专利名称：注射骨髓源细胞和培养基用于血管生成的制作方法
技术领域：
本申请涉及注射自体骨髓和骨髓细胞的方法。更具体地，本发明涉及心肌内注射自体骨髓和转染的骨髓细胞，和/或来源于这些细胞培养生长时(其不是必需从自体细胞得到)的培养基，以增强侧支血管形成(血管生成(angiogenesis))和组织灌注。
背景技术：
应用重组基因或生长因子增强心肌侧支血管(collateral bloodvessel)功能，代表了治疗心血管疾病的一种新方法。Komowski，R.等人，“Delivery strategies for therapeutic myocardial angiogenesis，”Circulation 2000；101454-458。此观点的证据显示于心肌缺血动物模型中，临床试验正在进行中。Unger，E.F.等人，“Basic fibroblast growthfactor enhances myocardial collateral flow in a canine model，”Am JPhysiol 1994；266H1588-1595；Banai，S.等人，“Angiogenic-inducedenhancement of collateral blood flow to ischemic myocardium by vascularendothelial growth factor in dogs，”Circulation 1994；83-2189；Lazarous，D.F.等人，“Effect of chronic systemic administration of basic fibroblastgrowth factor on collateral development in the canine heart，”Circulation1995；91145-153；Lazarous，D.F.等人，“Comparative effects of basicdevelopment and the arterial response to injury，”Circulation 1996；941074-1082；Giordano，F.J.等人，“Intracoronary gene transfer of fibroblastgrowth factor-5 increases blood flow and contractile function in anischemic region of the heart，”Nature Med 1996；2534-9。Guzman，R.J.等人，“Efficient gene transfer into myocardium by direct injection ofadenovirus vectors，”Circ Res 1993；731202-7；Mack，C.A.等人，“Biologic bypass with the use of adenovirus-mediated gene transfer of thecomplementary deoxyribonucleic acid for VEGF-121，improvesmyocardial perfusion and function in the ischemic porcine heart，”J ThoracCardiovasc Surg 1998；115168-77。
在心肌缺血动物模型中，已经研究了直接术中心肌内注射(direct intra-operative intramyocardial injection)血管生成因子(angiogenicfactor)对侧支功能(collateral function)的效应。开胸、经心外膜给予腺病毒载体，导致侧支功能增强，所述腺病毒载体含有编码血管生成肽的转基因(transgene)(Mack等人，见上)。也报道，在患者的开心脏手术期间直接心肌内注射血管生成肽或质粒载体时，发生血管生成。Schumacher，B.等人，“Induction of neoangiogenesis in ischemicmyocardium by human growth factors.First clinical results of a newtreatment of coronary heart disease，”Circulation 1998；97645-650；Losordo，D.W.等人，“Gene therapy for myocardial angiogenesisinitialclinical results with direct myocardial injection of phVEGF 165 as soletherapy for myocardial ischemia，”Circulation 1998；982800。我们不希望将本专利限制为心肌内注射，—我们应该省略本段吗？ 尽管治疗性血管生成(therapeutic angiogenesis)作为一种新形式，对治疗患有冠状动脉疾病的患者是大有希望的，但是在关于哪种具体策略将最佳促进临床上相关的治疗性血管生成反应上，仍然存在着巨大差距。而且，不清楚多种血管生成生长因子(angiogenic growthfactor)中的哪一个(或更多个)可能和有益的血管生成反应相关。此外，应用不同的组织输送平台，例如，蛋白质、腺病毒或“裸”DNA(nakedDNA)促进最佳的血管生成反应，仍然是悬而未决的问题。
发明概述 本发明基于这样的前提多种复杂的过程涉及几十个基因的差异表达，如果不是数百个基因的话，而所述过程对于最适的侧支发育是必要的。基于此概念，随之是，侧支血管的最适发育和组织灌注不能通过给予单一的基因而得到，已知所述基因的编码产物和血管生成相关；或者由于血管生成过程的复杂性，也不能通过给予血管生成相关基因的一个组合而得到。本发明依赖于骨髓细胞分泌参与血管生成的生长因子和细胞因子的能力，所述分泌是时问和浓度依赖性的协调的和合适的顺序进行的。
