抗人高分子脂联素的单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫学和生物技术领域，设及一种用于特异性识别人高分子脂联素的 单克隆抗体及其应用，更具体地，设及利用该单克隆抗体制备的人高分子脂联素酶联免疫 吸附分析巧LISA)试剂盒及其大批量检测样本的临床应用。
【背景技术】
[0002] 脂联素（adiponectin)是由apMl基因编码，在脂肪细胞中特异表达的分泌性 蛋白，其单体由244个氨基酸残基构成，分子量约28KDa，结构上属于胶原蛋白超家族， 与TNF和补体Clq相似。脂联素因具有改善膜岛素敏感性、抗糖尿病、抗动脉粥样硬化、 抗炎和抑癌等重要的保护性生理功能而广受关注。脂联素分泌到血中W同源S聚体，二 硫键依赖的六聚体W及12-18或更高聚合形式的高分子存在，其中=聚体65kD为低分子 量（low molecular wei曲t,LMW)脂联素，六聚体 150kD 为中分子量（middle molecular wei曲t, MMW)脂联素，12-18及更高聚体形式为高分子量（hi曲molecular wei曲t, HMW， 280-420kD或更高）脂联素，WHMW形式居多。研究显示脂联素不同聚合形式在不同的组 织通过不同受体亚型发挥不同的生理功能，高分子形式可能更具有保护效应。已知脂联素 改善膜岛素敏感性作用主要依赖于HMW形式，运动减重导致膜岛素敏感性改善亦主要与增 加HMW脂联素水平有关；抗糖尿病药物唾挫烧二酬类衍生物改善膜岛素抵抗的作用与增加 HMW密切相关。脂联素对屯、血管的保护作用也主要依赖HMW形式，只有HMW才能激活NF-KB 转录因子，HMW减少与冠屯、疾病发病更相关。内脏脂肪堆积导致的脂联素分泌失调，特别是 HMW减少是连接肥胖与T2DM、代谢综合征W及屯、血管疾病的发生、发展分子基础。增加HMW 脂联素水平亦成为代谢综合征关联药物开发的新祀点。因此，特异性检测高分子脂联素对 于揭示上述相关疾病的发病机制、新药祀的筛选W及相关疾病的早期预测、疗效监测和预 后判断都有重要价值。
[0003] 然而，要特异性地从含有各种形式聚合体的生物标本中只检测高分子脂联素，基 于常规抗体的免疫分析方法面临挑战。主要因为HMW是由脂联素单体W =聚体为基本骨架 聚合而来的，不同形式的聚合体虽然聚合的脂联素单体数目不等，但都含有相同的脂联素 单体结构，也就含有单体分子上相同的抗原表位，因此常规采用原核细胞表达的脂联素单 体作为免疫原制备的抗体，都或多或少与各种形式的多聚体具有交叉反应。
[0004] 为了克服其他分子形式的干扰，目前检测HMW的免疫分析方法大都需要将样本进 行复杂的预处理，即先将样本经柱层析分离，或者先用特异的蛋白酶裂解小分子保留HMW， 再使用与各种形式聚合体都有交叉反应的脂联素抗体建立的总脂联素免疫分析法检测；可 见操作繁琐，不适用检测大批量标本。因此当前的发展趋势是制备特异性针对HMW形式的 脂联素单克隆抗体用于构建免疫分析方法直接检测高分子脂联素。目前虽有进口试剂盒推 出，但价格昂贵，难W进行大批量的推广应用。此外，除血液标本外，包括尿液、唾液、关节 液、乳汁等生物标本都有脂联素的存在，是否也具有检测HMW的临床价值尚缺乏应用证据。
【发明内容】
[0005] 因此，为解决现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种可特异性针对人高分子 脂联素的单克隆抗体，和一种操作简便、成本低、可特异性检测高分子脂联的化ISA试剂 盒。并通过在肥胖、糖尿病等疾病患者的血清、血浆等生物样本中大批量的检测应用，获得 可供临床推广应用的参考经验。
[0006] 一方面，本发明提供一种保藏号为CGMCC No. 9567的杂交瘤细胞株8A8 (分类命 名；人脂联素单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏日期；2014年08月18日，保藏号为CGMCC No. 9567,保藏地；中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，地址；北京市朝阳区 北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编；100101)。
