镜以及X-ray衍射表明HBcAg通过二聚体组装成T=3或者T=4的颗粒，分别 包含180或者240个拷贝的单体，直径为28nm。由单体组装成二聚体，然后将由2个a 螺旋组成的具有免疫优势的表位刺突展示在VLP的表面（B. BcTttcher，S. A. Wynne，R. A. Crowther, Determination of the foldof the core protein of hepatitis B virus by electron cryomicroscopy，Nature386 (6) (1997)88 - 91.)。
[0006] HBcAg全长183个氨基酸，其中150-183位氨基酸富集碱性精氨酸，不参与VLP 的组装，具有结合核酸的作用（M.Nassel, The arginine-rich domain of the hepatitis B virus core protein is required for pregenomeencapsidation and productive viralpositive-strand DNA synthesis but not for virus assembly, J. Virol.66 (7) (1992) 107 - 4116.)。有研究表明在大肠杆菌中表达HBcAg，C端150-183位氨基酸可以 非特异性结合宿主RNA，从而有助于HBcAg作为佐剂时的免疫原性（P. Riedl，D. Stober，C. Oehninger,K.Melber, J. Reimann, R. Schirmbeck, Priming Thlimmunity to viral core particles is facilitatedy trace amounts of RNA bound to its arginine-rich domain, J. Immunol. 168(2002)4951 - 4959.)。也有研究认为，HBcAg 可以刺激 TLR2 通路的 免疫细胞因子的分泌，而这种效应可能由于其内部包裹的核酸导致（P. Vanlandschoot, F. Van Houtte, P. Ulrichts, J. Tavernier, G. Leroux-Roels, Immunostimulatory potential of hepatitis B nucleocapsidpreparations:lipopolysaccharide contamination should not beoverlooked，J. Gen. Virol. 86 (Pt2) (2005) 323 - 331)。
[0007] HBcAg在乙肝诊断试剂开发与预防性或治疗性乙肝疫苗的研究中的作用 越来越被重视，从上世纪70年代末期开始，全长或者截短的HBcAg已经在大肠杆 菌、酵母、昆虫系统中得到过表达（Nature282, 575-579 (06Decemberl979) ; doi : 10. 1 038/282575a0, Hepatitis B virus genes and their expression in E. coliMARK PASEK ；Nature296, 677-678(15Apri11982)Electron microscopy of hepatitis B core antigen synthesized in E. coliB. . C0HEN&J. E. RICHMOND R.E.Lanford,L. Notvall, Virologyl76 (1990) 222.)，但由于其制备工艺原因，得到的HBcAg在纯度和残余 物质等方面很难达到药典的质量标准要求，因此，有必要开发出一种成本低廉、适合大规模 放大生产且能够达到药典规定标准的制备及纯化工艺。
【发明内容】
[0008] 在一个方面，本发明提供了一种原核细胞例如大肠杆菌表达的类病毒颗粒的纯化 方法，其特征在于，所述纯化方法包括沉淀步骤、第一层析步骤、第二层析步骤、浓缩步骤和 第三层析步骤，其中所述沉淀步骤包括硫酸铵沉淀步骤，所述第一层析步骤包括分子筛层 析步骤，所述第二层析步骤包括羟基磷灰石层析，所述浓缩步骤包括超滤浓缩步骤以及所