绝大多数当前处于试验中的治疗方法集中于，将单一的血管生成生长因子(例如，VEGF、FGF、血管生成素-1(angiopoietin-1))输送至缺血组织。这可以通过输送终产物(例如，蛋白质)或应用不同载体通过基因转移来完成。然而，认为在几种生长因子体系中的复杂相互作用，对于起始和维持新血管形成可能是必需的。更具体地，认为用各种血管生成细胞因子(angiogenic cytokines)诱导特异定位的血管生成环境(specific localized angiogenic milieu)是重要的，所述细胞因子以协调一致的和时间适当的方式(in concert and in a time-appropriate manner)相互作用，从而起始和维持新血管的形成和功能。
因此，在一种实施方案中，本发明提供了方法，用于在需要的患者中增强受损骨髓细胞促进侧支血管发育的能力。受损骨髓细胞(impaired bone marrow cells)是从患者得到的，并且在合适的培养条件下在合适的培养基中生长一段时间，所述时间足以促进由骨髓细胞产生的早期附着细胞(early attaching cells)。至少一部分早期附着细胞被载体转染，所述载体包括编码一种或多种因子(agents)的多核苷酸，所述因子选自血管生成细胞因子、生长因子和哺乳动物血管生成促进因子(angiogenic-promoting factors)，转染的骨髓细胞被进一步培养一段时间，所述时间足以使一种或多种因子产生。通过此方法，培养的骨髓细胞和/或来自这些细胞培养生长中的培养基促进患者侧支血管发育的能力被增强，所述细胞和/或培养基被输送入了所述患者，这是与非转染的细胞或来自由培养生长的非转染细胞得到的培养基的能力相比而言的。
在另一种实施方案中，本发明提供了增强所需患者中侧支血管形成的方法，如下实施使骨髓在合适的培养条件下生长一段时间，所述时间足以促进由骨髓产生早期附着细胞；用载体转染至少一部分早期附着细胞，所述载体包括编码一种或多种因子的多核苷酸，所述因子选白血管生成细胞因子、生长因子和哺乳动物血管生成促进因子，用于由早期附着细胞表达，和在培养基中培养转染的早期附着细胞和培养一段时间，所述时间适于使细胞表达一种或多种因子，从而产生条件培养基(conditioned medium)。随后，将有效量的转染的早期附着细胞和/或条件培养基直接给予患者的所需部位，从而增强患者中该部位的侧支血管形成(collateral blood vessel formation)。
在又一种实施方案中，本发明提供了治疗组合物，包括来自骨髓的早期附着细胞，所述细胞已经被载体转染，所述载体包括编码一种或多种因子的多核苷酸，所述因子选自血管生成细胞因子、生长因子和血管生成促进因子。治疗组合物可以进一步包括条件培养基，在条件培养基中，转染的细胞已经培养生长一段时间，所述时间足以使一种或多种转基因因子以及其它因子表达，所述因子通常由这些培养细胞产生。
附图简述
图1是PAEC’s的增殖对条件培养基量的图； 图2是内皮细胞增殖对条件培养基量的图； 图3是经四周时间期间，条件培养基中VEGF浓度的图；和 图4是经四周时间期间，条件培养基中MCP-1浓度的图。
图5是显示来自小鼠的CD34+细胞和骨髓源基质细胞(bonemarrow-derived stromal cells)的VEGF、MCP-1和bFGF体外产量的图。
图6是曲线图，显示了当被注射入小鼠缺血后肢的内收肌(adductor muscles)时，骨髓源基质细胞对侧支血流(collateral flow)发育的影响，如激光/多普勒灌注成像所确定。血流(flow)被表示为缺血肢体的血流和正常后肢血流的比值。MSC＝骨髓源基质细胞(marrow-derived stromal cell)；培养基(Media)＝非条件培养基(non-conditioned media)；MAEC＝小鼠主动脉内皮细胞(mouse aorticendothelial cells)。
图7是显示对体外释放VEGF和bFGF的影响的图，所述VEGF和bFGF来自用腺病毒转染的骨髓源基质细胞(MSCs)，所述腺病毒编码HIF-1α-VP16。(MSC＝单独的MSCs；缺氧＝单独的缺氧条件；HIP＝用编码融合蛋白HIF-1α-VP16的DNA转染的MSCs。数据代表了对至少3个不同的MSC群的分析。
图8是曲线图，显示了与接受1×105非转导的MSCs相比，在接受注射入后肢的1×105HIF-1α/VP16转导的MSCs的小鼠中，改进的体内血流恢复(趋势比较p＝0.05，经ANOVA比较)。细胞在第一天被注射。
发明详述 骨髓(bone marrow)(BM)是参与调控血管生成过程的广谱的细胞因子(例如，生长因子)和细胞的天然来源。因此认为，输送自体BM((autologous)(A)BM)或从其而来的骨髓细胞，或当这些细胞培养生长时、来自这些细胞的培养基，通过利用这些细胞以时间适当的方式分泌许多血管生成因子的天然能力，提供了在缺血心肌中获得治疗性侧支发育的最适干预手段。
根据本发明的多种多样的实施方案，注射自体骨髓或来自自体骨髓的细胞，或当这些细胞培养生长时、来自这些细胞的培养基，或是以“单独”(stand alone)治疗剂或是和任意的药理学药物、蛋白质或基因或任何其它化合物或干预手段相结合，所述药理学药物、蛋白质或基因或任何其它化合物可以增强骨髓产生血管生成生长因子和/或促进内皮细胞增殖、迁移和血管管道形成。可以将“组合的”(combined)血管生成因子直接注射入患者或靶组织，或在将骨髓或骨髓细胞注射入患者之前，在体外和骨髓温育。如此处所应用，术语“骨髓细胞”(bonemarrow cell)意味着，通过在细胞生长条件下培养抽吸的骨髓(aspiratedbone marrow)而产生的任何细胞。
这些“组合的”血管生成因子的非限制性例子是，粒细胞-单核细胞集落刺激因子(Granulocyte-Monocyte Colony Stimulatory Factor(GM-CSF))、单核细胞趋化蛋白1(Monocyte Chemoattractant Protein 1(MCP-1))和缺氧诱导因子-1(Hypoxia Inducible Factor-1(HIF-1))。
