专利名称：鸡胆汁来源的胞外体提取方法及其在免疫学上的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学，具体涉及一种从鸡胆汁中提取的胞外体的方法及其在免疫学上的应用。
背景技术：
胞外体,又称“外源体” (Exosomes),是一种来源于晚期内涵体的直径20_170nm的小囊泡。1987年，Johnstone研究网织红细胞最后成熟为红细胞的实验中，将在体外培养的绵羊的网织红细胞释放的小囊泡命名为胞外体。1996年Raposo等发现B细胞分泌的胞外体能诱导抗原特异性T淋巴细胞反应，Zitvogel等用树突状细胞来源胞外体成功诱导CD8+T淋巴细胞发挥很强的抗肿瘤效应，近年来研究者对胞外体的免疫作用给予了高度的关注，成为非细胞性肿瘤疫苗研究的热点。胞外体的来源及特征除了网织红细胞以外，多种细胞均分泌胞外体，如B细胞(Raposo G，1996)、肥大细胞(Skokos D，2001)、不成熟树突状细胞(ne) (Thery C，2001)、血小板、纤维母细胞、上皮细胞(Wolfers J，2001)、肿瘤细胞、T淋巴细胞(Blanchard N，2002)等。各种细胞来源的胞外体的分子组成不尽相同，但一般而言，不同类型细胞分泌的胞外体大小均在20-170nm，浮力密度为I. 12-1. 21g/mL (Smalheiser，2007)，主要含有以下几种物质主要组织相容复合物 I (major histocompatibility complex I ,MHC I )类和 / 或II类分子、热休克蛋白、整合素、四跨膜蛋白、细胞骨架蛋白以及一些生物酶类。在胞外体的发现之初，人们认为胞外体的作用只是在红细胞成熟中移除无用的蛋白，但现在看来它的功能更加复杂。每种胞外体的生物学功能与其来源密切相关。在大量研究的基础上发现，胞外体的主要作用包括以下几个方面移除无用蛋白；作为细胞间交流的媒介；诱导免疫耐受；在免疫调节中发挥重要作用，包括免疫激活或免疫抑制。胞外体作为自体成分，有易吸收，无排斥反应等优点，目前作为多种肿瘤药物的载体应用于肿瘤治疗的研究中。胆汁中的胞外体胆汁是在胆道中流动的一种特殊的体液，由肝脏分泌产生。胆汁的生成过程非常复杂，胆汁由约75%肝细胞生成，25%由胆管细胞和胆囊上皮细胞生成，。胆汁有两大作用，一是作为消化液，帮助脂肪在肠内的消化和吸收；二是将某些代谢产物从肝脏排出。鸡胆汁是一种资源丰富、作用广泛、价格低廉的天然中药。鸡胆汁性味苦寒，无毒，具有清热解毒、止咳平喘、消炎、利胆明目等功能。胆汁中的胞外体，是由肝细胞、上皮细胞分泌和释放后汇集于胆囊的蛋白囊泡，最终释放到小肠内。由于表面携带有大量的抗原肽和淋巴细胞共刺激因子等，在机体内，胆汁中的胞外体对维持肠道免疫系统的稳态和肝脏免疫反应起着重要作用。胞外体作为自体成分，有易吸收，无排斥反应等优点，目前作为多种肿瘤药物的载体应用于肿瘤治疗的研究中。胆汁中的胞外体可以定向作用于肝脏和肠道，可以作为治疗肝脏和肠道疾病的重要工具。现阶段的研究与应用前景目前，鼠类上进行的胞外体的应用实验取得了丰富的研究成果，并为人药研究提供了很好的参考。在人医方面，成熟树突状细胞分泌胞外体由于其可以有效诱导免疫激活反应在其基础上研究的药物已进入二期临床阶段；胞外体作为载体的制备和应用在我国已于2005年申请专利(CN200510082604)。禽源胆汁胞外体的研究在国内外未见报道。但是禽源胆汁来源丰富、作用广泛、价格低廉，具有清热解毒、止咳平喘、消炎、利胆明目等功能，在我国中医学列入天然中药。鸡胆汁中的胞外体如果应用于禽的肿瘤性疾病的治疗中，可能能够改变肿瘤性疾病一旦感染就必须淘汰的现状，这将是养禽业的福音；作为抗应激药物，可以有效防止长途运输等由于应激造成的胃肠道疾病，将为养殖业挽回大量损失。再者，鸡常作为肿瘤、动脉粥样硬代的动物模型，禽源胆汁的研究成果对于人医很高的参考价值。
发明内容
