专利名称：来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白的cxcr4受体拮抗活性多肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白(vMIP-II)多肽在制药领域的应用，尤其是来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白的CXCR4受体拮抗活性多肽及其应用。
背景技术：
HIV/艾滋病感染，乙型肝炎，恶性肿瘤的转移，慢性免疫性炎症，免疫抑制，重症贫血，动脉粥样硬化等疾病治疗、预防、控制难，给人们带来极大的痛苦。由于上述疾病的机理极其复杂，目前还没有相关的特效治疗控制药物。
趋化因子与其受体的相互作用控制着各种免疫细胞在循环系统和组织器官间定向迁移，使之到达感染、创伤和异常增殖部位，执行清除感染源、促进创伤愈合和消灭异常增殖细胞、维持组织细胞平衡的功能。因此趋化因子系统在免疫系统功能行使的各个环节中处于关键地位，并由此在病原体的清除、炎症反应、病原体感染、细胞及器官的发育、创伤修复、肿瘤形成及其转移、移植免疫排斥等方面都起着重要的作用。以趋化因子及其受体分子为药物靶点，通过激活或拮抗趋化因子受体的信号传导来调控趋化因子系统的功能，可用于控制和治疗相关疾病，例如治疗HIV/艾滋病感染，乙型肝炎，恶性肿瘤的转移，慢性免疫性炎症，免疫抑制，重症贫血，动脉粥样硬化，等等。趋化因子以及它们的类似物在这些疾病中有着良好的治疗前景。
病毒巨噬细胞炎性蛋白-II(virus macrophage inflammatory protein-II，vMIP-II)是由人疱疹病毒8的K4基因编码的一种病毒趋化因子，与人CC类趋化因子有较大的同源性，是人趋化因子的类似物。vMIP-II的全基因编码95个氨基酸，前二十三个为信号肽序列，最后的一个精氨酸也在蛋白折叠完成后被去除，最后发挥功能的蛋白具有71个氨基酸残基，此蛋白与人的MIP同源性高达41％。vMIP-II与趋化因子受体结合后不引起胞内Ca2+迅速内流，故不引起信号传导，从而对趋化因子与相应受体的结合起到拮抗作用。vMIP-II和CC、CXC趋化因子受体都能结合，所以对趋化因子有广谱的拮抗作用。vMIP-II不同于其他趋化因子的一个独特特点是它能够拮抗包括CCR1，CCR2，CCR3，CCR5，CXCR4和CX3CR等在内的多种趋化因子受体，特别是对CCR5和CXCR4有较高的亲和力。目前，根据趋化因子家族的结构相似性，通过对vMIP-II与其他的趋化因子序列以及分子结构建模对比，寻找趋化因子与受体结合相关的高度保守区，合成相应部位来源于vMIP-II能具有CXCR4受体结合活性的多肽以及其应用方面的报道还没有出现过。
发明内容
本发明来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白的CXCR4受体拮抗活性多肽及其应用的目的是提供来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白(vMIP-II)能具有CXCR4受体结合活性的多肽以及其在治疗HIV/艾滋病感染，恶性肿瘤的转移，重症贫血，动脉粥样硬化等趋化因子受体相关疾病以及促进干细胞的成熟与迁移，起干细胞动员作用。
本发明这样实现的本发明来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白的CXCR4受体拮抗活性多肽是利用趋化因子家族高度同源的特点，进行基于结构的多序列比较分析来寻找与CXCR4受体结合的多个趋化因子间的高度保守区，也就是它们可能与CXCR4受体结合相关的区域或残基。通过分子三维空间显示的方法来分析这些位点的空间位置的基础上遴选出一些包含有CXCR4受体结合位点的而且来源于vMIP-II全分子的多肽片段，并利用分子建模技术对这些多肽进行分子三维结构模拟以了解这些多肽是否具有与全分子相应部位相似的空间结构。然后取得相应的源于vMIP-II的CXCR4受体拮抗活性多肽。
本发明来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白的CXCR4受体拮抗活性多肽包含有相关受体的结合位点，vMIP-II结合CXCR4受体的多肽含有体有vMIP-II中G2、K10残基。