骨髓也是参与血管生成调控和炎症过程的广谱的细胞因子、生长因子和血管生成促进因子(angiogenesis-promoting factors)的天然来源。表达的细胞因子、生长因子和血管生成促进因子包括已知参与维持早期和晚期血细胞生成的介质(IL-1α和IL-1β、IL-6、IL-7、IL-8、IL-11和IL-13；集落刺激因子、血小板生成素、红细胞生成素、干细胞因子、fit 3-配体、肝细胞生长因子、肿瘤坏死因子α、白血病抑制因子、转化生长因子β1和β3；和巨噬细胞炎性蛋白1α(macrophageinflammatory protein 1 alpha)，血管生成因子(成纤维细胞生长因子1和2、血管内皮生长因子)和其通常的靶(和来源)是结缔组织形成细胞的介质(血小板源性生长因子A、表皮生长因子、转化生长因子α和β2、制瘤素M和胰岛素样生长因子-1)，或神经元细胞的介质(神经生长因子)。Sensebe，L.等人，Stem Cells 1997；15133-43。而且，已经显示，VEGF多肽存在于血小板和巨核细胞中，和β-血小板球蛋白的释放一起从活化的血小板释放。Wartiovaara，U.等人，Thromb Haemost 1998；80171-5；Mohle，R.，Proc Natl Acad Sci USA 1997；94663-8。
也有指示物支持下述概念需要血管生成以支持骨髓功能和造血细胞的发育，包括干细胞和祖细胞，其可以进入循环并靶向于创伤愈合和/或缺血组织，最终有助于新血管形成。已经显示，特异地识别从成人骨髓分离出的未分化间充质祖细胞的单克隆抗体，识别发育中的微血管的细胞表面标志物，证据证明，这种细胞可以在胚胎血管生成中起作用。Fleming，J.E.，Jr.，Dev Dyn 1998；212119-32。
在病理状态下，骨髓血管生成可以变得过度，在所述病理状态中，骨髓被恶性细胞所活化(如在多发性骨髓瘤中)，其处已经显示，骨髓血管生成和人多发性骨髓瘤细胞的进展同时增加。Ribatti，D.等人，Br J Cancer 1999；79451-5。而且，已经显示，血管内皮生长因子(VEGF)在造血肿瘤(hematopoietic neoplasms)如多发性骨髓瘤的生长中通过或是旁分泌或是自分泌机制起作用。Bellamy，W.T.，Cancer Res 1999；59728-33；Fiedler，W.，Blood 1997；891870-5)。认为具有其独特的天然体液性质和细胞性质的自体骨髓，是多种血管生成化合物的潜在来源。此“混合的”血管生成细胞因子的天然来源可以惊人地被用作有效的相互作用的生长因子(interactive growth factors)的混合物，以产生治疗性血管生成和/或肌生成(myogenesis)；应用细胞本身可以提供这些天然血管生成因子的更加持续的来源。
此外，现在惊人地发现，培养这种骨髓细胞的培养基含有这种相互作用的生长因子蛋白的混合物，所述蛋白产生治疗性血管生成和/或肌生成。而且，治疗效应可以通过培养非自体骨髓细胞一段时间而产生，所述时间适于使相互作用的生长因子蛋白从骨髓细胞产生和向缺血组织区输送“条件”培养基，以产生治疗性血管生成和/或肌生成。事实上，这是“预料不到的结果”当转染早期附着骨髓细胞时，将这种骨髓细胞和通过使转染的骨髓细胞培养生长而得到的条件培养基，或单独的条件培养基注射入缺血相关组织或经注射输送入血流，如供应缺血组织的动脉，或任何其它动脉或静脉，导致的血管生成大于单独注射转染的骨髓干细胞导致的血管生成。
最可能参与响应于缺血而起始血管生成的血管生成促进因子之一是HIF-1，其为一种有效的转录因子，结合并刺激参与缺氧反应的几个基因的启动子。HIF-1的诱导和活化由组织pO2紧密调控；HIF-1表达随pO2降低而呈指数增加，从而提供了正反馈环，通过正反馈环，pO2降低引起基因产物表达增加，所述产物对低氧环境起适应性反应的作用。HIF-1活化导致，例如，参与糖酵解的基因红细胞生成素的诱导，和VEGF的表达。它可能也调节许多其它基因的表达，所述基因参与对低pO2水平的适应性反应。HIF-1调节参与对低氧反应的蛋白质的水平的机制是通过转录调节响应于低pO2的基因而实现的。因此，这种基因在启动子或增强子区内有短的DNA序列，其含有HIF-1结合位点，被称为缺氧反应元件(hypoxia responsive element)(HRE)。HIF-1是异二聚体，带有基本的螺旋-环-螺旋基序，由亚基HIF-1α和HIF-1β构成。其水平是通过pO2调节的，既在转录水平也在转录后调节—HIF-1诱导通过缺氧而增加，并且其半衰期随pO2水平增加而显著降低。
相关的是，尽管HIF-1的表达(如在Hela细胞中所确定)与pO2指数相关和负相关，曲线的拐点(inflection point)在氧饱和度为5％时发生，最大活性在0.5％处，1/2最大活性在1.5-2.0％处。这些相对缺氧的低水平，并且不清楚这种水平是否发生于存在中度水平的心肌缺血或下肢缺血时-即，不存在组织坏死时(分别是心肌梗塞，和腿部溃疡)的水平。因此，骨髓细胞可以具有分泌血管生成因子，从而增强侧支发育的能力。然而，可能的是，如果一些附加的刺激不存在，这种活性在被治疗的具体组织环境中可以不变得显著。因此，如果需要，给予骨髓或者骨髓细胞，和HIF-1共同植入，是本发明的一个优选方面。预期的是，HIF-1将为骨髓移植物中存在的许多缺氧诱导的血管生成基因提供最佳的表达。HIF-1可以作为蛋白质或是作为基因被注射。如果是作为后者，其可以在质粒载体或者病毒载体中被注射，或者以任意其它方式被注射，所述方式导致出现功能上相关的蛋白质水平。
HIF-1是转录因子，在缺氧诱导基因的转录激活作用中起关键作用。它以异二聚体起作用，异二聚体由HIF-1α和HIF-1β亚基组成。HIF-1活性由HIF-1α亚基的稳定性所控制。因此，HIF-1α在常氧环境下被泛素化，其靶向于该分子的蛋白酶体降解(proteasomaldegradation)。缺氧导致泛素化降低，从而增强蛋白质稳定性。这增强了异二聚体形成，从而增加HIF-1活性。HIF-1的功能活性紧密地和负性地与氧水平相偶联的事实提示了其作为氧的分子感受器，和从而在细胞对缺氧的适应性反应中的关键作用。已经发现，HIF-1的转录活性来源于异二聚体结合于特异的DNA缺氧-反应识别元件(HRE)的能力，如所述，异二聚体仅在缺氧条件下形成，缺氧-反应识别元件存在于参与细胞对缺氧的反应的许多基因的启动子中，包括VEGF、VEGFR1、VEGFR2、Ang-2、Tie-1和一氧化氮合酶。因此，HIF-1在协调组织对缺氧的反应中起重要作用。
