一种粒细胞样髓源性抑制细胞来源exosomes及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种粒细胞样髓源性抑制细胞来源exosomes及其应用，属细胞生物学、分子生物学领域及临床应用领域，具体涉及荷瘤小鼠脾脏分离的G-MDSC exo的制备、生物学功能研究及其在小鼠自身免疫性疾病治疗中的应用。
【背景技术】
[0002]骨髓来源的抑制性细胞(myeloid-derivedsuppressor cells, MDSCs)是一群骨髓来源的异质性细胞，在肿瘤、炎症及病原体感染等病理情况下大量扩增(GabrilovichDIj Nagaraj S.Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immunesystem.Nat Rev Immunol.2009; 9 (3): 162-74.)。小鼠的 MDSCs 是 Gr_l (由 Ly6G和Ly6C组成)和⑶Ilb双阳性的细胞，按细胞形态及Ly6G、Ly6C表达量高低，可分为CDllb+Ly6G+Ly6Cl0W 粒细胞样 MDSCs (G-MDSCs)和 CDllb+Ly6GTy6Chi单核细胞样 MDSCs(M-MDSCs)两个亚型。在肿瘤及感染等疾病状态下，G-MDSCs和M-MDSCs均会扩增，而G-MDSCs明显多于M-MDSCs。G-MDSCs主要通过表达精氨酸酶I (arginase l，Arg_l)和活性氧(reactive oxygen species, R0S)抑制T细胞介导的适应性免疫应答和自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)、巨噬细胞介导的天然抗肿瘤免疫应答。研究表明MDSCs也可以通过干扰素 g (interferon g, INF_g)和白细胞介素 10 (interlenkin 10, IL-10)依赖的途径诱导Treg细胞分化从而下调效应性T细胞的功能。近年来相关研究表明MDSCs在自身免疫性疾病的治疗方面有巨大的潜能。因此，人们对MDSCs的治疗价值有了新的认识，已有实验利用MDSCs治疗小鼠胶原诱导性关节炎(collagen-1nduced arthritis, CIA),并取得一定疗效。但是，由于MDSCs来源不足、储存不便及成分复杂等缺点限制了其应用。
[0003]自身免疫性疾病是因机体免疫系统对自身成分发生免疫应答而导致的疾病，在人群中有较高的发病率。炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)包括溃瘍性结肠炎(ulcerative colitis, UC)和克罗恩病(Crohn，s disease, CD),主要是由于机体对本处于耐受状态的正常菌群发生异常免疫应答所致的非特异性炎性肠道疾病，该病临床表现为腹痛、腹湾、黏液脓血便，病久可发生癌变。类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种临床常见系统性自身免疫性疾病，临床主要表现为对称性小关节病变，以多关节持续性炎症为特征。大量研究表明促炎性细胞Thl和Thl7及其来源的炎症因子在自身免疫性疾病发生发展过程中发挥重要作用。Treg细胞在维持肠道机体免疫稳定等方面发挥重要作用，Treg细胞作用失衡往往是自身免疫学疾病发生的原因之一，并且研究证实自身免疫性疾病患者体内Treg细胞比正常人低。近年来自身免疫性疾病在我国的发病率呈上升趋势，针对该类疾病，临床上主要以对症治疗为主，尚没有一种行之有效的治疗手段，因此迫切需要探索一种从根本上治愈的方法。
[0004]Exosomes是细胞内多胞体与质膜融合后释放到细胞外环境中的一种膜性囊泡。研究表明几乎所有的活细胞都能分泌exosomes,并且其广泛存在于各种体液中(BeninsonLA, M.Fleshner.Exosomes: an emerging factor in stress-1nducedimmunomodul at1n [J].Semin Immunol, 2014.26(5): 394-401.)。exosomes 携带来源细胞的蛋白质、mRNA及miRNA等成分，使之不易受外界环境降解，利于相关活性成分发挥生物学功能。