本发明所述的多肽可以在生物信息学分析的基础上，得到vMIP-II与CXCR4受体的结合位点，然后通过化学合成法或基因工程技术手段获得。
本发明所述的多肽具有特异性结合CXCR4的作用，而对其他趋化因子受体没有作用，是单趋化因子受体拮抗剂。
本发明所述多肽可以在HIV/艾滋病感染，恶性肿瘤的转移，重症贫血，动脉粥样硬化等CXCR4趋化因子受体相关疾病以及促进干细胞的成熟与迁移等方面应用。
本发明所述CXCR4受体特异多肽能通过拮抗和封闭CXCR4受体，从而有效阻断HIVX4株进入靶细胞，具有抗HIV/艾滋病感染的作用，尤其对发病期的患者特别有效。
本发明所述多肽能与体内生理性趋化因子竞争结合趋化因子受体，从而阻断生理性趋化因子引起的白细胞趋化活动以及细胞内钙离子流动，从而在趋化因子受体相关疾病如恶性肿瘤的转移，重症贫血，动脉粥样硬化等有治疗作用。
本发明所述的多肽能通过与干细胞表面表达的CXCR4受体结合，从而促进干细胞的成熟与迁移，起到干细胞动员剂的作用，从而在干细胞移植方面有作用。
本发明所述的多肽能通过与在炎症反应中起重要作用的CXCR4受体结合，从而阻断CXC类趋化因子与CXCR4受体结合，通过阻断受体配体结合而抑制由他们介导的炎症反应，在治疗炎症反应上有作用。
本发明的源于病毒巨噬细胞炎性蛋白的CXCR4受体拮抗活性多肽具有特异结合某一趋化因子受体的作用，是一个高效而特异的趋化因子受体拮抗剂。能结合趋化因子受体，却不引起淋巴细胞趋化活动以及钙离子流动，可以用于治疗HIV/艾滋病感染，恶性肿瘤的转移，重症贫血，干细胞动员，动脉粥样硬化等CXCR4趋化因子受体相关疾病以及促进干细胞的成熟与迁移，起干细胞动员作用。
说明书附1为本发明的vMIP-II与CXCR4受体结合因子的多重序列对比分析；图2为本发明的多肽P1的趋化活性实验；图3为本发明的多肽P1对SDF-1引起细胞趋化的抑制率；图4为本发明的多肽P1 PBMC胞内钙浓度的影响；图5为本发明不同浓度的P1对CXCR4特异性因子SDF-1α引起的钙流的影响；图6为本发明的P1抑制合胞体形成实验。
具体实施例方式
以下结合附图和实施例对本发明进一步说明。
实施例1，vMIP-II与CXCR4受体结合因子的多重序列对比分析。
蛋白质序列多重对齐比较分析采用Informax Vector NTI Version 9.0软件包完成。采用其中的AlignX过程对影响趋化因子受体结合的残基进行预测分析先选用与CXCR4受体特异结合的人源性趋化因子序列进行基于结构的多重序列对齐分析，在全部趋化因子序列中均存在或保守取代的残基即可能是与该受体结合有关的残基(即标准结合残基模型的建立)。再将vMIP-II的序列引入标准结合残基模型中进行多重序列比较分析从而得出vMIP-II与该受体结合有关的残基即vMIP-II与受体结合可能有关的残基。为了最大可能的除去无关残基的干扰，利用与vMIP-II同源性较高，但不与该受体结合的趋化因子作为排除标准，排除作为排除标准亦存在的残基，从而得到与受体结合高度相关的残基。
从
图1(方框内为排除标准，黑色圆点示高度保守的区域)的结果可以看出vMIP-II与CXC类趋化因子受体结合位点的主要在变异较大的N端，主要的位点有G2，K10。根据图1上面序列分析和残基空间位置分析结果，可以设计对应CXCR4受体结合理论位点的多肽。包含有G2，K10的位点的多肽具有结合CXCR4活性。通过上述序列分析和残基空间位置的分析，本发明的源于病毒巨噬细胞炎性蛋白的CXCR4受体拮抗活性多肽分别包含对应CXCR4结合理论位点的多肽，它们的序列分别是LGASWHRPDKCCLGY(P1)。
实施例2，来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白的CXCR4受体拮抗活性多肽的制备。
本发明所述的多肽是在生物信息学分析的基础上，得到vMIP-II与CXCR4受体的结合位点，然后通过化学合成法或基因工程技术手段制备获得。
实施例3，多肽的趋化性实验。