由于HIF-1α在不存在缺氧时的不稳定性，为了确认其甚至在常氧条件下的组成性活性(constitutive activity)，构建了HIF-1α基因的嵌合(chimeric)构建体，由来自HIF-1α的DNA-结合和二聚化结构域和来自单纯疱疹病毒VP16蛋白的转录激活域构成，如下面的实施例8中所描述。VP16结构域废除了HIF-1α中的泛素化位点，从而消除了蛋白质经蛋白酶体介导的降解。因此，得到的稳定水平的HIF-1α导致由HIF-1靶向的基因的组成性转录激活。
然而，着重的是，HIF-1被用作干预的例子，所述干预能够增强血管生成物质从骨髓产生。本发明也涵盖了其它血管生成因子的用途，这是通过增强HIF-1活性(即，延长其半衰期)或者通过产生和HIF-1相似的效应，以刺激骨髓增加血管生成因子的表达。相似的方法涉及将自体骨髓暴露于内皮PAS域蛋白(endothelial PAS domain protein 1(EPAS1))。EPAS1和HIF-1共享高度结构同源性和功能同源性，也被称为HIF-2。
在根据本发明的另一种实施方案中，为了通过HIF-1增强VEGF启动子的活性，可以将骨髓细胞在体外培养中暴露于缺氧或者其它能量形式如，例如，超声、RF、或电磁能。本干预增加VEGF和其它基因的表达。通过此效应，其可以提高骨髓刺激血管生成的能力。因此，在本实施方案中，本发明涉及用HIF-1体外刺激抽吸的自体骨髓(或者增强HIF-1效应或产生HIF-1对骨髓的相似效应的产物)或者直接将骨髓暴露于缺氧环境，随后将活化的骨髓细胞或当细胞培养生长时，来自这些细胞的培养基输送至缺血心肌或外周器官(例如，缺血肢体)，以增强心脏和/或外周缺血组织中的侧支依赖性灌注(collateral-dependent perfusion)。
目前的数据提示了单核细胞来源的细胞因子对于增强侧支功能的重要性。单核细胞在侧支生长期间在体内被激活，单核细胞趋化蛋白(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)在体外通过剪切应力被上调。已经显示，在侧支血管生长(动脉血管形成(arteriogenesis))和毛细血管芽生(血管生成)期间，单核细胞粘附于血管壁。也已经显示，在家兔慢性后肢缺血模型中，在股动脉闭塞之后，MCP-1增强侧支生长(Ito等人，Circ Res 1997；80829-3)。在侧支生长以及毛细血管芽生(sprouting)中，单核细胞活化似乎起了重要作用。在试验性动脉闭塞7天之后，单核细胞经LPS的募集增加和毛细血管密度增加以及侧支和外周传导性增加相关联(Arms M.等人，J Clin Invest 1998；10140-50.)。
本发明的又一方面涉及由MCP-1体外刺激抽吸的自体骨髓，随后通过将活化的骨髓细胞或当细胞培养生长时，将来自这些细胞的培养基直接输送至缺血心肌或外周器官(例如，缺血肢体)，以增强心脏和/或外周缺血组织中的侧支依赖性灌注和肌肉功能。对骨髓的刺激可以通过将骨髓直接暴露于蛋白质形式的MCP-1，或者可以用带有MCP-1基因的载体转染骨髓细胞。例如，可以用携带MCP-1转基因的质粒载体或腺病毒载体转染骨髓或者来自骨髓的早期附着细胞。
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)是单核细胞成熟的刺激性细胞因子并且是多能造血生长因子，它被应用在临床实践上，用于多种造血病理学中，如白细胞数目减少(即，白细胞减少，粒细胞减少或者单核细胞减少)，其通常响应于免疫抑制或癌症患者的化学疗法而发生。GM-CSF也被描述为多谱系生长因子，在体外诱导集落形成，所述集落形成是从红系爆式集落形成单位(erythroid burst-forming units)、嗜伊红集落形成单位(colony-forming units(CSF))和多能(CSF)以及从粒细胞-巨噬细胞CSF和粒细胞CFU形成的(Bot F.J.，Exp Hetizato 1989，17292-5)。已经显示，体外暴露于GM-CSF诱导CD-34+祖细胞的快速增殖。(Egeland T.等人，Blood 1991；783192-g.)这些细胞具有分化为血管内皮细胞的潜能，并且可以天然地参与出生后血管生成。此外，GM-CSF在巨噬细胞/单核细胞增殖、分化、运动和存活(凋亡速度降低)中行使多重刺激效应。与对骨髓源的内皮祖细胞和单核细胞的联合的已知效应一致，本发明的又一方面是，应用GM-CSF作为自体骨髓注射的附加治疗，目的是诱导新血管在缺血心血管器官中的形成和分化。而且，GM-CSF可以进一步增强骨髓引起的治疗性心肌血管生成，这是通过增强骨髓的效应，或者通过进一步刺激骨髓实施的，GM-CSF是在体内或以外给予的，骨髓也受因子如HIF-1、EPAS1、缺氧或MCP-1刺激。
然而，当一些“危险”(at risk)情况占优势时，骨髓细胞可以不产生最佳的血管生成效应，所述骨髓细胞是为了增强血液输送至缺血区而被注射入需要侧支血管发育的区域的。例如，有证据证明，在高胆固醇血症存在时，血管生成受到损害，在衰老(aging)时其也受到损害。此外，存在许多遗传性疾病和其它疾病，损害天然发生的血管生成过程，这是和发现于正常青年健康个体中的血管生成过程相比而言的。目前也发现，在伴有衰老的高胆固醇血症存在下，和通过这种遗传性疾病和其它疾病，骨髓细胞的功能也受损，所述遗传性疾病和其它疾病损害天然发生的血管生成过程，这是和发现于正常青年健康个体中的血管生成过程相比而言的。
高胆固醇血症是显型遗传的遗传性病理状态，其导致显著增加的低密度脂蛋白胆固醇水平，这起始于出生时，并且导致较早年龄的心肌梗塞。“衰老”(aging)作为术语用于此处，它不一定用年龄来评定，而是根据机体在健康状况下维持血管系统能力的退化状态来评定。然而，机体维持血管健康的能力也趋向于随时间(即，随年龄)而退化。
试验证据提示，老年人脉管系统的侧支发育受损，老年人代表了受晚期动脉硬化影响的最大的患者群体。骨髓祖细胞(BMPCs)的功能和HIF-1活性均随衰老而降低。因此，损害侧支发育的所有的衰老相关因子(age-related factors)也将影响骨髓源细胞，如从老年患者重新得到并输送至他们的缺血组织的骨髓源基质细胞(MSCs)。随后是，老年患者的侧支形成受损，这部分是由于HIF-相关机制受损，和将发育中的侧支暴露于增加浓度的HIF-1-诱导细胞因子将增强侧支形成。