为了提高鸡胆汁中胞外体的提取效率，以及扩展胞外体在免疫学上的应用，本发明的发明人提供了一种新的由鸡肝脏、胆囊和胆管上皮细胞分泌和释放的胞外体，且公开了其制备的方法，该胞外体中含有C-反应蛋白(C-reactive protein)、天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase)、玻连蛋白(Vitronectin)等肝源性的蛋白成分,上皮细胞源性的粘蛋白(Mucin)以及免疫球蛋白(Immunoglobulin)等免疫反应相关蛋白，可以作为研究肝脏疾病的生物指标以及作为免疫反应佐剂，参与免疫调节，还可以作为载体，应用于治疗肝脏、胆囊和肠道疾病的治疗。
本发明提供胞外体具有典型杯状结构的双层脂质膜，含有肝源性的蛋白成分，所述的肝源性的蛋白成分为C-反应蛋白或天冬氨酸氨基转移酶或玻连蛋白或其混合物；所述的胞外体是胆汁中正常存在的成分，由肝脏(约占75%)、胆管和胆囊上皮细胞(约占25%) 分泌和释放。且该胆汁为各个品系的肉鸡、蛋鸡等禽类均可获得的胆汁。本发明的发明人对禽源胞外体蛋白组分的研究发现，其表面携带有多种独特蛋白，其中的C-反应蛋白，由肝细胞产生，是急性期反应蛋白，作为炎症反应的标志具有重要意义；玻连蛋白，其表达的差异常作为判断肝细胞癌的标准，表明禽源胞外体可以作为判定；粘蛋白由上皮细胞产生，起到润滑及细胞信号的传导等多种功能，可以形成化学屏障； 大量免疫球蛋白的存在，说明了胞外体在免疫应答信息传递中具有重要作用。所获得的胞外体直径在30-150nm，质量密度范围为I. 13-1. 19g/cm3。该胞外体表面上呈递有MHC I分子或可与MHC I分子结合的抗原肽，或带有淋巴细胞共刺激分子，或上述物质共存。其中上述的MHC I分子在免疫反应中具有正相关性，较之以往都是呈现MHC II 相关性具有显著不同，因此在免疫学应用上有着全新的突破。制备上述胞外体的方法，具体步骤如下将从健康鸡胆囊离体4h内抽取的胆汁，在4°C低温条件下经逐级离心去细胞碎片取上清，经滤膜过滤，4°C 110, OOOg离心2h沉淀用PBS重悬，然后4°C 110, OOOg离心90min 后用PBS溶解沉淀，即为提取的胞外体。其中所述的逐级离心为1000 2000g 15 20min，3000 4000g 20 30min， 7000 8000g 45 50min，10000 15000g 40 60min。更进一步的优选釆用逐级离心为2000gl5min，4000g30min,8000g45min, 15000g 60mino
为了达到更好的效果,所述经过4°C 110, OOOg离心90min后的沉淀通过30wt%、45wt%、60wt%的鹿糖溶液进行密度梯度离心,这样就可以进一步的分离出胞外体,提高胞外体的均一度。具体方法为现有技术，可以采用在一个离心管中通过现有技术形成3层密度不同度的鹿糖梯度，从下到上依次是60wt%、45wt%、30wt%,最上层是样品沉淀,经离心后样品层分离，渗入到其密度所在层，实现依密度的不同的分离。采用上述分级离心与过滤相结合的制备方法，可以有效去除胆汁中的残渣及大分子物质，较单一的离心或过滤的方法，更为可行。存在以下优越性
I.提取过程耗时短，易于保持胞外体的生物活性，形态保持良好，均一度较高。2.胞外体的产量高，Iml胆汁可以分离到兰14 g胞外体。除此之外，经过本发明所采用的分级离心和过滤后的产品其大小均匀度较低一些，可能含有一些多胞体，主要包括大囊泡或者包裹囊泡(MVB)，其内部可能含有多个胞外体个体，为了将上述的多胞体进一步出去，而达到我们要求的标准30-150nm单个囊泡，发明人又适时的进行了密度梯度离心，从而确保最终获得的胞外体的均一度。通过上述方法获得的胞外体，除了具备正常的胞外体功能外，还具有下述的作用，可以在免疫学和药物学上有更好的应用该种胞外体所携带的的特殊蛋白的变化可以作为研究肝脏疾病的生物指标。所述胞外体表面含有C-反应蛋白和天冬氨酸氨基转移酶等蛋白。