分离PBMCs(单个核细胞)，调整细胞密度为1×106/ml。用含0.5％ FBSRPMI1640趋化缓冲液孔为空白孔；用含有10ng/ml CXCR4的特异性配体SDF-1α的0.5％FBS RPMI1640趋化缓冲液孔为阳性对照孔；用含不同浓度多肽的趋化缓冲液孔为实验孔。在24孔Transwell装置中进行趋化实验。将趋化的细胞数，输入Microsoft Excel软件进行数据处理和作图。实验结果图2显示多肽P1均没有趋化淋巴细胞的活性。多肽对趋化因子的受体是没有作用的，不是趋化因子受体激活剂。
实施例4，多肽对生理性趋化因子引起的细胞趋化抑制实验。
分离的PBMCs，调整细胞密度为1×106个/ml，预先用不同浓度多肽P1(0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml)在4℃条件下处理30min。未经任何处理的细胞作为空白对照，用含有10ng/ml SDF-1α的培养基孔为阳性对照孔。在24孔Transwell装置中进行趋化抑制实验。将趋化的细胞数，输入MicrosoftExcel软件进行数据处理和作图。实验结果如图3显示，多肽P1对SDF-1引起细胞趋化有剂量依赖的阻断作用，是CXCR4受体的拮抗剂。HIV感染后会转变为T细胞嗜性(T-tropic)毒株(X4)后，其辅助受体也转为以CXCR4为主。多肽P1通过拮抗和封闭CXCR4受体，能有效阻断HIV X4株进入靶细胞，具有抗HIV/艾滋病感染的作用，尤其对发病期的患者效果明显。
实施例5，多肽对PBMCs的细胞内钙离子浓度的影响。
利用连续时间扫描检测的方法检测多肽对细胞钙离子浓度的变化，检测了多肽P1对PBMCs细胞内钙离子浓度的影响。实验结果图4(选自100ng/ml浓度组具有代表性结果)表明不同浓度(1ng/ml，10ng/ml，100ng/ml)的多肽P1本身均不能引起PBMCs的细胞内钙浓度的变化。细胞内钙离子浓度在加入P1后没有发生明显改变。
实施例6，不同浓度的P1对CXCR4特异性因子SDF-1α引起的钙流的影响。
通过分别测定了不同浓度的多肽P1对CCR5，CXCR4，CCR2等9个受体特异的生理性趋化因子引起的钙离子浓度变化的影响。实验结果表明P1对MIP-1β，IL-8，IP-10，I-309，Exotaxin-2，MIP-3α，MIP-3β，MCP-1所引起的PBMCs胞内钙离子浓度变化无明显影响，而P1对CXCR4特异的趋化因子SDF-1a引起的钙离子浓度变化呈现了剂量相关的抑制效应。如图5所示，1ng/ml、10ng/ml和100mg/ml的P1均能抑制SDF-1a引起的钙流而有一定的量效关系。在预先用1ng/ml浓度的P1处理时，即能对SDF-1α引起的钙浓度变化起到明显的作用，荧光度明显减弱，在用100ng/ml浓度的P1处理时SDF-1α引起的钙离子内流基本被阻断。所以本发明的多肽能与体内生理性趋化因子竞争结合趋化因子受体，从而阻断生理性趋化因子引起的白细胞趋化活动以及细胞内钙离子流动，从而在趋化因子受体相关疾病如恶性肿瘤的转移，重症贫血，动脉粥样硬化等有治疗作用。
实施例7，合胞体形成抑制实验。
我们通过利用合胞体形成抑制实验来检测多肽是否可以阻断正常CEMx174细胞感染SIV(猴免疫缺陷病毒)，从而确定多肽是否具有抗病毒作用。病毒上清与正常的未感染CEMx174细胞共培养，在病毒培养3，5，7天分别在倒置显微镜下观察每孔的合胞体(CPE)形成情况，计数平均病变细胞百分率。多肽P1抑制合胞体形成实验中，见图6(左图为各组合胞体形成数，右图为各组抑制率)，多肽P1对CEM×174细胞形成病毒合胞体有明显的抑制作用，125ng/ml的P1对病毒合胞体形成的抑制作用强于对照组125ng/ml vMIP-II，在625ng/ml高剂量组P1的抑制率为67.99％，利用Reed-Murch法计算P1抑制合胞体形成的IC50为118.11ng/ml。
本发明来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白的CXCR4受体拮抗活性多肽包含了vMIP-II结合趋化因子受体CXCR4的活性位点，具有特异结合CXCR4受体的活性，能封闭HIV感染的主要共受体，而具有抗病毒作用。同时，它作为一个CXCR4受体特异的拮抗剂，在治疗HIV/艾滋病感染，恶性肿瘤的转移，重症贫血，动脉粥样硬化等CXCR4受体相关的疾病具有良好作用，在制药工业具有光明的前景。