在另一方面，本发明认识到这些和其它“危险因子”(risk factors)的混合效应，和贯穿本申请方法进行描述，所述方法被设计为，增强这些功能上受损的骨髓细胞的血管生成潜能，这是通过用编码蛋白质的多核苷酸转导这些细胞实施的，所述蛋白质将增强这些受损骨髓细胞促进侧支血管发育的能力。存在几个另外的基因，其蛋白表达产物重要地增强受损骨髓细胞增强侧支血管形成的能力。例如，在另一种实施方案中，本发明提供了方法，用编码一种或几种一氧化氮合酶(NOS)的基因转化骨髓细胞。“NOS基因”作为术语用于此处，意味着任何已知的NOS异构体，包括诱导型NOS(iNOS)和内皮型NOS(eNOS)，以及已经被突变以致于其表达量被改变的NOS基因，或编码改变的蛋白的NOS基因，这两者中的任一导致更有效的血管生成效应。
用编码NOS的多核苷酸转导细胞的原理基于下列事实被鉴定为更有效的血管生成因子之一VEGF，是通过NOS信号通路起作用的。例如，已经显示，在NOS基因被敲除的小鼠中，VEGF不能诱导血管生成。而且，NOS的蛋白产物一氧化氮(NO)有多重作用，所述作用是诱导血管生成和此外，诱导许多不同基因表达，所述血管基因中的许多参与血管生成。因此，用NOS转染骨髓细胞，增加了骨髓细胞分泌多种血管生成细胞因子和生长因子的内在能力，并且也刺激多种血管生成-相关基因的表达。本发明也提供了这种NOS-转染的骨髓细胞，特别是ABM细胞，或当这些细胞培养生长时、来源于这些细胞的培养基。
本发明描述的另一基因家族是成纤维细胞生长因子(FGF)家族，其被描述为具有增强骨髓细胞增加侧支血管发育潜能的能力。此基因家族涉及超过十四个密切相关的基因，包括但不限于FGF1、FGF2、FGF4和FGF5。用FGF家族中的一个基因转导骨髓细胞的原理是，已知FGF是相关生成的有效刺激物，也能够刺激多种基因的表达，所述多种基因的蛋白表达产物中的许多也能够诱导血管生成。
因此，在又一种实施方案中，本发明提供了方法，用编码FGF肽家族之一的多核苷酸转染的骨髓细胞，增强骨髓细胞增加侧支血管发育的能力，如由于不同危险因子造成的增强血管生成能力受损的骨髓细胞，危险因子包括但不限于高胆固醇血症和衰老。本发明也提供了这种FGF-转染的骨髓细胞，特别是ABM细胞，或当这些细胞培养生长时、来源于这些细胞的培养基。
单核细胞/巨噬细胞表达的另一种基因PR39，是本发明描述的另一种基因，其被描述为能够增强骨髓细胞血管生成潜能以促进侧支形成。用编码此蛋白质的基因转导骨髓细胞的原理来源于下列事实PR39抑制HIF-α的蛋白酶体降解，导致小鼠体外血管结构加速形成并且增加心肌脉管系统。通过增加稳定状态的HIF-1α水平，异二聚体HIF-1α/HIF-β形成，它是诱导HIF-相关基因表达的转录因子。这些基因中的许多的蛋白产物促进血管生成的发展。此策略的原理—增加稳定状态的HIF-1α水平—详细描述于上文。在又一种实施方案中，本发明也提供了这种PR39-转染的骨髓细胞，特别是ABM细胞，或当这些细胞培养生长时、来源于这些细胞的培养基。
例如，可以用质粒载体或腺病毒载体体外转染从一个对象收集来的ABM细胞，所述载体携带血管生成细胞因子生长因子或哺乳动物相关生成促进因子转基因，如HIF-1或EPAS1转基因、或编码PR39或NOS或FGF家族成员的转基因，如此处所描述，当转染的细胞或被注射入治疗位点时，或当这些细胞培养生长时、来自这些细胞的培养基被注射入治疗位点时，在细胞中和/或对象中表达所述转基因。
然而，新鲜的骨髓细胞(fresh bone marrow)或溶液中的骨髓细胞难于用编码此处描述的治疗性细胞因子、生长因子和血管生成促进因子的载体转染。为了克服此困难，发现了下列效应当骨髓细胞在容器中生长足够时间段，允许来自骨髓的早期附着细胞粘附于容器并且选出早期附着细胞用于转染时，可以体外(例如，在培养中)被携带转基因的载体转染的骨髓细胞被大大增加了。“早期附着细胞(earlyattaching cell)”作为术语应用于此，意味着细胞，来自含有骨髓的培养基或来自种植(seed)于容器中的骨髓细胞，其在合适的培养条件下生长大约8小时(例如，过夜)至大约24小时之后，不被洗掉。早期附着细胞大多数是单核细胞、内皮前体细胞、或其它造血系细胞。接种发生于培养细胞几小时时期之后，接种的细胞在大约12小时至3天之后开始产生转基因产物。可以用编码一种或多种血管生成细胞因子、生长因子和/或促进哺乳动物细胞中血管生成的因子的载体接种早期附着细胞，这是应用本领域中的任何已知方法实施的，例如通过在接种之后体外接触大约2小时至大约3天的时期。应用的载体可以选自本领域已知的任何载体，包括但不限于此处描述的那些。在制备细胞用于给予患者之前，在接种之后大约2小时至大约3天，载体(例如，病毒或质粒)通常被洗掉。
任选地，在放入培养物之前过滤ABM，以去除大于大约300μ至大约200μ的颗粒。也可以从过滤的ABM中分离骨髓细胞，用于在容器中生长，导致生成早期附着细胞。合适的培养条件在本领域是已知的，包括但不限于描述于此处的实施例中的那些。
用于根据本发明方法转染骨髓早期附着细胞的合适的转基因包括但不限于，那些编码这些血管生成促进剂如HIF-1、EPAS1(也称为HIF-2)、MCP-1、CM-CSF、NOS、FGF和类似物质的那些基因。有效量的来自如此处描述而制备的骨髓细胞的转染的早期附着细胞可以被直接给予(即，注射入)患者的所需位点，以在患者的所需位点增强侧支血管形成。用于给予细胞的特别有效的部位包括心肌或骨骼肌，如在腿上，以增强心脏和/或外周缺血组织中的侧支依赖性灌注，所述给予的细胞是用血管生成促进因子转染的。细胞或来自这种细胞的培养基也可以被注射入血管系统，以致于它们经血液被输送至所需部位。
在用于获得骨髓细胞的增加的转染效率的本发明方法的非限制性例证中，进行了下列研究如上所述，用腺病毒载体中的X-gal转基因转染骨髓早期附着细胞。在这些研究中，在转染之后用X-gal对转染的细胞染色合适的一段时期显示，和用非-粘附的骨髓细胞(non-adherent bone marrow cell)或新鲜的骨髓相比，骨髓早期附着细胞对转染的敏感度实质上被增加。
