专利名称：L-02细胞作为具有肝功能的细胞源的医学应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和医药领域，具体涉及L-02细胞的肝细胞功能研究，及其在体外培养增殖后在肝细胞移植、治疗急性肝功能衰竭和肝细胞功能相关的医学研究等中的应用。
背景技术：
急性肝衰竭(Acute liver failure, ALF)死亡率很高，目前可根治急性肝衰竭的唯一方法是肝移植。但供肝数量远远不能满足患者的需求，很多急性肝衰竭患者在等待肝移植的过程中死亡。除肝移植外，急性肝衰竭尚有两种有效治疗方法，即肝细胞移植和生物人工肝。用人源性肝细胞充填的生物人工肝是治疗急性肝衰竭的一种公认有效的方法，可有效降低急性肝功能衰竭死亡率，可作为肝移植前的一种过渡性治疗。肝细胞移植可以明显降低急性肝功能衰竭死亡率，促进病肝再生和恢复，也可作为肝移植的过渡疗法。肝细胞移植和生物人工肝都需要大量的肝细胞，很多肝细胞相关医学研究也需要大量的肝细胞源，但目前人原代肝细胞的来源很困难，主要是可供分离肝细胞的肝脏来源不足，且原代肝细胞体外培养增殖极为困难。其他的一些可用细胞系，如干细胞、永生化肝细胞、异种肝细胞等，都有严重的不足，如永生化肝细胞潜在的致瘤危险性，异种肝细胞强烈的排异反应， 有关干细胞的研究尚不充分等。人胚胎肝细胞作为肝细胞移植和生物人工肝一种可用的细胞来源，已有相关研究证实了原代分离的胚胎肝细胞具有成人肝细胞类似的肝细胞功能。人胚胎肝细胞系L-02， 是上世纪80年代由国内学者自行建系的胚胎肝细胞系，其体外培养容易，来源方便，目前多作为许多实验的对照组细胞。但L-02细胞系是否具有肝细胞相关功能及是否能应用于肝细胞移植和生物人工肝，目前国内外文献中尚无报道。
发明内容
本发明的目的是对人胎肝细胞系L-02细胞系进行肝细胞功能研究，并将其应用于肝细胞移植，研究其治疗急性肝功能衰竭的效果，旨在提供一种新型可用、功能稳定、来源充足的具有良好肝功能的细胞系来源。本发明的技术方案是本发明选择了目前国内应用较多且来源方便、经无限繁代后的人胎肝细胞系L-02 细胞系，对其进行肝细胞功能研究。将L-02细胞解冻后进行培养增殖，其贴壁后增殖迅速， 传代周期较稳定，以新生牛血清培养2至3天即可传代，可完全满足实验的需求。对L-02 细胞进行肝细胞功能检测发现，L-02细胞表达多种肝细胞特异性因子，包括白蛋白、胆红素葡糖醛酸基转移酶、凝血因子、转氨酶等，表明其具有确切的肝细胞功能。为进一步验证 L-02细胞对于急性肝衰竭的治疗作用，本发明人选择了大鼠90%肝切除诱导的急性肝衰竭模型。实验中发现，实验组大鼠肝切除术后存活时间明显长于对照组大鼠，实验组大鼠30 天存活率达到70%以上，而对照组大鼠均于术后72小时内死亡，其差异具有统计学意义(P<0.01)。对存活30天大鼠进行开腹观察可见明显肝脏再生。同时抽血检测血氨及肝功能指标，证实L-02细胞能有效改善肝功能。本发明的优点(1)本发明所用的人胎肝细胞系L-02细胞系来源方便，无成瘤危险性，且易在体外大量培养增殖，适合临床推广。(2)本发明证明L-02细胞具有良好的肝细胞功能，可以作为良好的人源肝细胞替代来源，用于在治疗急性肝功能衰竭中的应用，为L-02细胞在医学实验研究上的应用奠定了基石出。
图1 :SD大鼠肝脏解剖图。图2 显微镜下观察L-02细胞(X 100)。图3 =RT-PCR检测L_02细胞肝细胞相关因子的表达。从左至右依次为白蛋白 (ALB)、人凝血因子-X(HBCF-X)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。图4 :ffestern-blot检测L-02肝细胞白蛋白的表达。图A从左至右依次为L_02 细胞、Hepg-2细胞、人原代肝细胞；图B为β -actin条带。图5 :L-02细胞免疫荧光染色，FITC标记白蛋白，激光共聚焦显微镜下观察白蛋白的分泌情况。图A、图B分别为20倍及60倍下观察所见，肝细胞质染成绿色颗粒状。图C 为100倍下所见，蓝色为DAPI所染胞核，胞质内见绿染的白蛋白颗粒。图6 :L-02细胞免疫荧光染色，TRITC标记葡糖醛酸基转移酶(UGTlAl)，激光共聚焦显微镜下观察。图A为60倍镜下观察所见，图B为100倍镜下见，蓝色为DAPI所染的胞核。两图均可见胞质内红染的UGTlAl颗粒。图7 :L_02移植、90%肝切除后分别测定并计算各组大鼠的存活率、血氨、白蛋白、 谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素、直接胆红素及碱性磷酸酶水平。其中Gl为移植L-02 细胞的实验组，G2为对照组。图8 裸鼠细胞种植后4周结果。图中右肩为种植H印g_2细胞，左肩种植等量L-02 细胞。