C-反应蛋白由肝细胞合成,是第一个被认为是急性时相反应蛋白，在急性创伤和感染时其血浓度急剧升高。天冬氨酸氨基转移酶是肝功能检查中的一项，一般用来来检验肝组织是否受损。因此，胞外体上所携带的特殊蛋白的成分变化可以作为肝脏生理功能变化的标志用来检测肝脏疾病。该种胞外体可以在体内外免疫反应中的应用。通过研究发现，胆汁中的胞外体可以特异性的刺激⑶4+T淋巴细胞的增值，并且呈现MHC I正相关性。⑶4+T能够促进其他T细胞亚群的成熟与B细胞产生抗体，因此,胆汁中的胞外体可以通过使CD4+T的增值作用激活体内外的免疫反应。或者作为免疫反应佐剂，参与免疫调节，作为抗应激类药物的应用。所述胞外体还可以作为载体，应用于治疗肝脏、胆囊和肠道疾病，特别是肿瘤性疾病的治疗。胆汁中的胞外体作为自体成分，具有易吸收、无排斥等的优点；因其双层脂质膜结构可以保护药物，减少有效成分丢失；胆汁中的胞外体定向作用于肝脏或肠淋巴细胞，这种特殊的靶向作用使药物可以定向作用。此外，胆汁中的外源体的含量高(14y g/ml以上)，均一度好，作为药物载体具有良好的应用前景。综上所述，本发明提供了鸡肝细胞和上皮细胞分泌和释放的胞外体的提取方法，且公开了其制备的方法及其应用，为胞外体的进一步研究及其在免疫学和药物学上的应用提供了新的前景和技术启示。
图I为鸡胆汁胞外体的透射电镜照片；图中箭头所示鸡胆汁胞外体形态为直径30_150nm的具有典型杯状结构的小囊泡；图2为SPF鸡肝脏超薄切片照片；
图中A箭头所示为肝脏狄氏腔内的胞外体；图中B箭头所示为肝脏小胆管中的胞外体；图中C箭头所示为肝细胞内的多胞体以及分泌出的胞外体；图中D所示为胆管微绒毛，箭头所示为胆管微绒毛上皮细胞胞外体的分泌释放， 由微绒毛边缘有胞外体分泌出；图3为鸡胆汁中胞外体的SDS-PAGE结果以及高效液相纯化图；图中A所示为鸡胆汁中胞外体的SDS-PAGE结果；图中B所示为鸡胆汁中胞外体的高效液相纯化图；图4为质谱分析鉴定胆汁胞外体的主要蛋白种类列表；
图5为磁珠检测鸡胆汁中胞外体的表面标志(MHC I /MHC II)流式细胞图；图中，胆汁中的胞外体只连接磁珠表现为图A，95. 42%的胞外体呈现MHC I相关， 仅有3. 78%表现出MHC II相关，因此，胆汁中的胞外体主要携带MHC I相关分子；图6为鸡胆汁中胞外体接种肝脏白细胞的流式细胞图；图中A为流式细胞分析的结果，统计分析后可知在适当时间和适宜的剂量下，胆汁中的胞外体对肝脏CD4+T细胞的分化具有明显的激活作用(如B所示)，并呈现MHC I相关性(如C所示)，可见本发明所提供的胞外体具有明显的CD4+T增殖作用。图7为鸡胆汁中胞外体接种脾脏、胸腺白细胞的结果，由图可知鸡胆汁中胞外体接种脾脏、胸腺细胞增殖的作用不显著，(统计结果如图 7A&B所示)，而加入胞外体可以提高脾脏⑶4+T、⑶8+T以及单核细胞和MHC I类细胞的存活率，延长细胞的存活时间(如图7C&D所示)，可见本发明所提供的胞外体具有明显的提高细胞的存活率和延长存活时间的作用。
具体实施例方式下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例I、鸡胆汁中胞外体的分离纯化I.鸡胆汁中胞外体的提取从SPF鸡胆囊离体4h内抽取胆汁，与PBS缓冲液等量混勻，在4°C低温条件下经2000g离心15min, 4000g离心30min, 8000g离心45min, 15000g离心60min,除去细胞碎片,取上清经滤膜过滤(依次通过双层滤纸,5 μ m滤膜，I. 2 μ m滤膜， O. 22 μ m滤膜)，4°C 110，OOOg离心2h，沉淀用PBS重悬，然后4°C 110，OOOg离心90min后用 PBS溶解沉淀，即为提取的胞外体。该方法中，4°C 110, OOOg离心90min后的沉淀可以进一步通过30wt%、45wt%、60wt% 蔗糖溶液进行密度梯度离心进一步分离，提高胞外体的均一度。