编码治疗蛋白的多核苷酸可以是“功能上附加于”(functionallyappended to)或“可操纵地相关于”(operatively associated with)信号序列，所述信号序列可以“转运”(transport)编码产物穿过细胞膜。多种这样的信号序列是已知的，和可以被本领域的技术人员应用而无需过多的试验。
预期用于这种目的的基因转移载体(也称作“表达载体”(expression vectors))是重组的核酸分子，被用于转运核酸进入宿主细胞，用于其表达和/或复制。表达载体可以是环状的或是线性的，能够在其中并入多种核酸构建体。表达载体典型地以质粒的形式出现，其在导入合适的宿主细胞后，导致插入的核酸表达。
已经开发出用于基因治疗的合适病毒载体，用于特殊的宿主系统中，特别是哺乳动物系统，包括例如，反转录病毒载体、其它慢病毒属(lentivirus)载体如那些基于人类免疫缺陷病毒(HIV)的载体、腺病毒载体、腺相关病毒(adeno-associated virus)载体、疱疹病毒载体、天花病毒载体和类似载体(参见Miller和Rosman，Bio Techniques 7980-990，1992；Anderson等人，Nature 39225-30 Suppl.，1998；Verma和Somia，Nature 389239-242，1997；Wilson，New Engt.J.Med.3341185-1187(1996)，每一文献在此并入，作为参考)。优选的基因转运载体是复制缺陷型腺病毒，其携带cDNA以影响对象的侧支动脉发育，所述对象遭受进行性冠状动脉闭塞(progressive coronary occlusion)(Barr等人，″PCGT Catheter-Based Gene Transfer Into the Heart UsingReplication-Deficient Recombinant Adenoviruses，″Journal of CellularBiochemistry，增刊17D，195页，摘要101页(1993年3月)；Barr等人，″Efficient catheter-mediated gene transfer into the heart usingreplication-defective adenovirus，″Gene Therapy，卷151-58(1994))。总之，所需基因可以被转移至心脏(或骨骼肌)，包括心肌细胞(和骨骼肌细胞)，在体内和直接构成编码蛋白的产物。
几种不同的基因转移方法是可行的，包括辅助因子-依赖的复制缺陷型人腺病毒5系统(helper-independent replication deficient humanadenovirus 5 system)。基于人腺病毒5的重组腺病毒载体(Virology 163614-617，1988)缺失了来自腺病毒基因组的基本上早期的基因(essentialearly genes)(通常是E1A/E1B)，和从而如果不生长在反式提供缺失的基因产物的允许细胞系(permissive cell lines)中，就不能复制。替代缺失的腺病毒基因组序列，所需的转基因可以在用复制缺陷型腺病毒感染的组织/细胞中被克隆和表达。尽管基于腺病毒的基因转移不导致转基因整合入宿主基因组(少于0.1％的腺病毒-介导的转染导致转基因并入宿主DNA)，从而不稳定，但腺病毒载体可以以高的滴度增殖并充分转染非复制型细胞(non-replicating cells)。
根据被治疗个体的需要，本领域的技术人员可以变化导入宿主生物体、细胞或细胞系统的外源性核酸的量。例如，当应用病毒载体进行基因转移时，可以改变导入欲被转染的细胞的核酸的量，这是通过改变病毒载体的噬斑形成单位(plaque forming units(PFU))的量实施的。
在根据本发明的又一种实施方案中，提供了方法，用于增强所需对象的侧支血管形成，这是通过从患者获得ABM；使ABM在合适的培养条件下在容器中生长一段时间，所述时间足以促进早期附着细胞由骨髓形成，早期附着细胞粘附于容器。用此处描述的载体如上所述在培养物中(即，体外)转染早期附着细胞，所述载体含有编码一种或多种因子的多核苷酸，所述因子选自血管生成细胞因子、生长因子和哺乳动物血管生成促进因子和类似物质，然后，将处理的(即，被转染了的)早期附着细胞(和/或培养基，早期附着细胞在转染后被培养于所述培养基中)直接给予患者的所需部位，以致于向该部位输送表达的因子。例如，在一种实施方案中，血管生成促进剂可以短暂表达于对象中，所述对象被注射了转染细胞，从而输送治疗性血管生成促进因子或其联合物到达缺血部位并导致患者的给予部位的侧支血管形成增强。
如此处所应用，短语“骨髓源基质细胞”(marrow-derivedstromal cells)意味着CD34阴性/CD45阴性早期附着细胞，其可以从骨髓样品中得到。
如此处所应用，短语“转录调节区”(transcription regulatoryregion)是指控制mRNA转录起始的核酸或基因构建体部分。预期用于此处的调节区，在不存在非哺乳动物反式激活因子时，典型地含有至少一个最小的启动子，和响应于配体/受体肽复合物的调节元件相结合。最小的启动子，当结合于调节元件时，起到响应于配体/功能性二聚体复合物而起始mRNA转录的作用。然而，如果所需的诱导物(其配体)不存在，转录将不发生。然而，如此处所描述，甚至在DNA结合域的配体不存在时，本发明的一些嵌合蛋白异二聚体激活或抑制mRNA转录。
如此处所应用，短语“可操纵地相关于”(operatively associatedwith)是指DNA和调节序列和效应序列的核苷酸如启动子、增强子、转录和翻译终止位点和其它信号序列在功能上的关联。例如，DNA和启动子的可操纵连接是指，DNA和启动子之间的物理上和功能上的关联，以致于特异地识别、结合并转录DNA的RNA聚合酶起始此DNA从启动子转录。
优选地，转录调节区进一步包括遍在转录因子(ubiquitoustranscription factor)的结合位点。这种结合位点优选地位于启动子和调节元件之间。用于此处的合适的遍在转录因子在本领域是已知的，包括例如，Sp1。