通过巨胞饮作用，脂质筏和受体介导的内吞作用等方式，exosomes被受体细胞内化，内化的exosomes可以调控受体细胞的多种生物学功能，在细胞间交流过程中发挥重要作用。exosomes在免疫应答、凋亡、血管生成、炎症反应及肿瘤发生发展等过程中的作用均有报道。研究显示对疾病进行干预时，exosomes比其来源细胞更有优势。利用树突状细胞来源的exosomes治疗肿瘤的报道较多，并显示出良好疗效(Pitt JM, Charrier M,Viaud S，et al.Dendritic cell-derived exosomes as immunotherapies in the fightagainst cancer [J].J Immunol, 2014; 193 (3): 1006-11.)。但是有关 G-MDSC exo 的功能研究，以及在自身免疫性疾病中的应用尚未见报道。
[0005]我们发现G-MDSC exo直径为40_100nm，携带生物活性成分，与G-MDSC分泌的其他囊泡相比，G-MDSC exo的生物学特性更清晰。G-MDSC exo能抑制⑶4+T细胞增殖并减轻DTH小鼠足垫肿胀程度，并且能促进TGF-β诱导的⑶4+ T细胞向Treg细胞扩增。体内应用G-MDSC exo能减缓小鼠迟发型超敏反应(DTH)、IBD和CIA的病情，并进一步证实，并且这种作用一定程度上依赖于G-MDSC exo携带的Arg-1。
[0006]近年来有关exosomes在疾病治疗方面的研究多集中在树突状细胞和干细胞来源的exosomes上。疾病治疗方面,相对于来源细胞,exosomes具有更容易保存和运输,本身无细胞毒性，应用时生物安全问题较少等优点；并且exosomes表面的复合分子为其靶向特定组织及微环境提供潜在的归巢机制(田新瑞，徐文蜻，牛勃，等.神经干细胞来源Exosomes制备及在神经系统疾病中的应用:中国，CN103740645 A[P].2014-04-23.);exosomes对治疗性的蛋白质和核酸还具有保护作用，减少降解(Marcus ME, Leonard JN.FedExosomes:Engineering Therapeutic B1logical Nanoparticles that Truly Deliver [J].Pharmaceuticals (Basel)，2013，6(5):659-680.)D G-MDSC exo 在疾病治疗中的应用尚未见报道。我们实验发现G-MDSC exo在低温条件下能长期保持，并且生物学活性不受影响；
G-MDSC exo既具有与G-MDSC类似的抑制⑶4+ T细胞增殖的作用，又能促进TGF- β诱导的⑶4+ T细胞向Treg细胞扩增。G-MDSC exo是一种天然免疫调节剂，对自身免疫性疾病的治疗具有重要意义，在临床上具有较好的应用价值。
[0007]依据G-MDSC exo的结构和功能特性，将其应用于自身免疫性疾病的治疗，可达到“低投入、高产出”的目的，具有良好的临床应用前景，有望在维持机体免疫平衡方面发挥积极作用，为自身免疫性疾病的治疗提供一种全新的治疗途径。
【发明内容】
[0008]本发明为克服现有技术中存在的不足，提供一种G-MDSCs来源的exosomes,该exosomes具有G-MDSCs的非特异性成分和G-MDSCs内特殊的蛋白质和核酸等活性物质,是一种亚细胞结构的复合信息体；其既具有G-MDSCs所具备的免疫抑制特性又包含有自身表面分子CD63 ;并观察其在自身免疫性疾病治疗中的作用，以期寻求从根本上治疗疾病的方法。
[0009]本发明中的G-MDSC exo是含有来源细胞胞膜脂质成分的膜性囊泡，对其携带的生物活性成分具有保护作用；G-MDSC exo可发挥类似G-MDSCs的免疫抑制功能，并且具有细胞本身所不具备的众多优点，是细胞间信息传递的亚细胞结构信息复合体。
[0010]本发明公开了一种简便的制备来源于肿瘤个体或自身免疫性疾病个体G-MDSCexo的方法，整个过程耗时短，产量高，并且证实其易于保存且生物活性不受影响，为进行治疗目的规模生产化生产G-MDSC exo奠定基础。即构建荷瘤小鼠模型或者自身免疫性疾病(如CIA)模型，分离脾脏G-MDSCs，收集培养上清；联合使用超速离心与微孔滤膜法，分离提取 G-MDSC exoο
[0011]其具体步骤如下:
将收集的G-MDSCs培养悬液于4°C离心后收集上清，重复三次，将收集到的上清转移