具体方法为采用在一个离心管中通过现有技术形成3层密度不同度的蔗糖梯度，从下到上依次是60wt%、45wt%、 30wt%，最上层是样品沉淀，经离心后样品层分离，渗入到其密度所在层，即可实现依密度的不同的分离。2.蛋白定量(BCA法)采用BCA蛋白浓度测定试剂盒按50体积BCA试剂A加I 体积BCA试剂B (50 I)配制适量BCA工作液，充分混匀；完全溶解蛋白标准品，取10 μ L 用PBS稀释至100 μ L,使终浓度为O. 5mg/mL ;将标准品按0、1、2、4、8、12、16和20 μ L加到96孔板的标准品孔中,加标准品稀释液补足到20 μ L ;加10 μ L胞外体样品到96孔板的样品空中，加标准品稀释液到20ii L ;各孔加入200 ii L BCA工作液，37°C放置30min ;测定A562nm波长，根据标准曲线计算出胞外体浓缩液的蛋白浓度。 鸡胆汁中的胞外体的蛋白含量约为14ii g/ml以上。实施例2、鸡胆汁中胞外体的鉴定I.胞外体形态观察取10 L胞外体原液于载样铜网上，于室温静置Imin ;用滤纸从侧面吸干液体，滴加1%醋酸双氧铀约10 ii L于铜网上,室温负染Imin ;用滤纸吸干负染液，四蒸水洗漆一次，在白炽灯下烤干，于透射电镜下观察、照相。如图IA飞中所示，鸡胆汁中的胞外体形态为直径30_150nm的具有典型杯状结构
的小囊泡。2.胞外体分泌和释放的观察(I)样品处理取SPF鸡离体Imin内的肝脏组织，修剪成ImmX ImmX 2mm大小的长条。(2)前固定将肝脏组织取出后立即置于预冷的2. 5%戊二醛中固定4h以上，0. lmol/L磷酸缓冲液清洗3次，IOmin/次。(3)后固定1%锇酸固定lh，0. lmol/L磷酸缓冲液清洗2次，IOmin/次。(4)脱水采用梯度乙醇脱水法，浓度为50%、70%、90%、95%、100%，再用I : I液即100%无水丙酮100%无水乙醇脱水2次,标本在每级浓度内停留时间15 20min。(5)浸透与包埋梯度浸透法，用环氧树脂Epon812和815混合包埋剂与丙酮I : 1、2 : I浓度浸透样品，每种浓度内2h，随着时间的延长，丙酮逐渐挥发，包埋剂纯度增力口。然后再将肝脏组织纵向包埋入纯包埋剂中，温箱中聚合37°C 12h，60°C 24h。(6)定位用Leica_UC6型超薄切片机半薄切片,厚I 2 ii m,经甲苯胺蓝染色约IOs,普通显微镜下观察定位。(7)超薄切片及染色选用超薄切片机切片，切片速度25mm/s，厚度70 80nm，用100目带膜铜网捞取4 5张大的切片，再经醋酸双氧铀枸橼酸铅双重染色，即可在电镜下观察。图2中A箭头所示为肝脏狄氏腔内的胞外体；图2中B箭头所示为肝脏小胆管中的胞外体；图2中C箭头所示为肝细胞内的多胞体以及分泌出的胞外体；图2中D所示为胆管微绒毛，箭头所示为胆管微绒毛上皮细胞胞外体的分泌释放，由微绒毛边缘有胞外体分泌出；3. SDS-PAGE 电泳取胞外体悬液10 U L,加入10 ii L2X上样缓冲液，100°C煮沸3min，上样于120g/L的聚丙烯酰胺分离胶，电泳结束后行考马斯亮兰染色，脱色后拍照。如图3所示，鸡胆汁中胞外体的电泳条带主要有四条，分别在26KD、34KD、43KD和72KD。4.胞外体所含蛋白分析将SDS-PAGE电泳后考染的胶条及胆汁胞外体浓缩液送上海中科新生命生物科技有限公司检测蛋白。利用ESI-MS质谱仪，由于MS/MS具有结构分析功能，可以获得检测到的每一肽段的序列。根据一级质谱(MS)测得的精确分子质量和串联质谱(MS/MS)所得的序列信息，通过蛋白质数据库的检索鉴定蛋白质种类。通过鉴定共分析出196种蛋白，主要的蛋白成分如图4所示，其中既包括胞外体标志性蛋白，也存在胆汁胞外体的特异蛋白，如HSP70，C-反应蛋白，玻连蛋白，粘蛋白等和大量免疫球蛋白。HSP70蛋白家族常作为胞外体的标志性蛋白作为认定胞外体的依据；C-反应蛋白，由肝细胞产生，是急性期反应蛋白，作为炎症反应的标志具有重要意义；玻连蛋白，其表达的差异常作为判断肝细胞癌的标准，表明禽源胞外体可以作为判定；粘蛋白由上皮细胞产生，起到润滑及细胞信号的传导等多种功能，可以形成化学屏障；大量免疫球蛋白的存在，说明了胞外体在免疫应答信息传递中具有重要作用。实施例3、胞外体MHC相关性检测I.前处理 取胞外体悬液置于4mm乙醒/硫酸盐磁珠乳液(购自Invitrogen公司)100 ii I中，孵育20°C 15min，再加入PBS缓冲液后在摇床上温和摇动2h，最后用lOOmmol/L甘氨酸