代表性的真核表达载体包括真核构建体，如pSV-2 gpt系统(Mulligan等人，(1979)Nature，277108-114)；PBLUESKRIPT载体(Stratagene，La Jolla，CA)，Genetics Institute描述的表达克隆载体(expression cloning vector)(Science，(1985)228810-815)，和类似载体。这些质粒载体中的每一个都能够促进所需蛋白质的表达。
在一种特殊的实施方案中，预期应用于此的基因转移载体是裸质粒(naked plasmid)，病毒载体如基于腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒的载体，用于基因治疗的合成载体(synthetic vector)，和类似载体(参见，例如Suhr等人，Arch.of Neurol.501252-1268，1993)。例如，用于此处的基因转移载体可以是反转录病毒载体。预期用于此处的反转录病毒载体是基因转移质粒，其带有表达构建体，所述构建体含有外源性核酸，位于两个反转录病毒LTRs之间。反转录病毒载体典型地含有合适的包装信号，使反转录病毒载体或用该反转录病毒载体为模板转录的RNA，在合适的包装细胞系中被包装入病毒颗粒(参见，例如，美国专利4,650,764)。
用于此处的合适的反转录病毒载体描述于，例如，美国专利5,399,346和5,252,479；和WIPO出版物WO 92/07573、WO 90/06997、WO 89/05345、WO 92/05266和WO 92/14829中，每一文献以其整体在此并入作为参考。这些文件提供了对方法的描述，所述方法用这种反转录病毒载体有效地将核酸导入人细胞。其它反转录病毒载体包括，例如，小鼠乳腺瘤病毒载体(例如，Shackleford等人，(1988)PNAS，USA，859655-9659)，人类免疫缺陷病毒(例如，Naldini等人(1996)Science272165-320)，和类似载体。
本领域中也公知各种方法，用于提供辅助细胞(helper cells)，所述辅助细胞产生反转录病毒载体颗粒，其基本上不含有复制的病毒(replicating virus)。参见，例如，美国专利4,650,764；Miller，Human GeneTherapy，15-14，1990；Markowitz等人，Journal of Virology，61(4)1120-1124，1988；Watanabe等人，Molecular and Cellular Biology，3(12)2241-2249，1983；Danos等人，PNAS，856460-6464，1988；和Bosselman等人，Molecular and Cellular Biology，7(5)1797-1806，1987，其公开了方法，用于产生病毒载体和辅助细胞，辅助细胞使产生含有复制病毒的病毒载体的机会最小化。
适于和多核苷酸包装的反转录病毒，是应用公知的生成反转录病毒颗粒的方法产生的，所述多核苷酸编码治疗性蛋白如血管生成生长因子。参见，例如，美国专利4,650,764；Miller，见上1990；Markowitz等人，见上1988；Watanabe等人，见上1983；Danos等人，PNAS，856460-6464，1988；和Bosselman等人，Molecular and CellularBiology，7051797-1806，1987。
在下面的实施例中，阐述了根据本发明方面的一些检测。这些实施例不是限制性的。
实施例实施例1培养骨髓的培养基对内皮细胞增殖的效应 进行研究，确定获得的抽吸的猪自体骨髓细胞是否分泌VEGF，一种有效的血管生成因子，和MCP-1，其近来被鉴定为重要的血管生成辅助因子。体外培养骨髓四周。向培养的猪主动脉内皮细胞(PAECs)中加入条件培养基，四天后评定增殖情况。用ELISA分析条件培养基中的VEGF和MCP-1水平。在培养四周期间，BM细胞分泌VEGF和MCP-1，以致于它们的浓度以时间相关的方式增加。得到的培养基以剂量相关的方式增强PAECs的增殖。结果提示，BM细胞能够分泌有效的血管生成因子如VEGF和MCP-1，并且能够诱导血管内皮细胞增殖。
猪骨髓培养 在无菌条件下从患有慢性心肌缺血的猪采集骨髓(BM)细胞，置于无防腐剂的肝素(20units/ml BM cells)中，并用300μ和200μ的不锈钢网孔过滤器过滤。然后，经Ficoll-Hypaque梯度离心分离BM细胞并将其在长期培养基(long-term culture medium(LTCM))中(Stem CellTech，Vancouver，British Columbia，Canada)培养，温度是330℃，T-25培养瓶中带有5％的CO2。BMCs在每一培养物中的种植密度是7×106/ml。每周去除一半培养基，替换为新鲜的LTCM。将去除的培养基过滤(O.2μ过滤器)并保存在-200℃，用于随后的酶联免疫吸附实验(ELISA)和细胞增殖分析。
分离和培养猪主动脉内皮细胞 用常规方法分离新鲜的猪主动脉内皮细胞(PAECs)。内皮细胞生长培养基(EGM-2培养基，Clonetics，San Diego，CA)，其含有2％FBS、氢化可的松、人FGF、VEGF、人EGF、IGF、肝素和抗生素，于37℃，带有5％的CO2。当细胞在大约7天时开始会合时，用2.5％的胰蛋白酶将其分离，其后将其培养在带有10％FBS的培养基199中。通过典型的内皮细胞形态学和通过对因子VIII的免疫组织化学染色，证实它们的身份。传代3-10次，用于增殖研究。
条件培养基对主动脉内皮细胞的效应 细胞增殖分析经胰蛋白酶消化作用从培养瓶中移除PAECs(传代3-10次)。将分离的细胞转移至96孔培养板上，以5,000个细胞/孔的种植密度铺板。在用于增殖和DNA分析试验之前培养细胞2-3天。在4周时收集BM细胞培养物的条件培养基，合并来自7个培养瓶的培养基，用于生物分析。以三倍量将合并的条件培养基的等分试样(10μl、30μl、100μl或200μl)，或LTCM(200μl，作为对照)加入96孔板中的会合的PAECs中。用条件培养基或对照培养基培养四天后，胰蛋白酶消化PAECs，用细胞计数器(Coulter Counter BeckmanCorporation，Miami FL)计数细胞。