具体实施例方式以下结合说明书附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不是限制本发明。实施例1L-02细胞的肝细胞功能检测(一 )细胞培养-80°C取出事先冻存的L-02细胞，37°C水浴摇晃1分钟使之溶解，加入15ml离心管中，同时加入少量DMEM培养基以去除DMSO的影响，1200rpm/min离心3分钟，去上清，加入^iIDMEM高糖培养基，重悬细胞后投入T25细胞培养瓶中，置于37°C 5% C02培养箱中。每隔24h换液一次，大约3天左右细胞长到80%-90%融合后，按1 3比例传代， 待细胞扩增到足够数量后进行后续实验。在显微镜下观察细胞(X 100)，发现细胞解冻后12h内即可贴壁，24h后观察细胞， 间细胞生长较密集，呈多边形，胞质丰富，其内可见一个或多个细胞核，核仁清晰(见图2)。
( 二)RT-PCR检测相关基因的表达1. L-02肝细胞mRNA的提取DDEPC Iml加入999ml双蒸水中制备DEPC水，留下部分作为后续实验所用，余下用来浸泡实验器具，以去除RNA酶影响。2)弃去T25培养瓶中的培养基，加入约2ml Transhl (约IOcm2加Iml TransZol), 使细胞裂解，裂解的同时用枪头反复吹吸数次，室温孵育5分钟后转入Ep管。3)加入0. 4ml氯仿(每Iml TransZol加0. 2ml氯仿)，剧烈震荡15秒，室温放置 3分钟。4) 10000g/min，4°C离心15分钟。此时可见Ep内液体分3层，其中RNA位于最上层水相中。5)转上层水相至一新的Ep管中，加入Iml异丙醇(1ml TransZol加500 μ L异丙醇)，充分混勻后室温放置10分钟。6) 10000g/min，4°C离心10分钟，去上清，可见于Ep管底和管侧形成胶样沉淀。7)加入anl由DEPC水配制而成的75%乙醇，每Iml TransZol至少加Iml乙醇， 剧烈涡旋振荡。8)7500g，4°C离心 5 分钟。9)去上清，超净工作台开风机干燥约5分钟，但不能完全干燥。10)加入100 μ L RNA溶解液以使沉淀溶解。11) 550C -60°C孵育10分钟，立即保存RNA样本于_70°C或立即用于逆转录。2.逆转录合成cDNA 1)于0. 2ml Ep管中依次加入以下试剂(20 μ L体系)
权利要求
1.L-02细胞用于作为肝细胞移植的细胞源的应用。
2.L-02细胞用于作为生物人工肝的细胞源的应用。
3.L-02细胞用于肝功能相关的医学实验的应用。
4.按权利要求1或2所述的L-02细胞在治疗急性肝功能衰竭疾病上的应用。
5.按权利要求1或2所述的L-02细胞在治疗其他肝功能衰竭疾病上的应用。
全文摘要
本发明对人胎肝细胞系L-02细胞系进行了肝细胞功能研究，并将其应用于肝细胞移植。研究发现L-02细胞具有良好的肝细胞功能，能够表达多种肝细胞特异性因子，包括白蛋白、胆红素葡糖醛酸基转移酶、凝血因子、转氨酶等。大鼠90％肝切除诱导的急性肝衰竭模型实验表明，L-02细胞能有效延长急性肝衰竭大鼠的存活时间，且无成瘤危险性，有望成为肝细胞移植、生物人工肝和肝细胞功能相关医学研究等的较好细胞来源，用于治疗急性肝功能衰竭和肝细胞功能研究等医学领域。
文档编号A61P1/16GK102397583SQ201110307209
公开日2012年4月4日 申请日期2011年10月12日 优先权日2011年10月12日
发明者周平, 孟凡迎, 杨涛, 林菊生, 胡昕鹏 申请人:华中科技大学同济医学院附属同济医院