[0007] 另一方面，本发明提供一种抗人高分子脂联素单克隆抗体A22,由保藏号为CGMCC No. 9567的杂交瘤细胞株8A8产生。
[000引本发明的抗人高分子脂联素单克隆抗体通过W下步骤制备：
[0009] 1)提取人血液高分子脂联素制备免疫原；
[0010] 2)制备抗人高分子脂联素的单克隆抗体杂交瘤细胞株；
[0011] 3)将杂交瘤的克隆化及扩大培养；
[0012] 4)大量生产、纯化和鉴定单克隆抗体。
[0013] 再一方面，本发明提供一种使用本发明的抗人高分子脂联素单克隆抗体在生物 样本中定量和/或定性检测人高分子脂联素中的应用，优选地，所述人高分子脂联素为 12-18聚体或更高分子量的形式。优选地，所述生物样本为血清/浆、唾液、脑脊液、关节液、 乳汁W及组织细胞提取液或细胞培养上清等含有脂联素的生物学液体样本。所述检测的方 法为半定量的非变性凝胶电泳免疫印迹法或定量的化ISA法但不限于化ISA。
[0014] 优选地，所述方法为化ISA方法，该方法包括W下步骤：
[0015] (1)将待测样品与负载本发明的抗人高分子脂联素单克隆抗体的固体载体相接 触；
[0016] (2)加入生物素标记的抗人高分子脂联素单克隆抗体；
[0017] (3)加入酶标亲和素，检测被结合的检测标记。
[0018] 在上述方法中，待测样品可W为血清/浆、唾液、脑脊液、关节液、乳汁W及组织细 胞提取液或细胞培养上清等含有脂联素的生物学液体样本。
[0019] 优选地，上述方法包括如下步骤；先W系列包含已知浓度的高分子脂联素溶液替 代待测样品重复步骤（1)至（3)，绘制标准曲线；再W待测样品重复步骤（1)至（3)，并根据 标准曲线得出待测样品中高分子脂联素的浓度。
[0020] 本发明还提供了一种人高分子脂联素的检测试剂盒，所述试剂盒中包含本发明所 述的抗人高分子脂联素单克隆抗体作为有效成分，优选地，所述检测试剂盒为化ISA试剂 盒，更优选地，所述化ISA试剂盒中的化ISA采用同一抗体的夹屯、非竞争结合模式，进一步 优选地，所述化ISA中引入BA放大系统。
[0021] 优选地，所述ELISA试剂盒包括；
[0022] 用于捕获待测样品中的抗人高分子脂联素单克隆抗体；
[0023] 生物素标记的抗人高分子脂联素单克隆抗体；
[0024] 系列包含已知浓度的人高分子脂联素的溶液；
[0025] 酶标亲和素；
[0026] 检测酶标亲和素的工具。
[0027] 优选地，所述试剂盒还包括包被液、磯酸盐缓冲液、阻断液、洗漆液、抗体稀释液、 酶结合物稀释液、底物应用液和/或终止液。
[002引再另一方面，本发明提供一种人高分子脂联素检测试剂盒在临床样品检测中的应 用，优选地，所述临床检测为大批量检测，更优选地，所述检测的样本为生物学液体样本，优 选选自血清/浆、唾液、脑脊液、关节液、乳汁W及组织细胞提取液或细胞培养上清。
[0029] 另一方面，本发明提供一种检测人高分子脂联素的试剂盒的制备方法，包括W下 步骤：
[0030] 1)制备实验用液；
[0031] 2)制备曲柳脂联素标准品；
[0032] 3)制备酶标板固相抗体W及生物素标记的检测抗体。
[0033] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0034] 本发明的单克隆抗体特异性强，只选择性识别高分子形式的脂联素。本发明的 ELISA试剂盒重复性好，稳定性强，并且作为关键试剂的固相抗体和标记抗体均采用本发明 的同一种的单克隆抗体，成本降低，特异性更强，该单克隆抗体可大批量重复生产，可持续 发展优势明显。本发明的检测人高分子脂联素的试剂盒无需预处理分离样本，简便快捷，便 于大批量样品的测定。
【附图说明】
[0035] W下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0036] 图1为使用本发明的单克隆抗体进行非变性聚丙締酷胺凝胶（native-PAG巧电泳 免疫印迹检测生物样本中的人高分子脂联素的电泳图；
[0037] 其中，
[003引 la为使用本发明的单克隆抗体A22检测人血清中的人高分子脂联素；
[0039] 化为对照，使用另一针对总脂联素的单克隆抗体C63检测人血清；
[0040] Ic为使用本发明单克隆抗体A22检测唾液、关节液和脂肪细胞培养上清中的人