权利要求
1.一种来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白的CXCR4受体拮抗活性多肽。
2.如权利要求1所述的来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白的CXCR4受体拮抗活性多肽，其特征在于vMIP-II结合CXCR4受体的多肽包含有体有vMIP-II中G2、K10残基的结合点。
3.如权利要求2所述的来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白的CXCR4受体拮抗活性多肽，其特征在于来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白的CXCR4受体拮抗活性多肽通过化学合成法或基因工程技术手段获得。
4.如权利要求3所述的来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白的CXCR4受体拮抗活性多肽，其特征在于源于病毒巨噬细胞炎性蛋白的CXCR4受体拮抗活性多肽具有特异性结合CXCR4的作用，对其他趋化因子受体没有作用，是单趋化因子受体拮抗剂。
5.如权利要求4所述的来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白的CXCR4受体拮抗活性多肽，其特征在于来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白的CXCR4受体拮抗活性多肽用于治疗趋化因子受体相关疾病以及促进干细胞的成熟与迁移方面。
6.如权利要求4所述的来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白的CXCR4受体拮抗活性多肽，其特征在于来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白的CXCR4受体拮抗活性多肽具有抗HIV/艾滋病感染的作用。
7.如权利要求4所述的来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白的CXCR4受体拮抗活性多肽，其特征在于来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白的CXCR4受体拮抗活性多肽在趋化因子受体相关疾病如恶性肿瘤的转移，重症贫血，动脉粥样硬化等有治疗作用。
8.如权利要求4所述的来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白的CXCR4受体拮抗活性多肽，其特征在于来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白的CXCR4受体拮抗活性多肽在干细胞移植方面的应用。
9.如权利要求4所述的来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白的CXCR4受体拮抗活性多肽，其特征在于来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白的CXCR4受体拮抗活性多肽，在治疗炎症反应上的应用。
全文摘要
来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白的CXCR4受体拮抗活性多肽是生物信息学分析的基础上，得到病毒巨噬细胞炎性蛋白与CXCR4受体的结合位点，然后通过化学合成法或基因工程技术手段获得；其具有特异结合某一趋化因子受体的作用，是一个高效而特异的趋化因子受体拮抗剂。能结合趋化因子受体，却不引起淋巴细胞趋化活动以及钙离子流动，可以用于治疗HIV/艾滋病感染，恶性肿瘤的转移，重症贫血，干细胞动员，动脉粥样硬化等CXCR4趋化因子受体相关疾病以及促进干细胞的成熟与迁移等方面。
文档编号A61P29/00GK1872879SQ20061003613
公开日2006年12月6日 申请日期2006年6月29日 优先权日2006年6月29日
发明者孙晗笑, 叶石敦 申请人:广州法蕊仕药业科技有限公司