终止反应。2.流式细胞仪分析(I)将连接磁珠的胞外体离心2000rpm5min,(2)用 ImlFacs Buffer 将细胞吹打散开，离心 2000rpm5min,将 buffer 倒掉，(3)每管加入 100 微升 Facs Buffer(4)从各管中各取出一定量样品形成三管对照(5)离心 2000rpm5min,(6)使用鸡抗体 CD4+T-FITC/CD8+T-PE，MHC I -FITC/M0N-PE 等抗体 4°C避光染色30mino(7) ImlFacs Buffer 冲洗，离心 2000rpm5min(8)各管加入200微升多聚甲醛固定(9)流式细胞仪观察结果如图5所示，胆汁中的胞外体只连接磁珠表现为图A，95. 42%的胞外体呈现MHC I相关，仅有3. 78%表现出MHC II相关。因此，胆汁中的胞外体主要携带MHC I相关分子。实施例4、鸡胆汁胞外体对脾脏、胸腺、肝脏白细胞的影响I.无菌取出胸腺、肝和脾健康SPF鸡(4-6周龄)无菌打开腹腔取肝和脾，剖开颈部皮肤取胸腺，并称重。2 脾脏白细胞分离培养(I)在冰盒内放置灭菌平皿，将一小块脾，于细胞筛上轻轻研磨，以少量预冷的PBS冲洗细胞筛，将研磨液收集到15ml管中。(2)离心后加入ImlPBS重悬后，视细胞量加入红细胞裂解液，裂解lOmin。(3)加入PBS洗涤后用1640培养基重悬，分装至24孔板中，设置阴性对照(normal)、IgG、胞外体三组。(6)置于CO2培养箱培养3h后取出。3.胸腺白细胞分离培养
(I)先将胸腺上连带的脂肪完全去除干净，在冰盒内放置灭菌平皿，将每一块胸腺于细胞筛上轻轻研磨，以预冷PBS冲洗细胞筛,最后一起收集到15ml管中。(2)无菌取出的胸腺细胞1500r离心5min，弃上清。(3)加入PBS重悬后，视细胞量加入红细胞裂解液，裂解lOmin。(4)PBS洗涤后用1640培养基吹开沉淀，分装至24孔板中，设置阴性对照(normal)、IgG、胞外体三组。(5)置于CO2培养箱培养3h后取出。3.肝脏白细胞的分离
(I)在冰盒内放置灭菌烧杯，将肝剪成大小约Icm3的小块，把每一小块肝于细胞筛上研磨，以预冷PBS冲洗细胞筛，收集细胞液到50ml离心管中。(2)静置5min后，倾出上清，弃沉淀，将上清装在50ml离心管中。(3) 4°C 1500rpm 离心 8min,弃上清。(4)用鸡淋巴细胞分离液分离肝脏白细胞，20°C 2500rpm离心20min。(5)取上层，用PBS洗涤后用1640培养基吹开沉淀，取两个24孔板，用1640培养基吹开沉淀，分装，设置阴性对照(normal)、IgG、胞外体三组。(7)置于CO2培养箱培养3h后取出。4 流式细胞仪分析前处理(I)将培养的细胞取出离心2000rpm 5min ；(2)用ImlFacs Buffer将细胞吹打散开,离心2000rpm 5min,弃上清；(3)每管加入 100 微升 Facs Buffer ；(4)从各管中各取出一定量样品形成三管对照；(5)离心 2000rpm5min ;(6)使用鸡抗体 CD4+T-FITC/CD8+T-PE，MHC I -FITC/M0N-PE 等抗体 4°C避光染色30mino(7) ImlFacs Buffer 冲洗，离心 2OOOrpm5Iiiin,弃上清；(8)各管加入200微升多聚甲醛固定；(9)流式细胞仪检测。根据实验结果显示，胆汁中的胞外体对不同来源的细胞作用不同，对脾脏和胸腺来源的细胞没有明显促进增殖的作用，而对肝脏CD4+T淋巴细胞的作用显著。结果如图6所示，在适当时间和适宜的剂量下，胆汁中的胞外体对肝脏CD4+T淋巴细胞分化具有明显的激活作用(图B)，并呈现MHC I相关性(图C)。可见本发明所提供的胞外体具有明显的⑶4+T增殖作用。图7A&B所示，胆汁胞外体对脾脏、胸腺细胞的增殖作用不明显，但是如图7C&D所示，加入胞外体可以延长脾脏CD4+T、CD8+T以及单核细胞和MHC I类细胞的存活时间，提高存活率(即细胞的起始浓度相同，在持续培养的各个时间点比较淋巴细胞量，加入胞外体比不加胞外体组的细胞量都要高)，可见本发明所提供的胞外体具有明显的提高细胞的存活率和延长存活时间的作用。同时由于胞外体的双层脂质膜结构，通过常规技术试验比对可知，这种双层的脂质膜结构可以很好的保护药物，因此可以将其作为载体使用到药物的加工过程中。
权利要求
1.一种从鸡胆汁中提取的胞外体，其特征在于该胞外体具有典型杯状结构的双层脂质膜，含有肝源性和上皮细胞源性的蛋白成分，所述的肝源性的蛋白成分为C-反应蛋白或天冬氨酸氨基转移酶或玻连蛋白或其混合物；所述的上皮细胞源性的蛋白成分为粘蛋白。
2.根据权利要求I或所述的胞外体，其特征在于该胞外体还携带免疫球蛋白或多聚免疫球蛋白受体或其混合物。
3.根据权利要求I或2所述的胞外体，其特征在于所述胞外体直径在30-150nm，质量密度范围为I. 13-1. 19g/cm3。
4.根据权利要求2所述的胞外体，其特征在于该胞外体表面上呈递有MHCI分子或可与MHC I分子结合的抗原肽，或带有淋巴细胞共刺激分子，或上述物质共存。
5.制备如权利要求I所述的胞外体的方法，其特征在于具体步骤如下 将从SPF鸡或其他经过常规免疫的商品禽类胆嚢，离体4h内抽取的胆汁，胆汁在4°C低温条件下经逐级离心去细胞碎片取上清，经滤膜过滤，依次4°C 110, OOOg离心2h沉淀用PBS重悬，然后4°C 110，OOOg离心90min后用PBS溶解沉淀，所得溶液中即包含鸡胆汁胞外体； 其中所述的逐级离心为1000 2000g 15 20min，3000 4000g 20 30min，7000 8000g 45 50min，10000 15000g 40 60min。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于所述经过4°C110, OOOg离心90min后的沉淀通过30wt%、45wt%、60wt%的蔗糖溶液进行密度梯度离心。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述的逐级离心为2000gl5min，4000g30min,8000g45min,15000g 60min。
8.如权利要求I所述的胞外体，在用于激活体内外免疫反应或作为免疫反应佐剂，參与免疫调节，作为抗应激类药物的应用。
9.如权利要求I所述的胞外体，作为载体在制备治疗肝脏或胆囊或肠道疾病药物上的应用。
全文摘要
本发明属于分子免疫学领域，具体涉及一种由鸡肝脏、胆囊和胆管上皮细胞分泌和释放的胞外体，且公开了其制备方法，该胞外体中含有C-反应蛋白(C-reactive protein)、天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase)、玻连蛋白(Vitronectin)等肝源性的蛋白成分、上皮细胞源性的粘蛋白(Mucin)以及免疫球蛋白(Immunoglobulin)等免疫反应相关蛋白，可以作为研究肝脏疾病的生物指标以及作为免疫反应佐剂，参与免疫调节，还可以作为载体，应用于治疗肝脏、胆囊和肠道疾病的治疗。
文档编号A61P1/16GK102697812SQ201210169289
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月28日 优先权日2012年5月28日
发明者于琳琳, 姜艳萍, 张利, 成子强, 王桂花, 王玥, 王真真 申请人:山东农业大学