条件培养基对PAEC DNA合成的影响 以三倍量将来自合并样品的条件培养基的等分试样(10μl、30μl、100μl或200μl)或对照培养基(LTCM，200μl)加入96孔板中的PAECs(和上述相同的种植密度)。2天后，向每孔加入1μCi的氚标记的胸腺嘧啶核苷。48小时后，用细胞收集器(Mach III M Tomtec，Hamden，CT)采集PAECs中的DNA，用液体闪烁计数器(Multi-detector LiquidScintillation Luminescence Counter EG&G Wallac，Turku，Finland)计数放射活性。
通过ELASA VEGF测定条件培养基中的VEGF和MCP-1 用夹心ELISA试剂盒(Chemicon International Inc.，Temecula，CA)测定VEGF在条件培养基中的浓度。简言之，将用抗人VEGF抗体预包被的平板用于结合条件培养基中的VEGF或已知浓度的重组VEGF。通过生物素化的抗VEGF抗体检测复合物，所述生物素化抗体结合于捕获的VEGF。用链亲和素-碱性磷酸酶和显色液反过来检测生物素化的VEGF抗体。抗人VEGF抗体和猪VEGF交叉反应。
用ELISA测定条件培养基中的MCP-1 用夹心酶联免疫分析试剂盒(R & D Systems，Minneapolis，MN)分析条件培养基中的MCP-1浓度将用抗人MCP-1抗体预包被的平板用于结合条件培养基中的MCP-1或已知浓度的重组蛋白。用生物素化的抗MCP-1抗体检测复合物，所述生物素化的抗体结合于捕获的MCP-1。用链亲和素-碱性磷酸酶和显色液反过来检测生物素化的MCP-1抗体。抗人MCP-1抗体和猪MCP-1交叉反应。
结果 在4周时收集的BM条件培养基以剂量相关方式增加PAECs的增殖(图1)。这通过直接计数细胞数量和通过测定氚标记的胸腺嘧啶核苷的吸收而证实(两种测定方法均为p＜0.001)。剂量相关反应证实了降支；与30μl和100μl相比，200μl条件培养基的增殖被降低(两个比较均为P＝0.003)。在氚标记的胸腺嘧啶核苷的吸收研究中观察到相似的剂量相关结果(和200μl相比，30μl和100μl分别是P＝0.03)。
限制数目(5±4％)的新鲜抽吸的BM细胞对因子VIII染色呈阳性。结果在图2中列出。这对照于培养4周的BM细胞粘附层，其值是57±14％，BM细胞粘附层中的60±23％是内皮样细胞，40±28％似乎是巨核细胞。
在4周时期期间，BM条件培养基中的VEGF和MCP-1浓度分别逐渐增加至第一周水平的10倍和3倍(两个比较均为P＜0.001)(图3)。与之对照，未暴露于BM的对照培养基中的VEGF和MCP-1水平，分别是0和11±2pg/ml，如图4所示。
实施例2缺氧对培养的猪骨髓细胞分泌VEGF的影响 证实了缺氧显著增加VEGF经培养的骨髓内皮细胞的表达，结果提示，体外暴露于缺氧，通过增加缺氧诱导的血管生成因子的表达，可以进一步增加欲在缺血肌肉组织中注射的骨髓细胞及其条件培养基的侧支增强效应。采集猪骨髓并用300μ和200μ的不锈钢网孔过滤器连续过滤。然后用Ficoll-Hypaque梯度离心分离BMCs并在33℃培养，T-75培养瓶中的CO2是5％。当细胞在大约7天发生会合时，它们经胰蛋白酶消化1∶3分离。培养4周之后，将BMCs或是暴露于缺氧条件(放置在含有1％氧的舱内)24至120小时，或是维持在正常条件下。收集得到的条件培养基，经ELISA分析VEGF、MCP-1。
暴露于缺氧显著增加VEGF分泌在24小时，VEGF浓度从常氧下的106±13pg/ml增加至缺氧条件下的1,600±196pg/ml(p＝0.0002)；120小时之后，其从4,163±62增加至6,028±167pg/ml(p＜0.001)。在新鲜分离的BMCs中进行了分别的研究，发现了相同趋势。缺氧也减慢了BMCs的增殖速度。MCP-1表达不随缺氧增加，这不是出乎意料的发现，原因是已知其启动子没有HIF结合位点。
实施例3骨髓培养基对内皮细胞管道形成的效应 证明了，用猪内皮细胞和血管平滑肌细胞共培养技术，骨髓细胞的条件培养基诱导结构血管管道在体外形成。在不暴露于骨髓条件培养基时，没有观察到对血管管道形成的这种效应。结果提示，骨髓细胞和它们分泌的因子发挥了促血管生成(pro-angiogenic)效应。
实施例4在慢性心肌缺血模型中，经心脏内输送自体骨髓对侧支灌注和局部功能的影响 通过在冠状动脉左回旋支周围植入渐进性缩窄器(ameroidconstrictors)，在14头猪中造成慢性心肌缺血。植入4周后，7个动物经历用经心内膜(transendocardial)注射导管将新鲜抽吸的ABM经心内膜注射入缺血区(每个动物2.4ml，在12个位点注射)，7个对照动物用肝素化的盐水注射。在基线和4周之后，动物经历静息和起搏超声心动图(rest and pacing echocardiogram)评价局部收缩性(心肌肥厚的％)，微球体研究(microsphere study)评价静息时和腺嘌呤核苷输注期间的侧支依赖性灌注。注射ABM 4周之后，在ABM处理的猪中侧支血流(表示为缺血区/正常区的比值×100)改善，但是在对照组中不改善(ABM静息时95±13对81±11，P＝0.017；腺嘌呤核苷输注期间85±19对72±10，P＝0.046；对照组静息时86±14对86±14，P＝NS；腺嘌呤核苷输注期间73±17对72±14，P＝0.63)。相似地，ABM处理的猪中收缩性增加，但是在对照组中不增加(ABM静息时83±21对60±32，P＝0.04；起搏期间91±44对35±43，P＝0.056；对照静息时69±48对64±46，P＝0.74；起搏期间65±56对37±56，P＝0.23)。
结果提示，基于导管经心内膜注射ABM可以增加缺血心肌的侧支灌注和心肌功能，所见提示，本方法可以构成新的治疗策略，用于获得最佳的治疗性血管生成。
将14头无特殊病原体(specific-pathogen-free)的重量大约是70kg的家猪麻醉、插管，和贯穿手术过程接受补充的O22L/分钟以及1-2％异氟醚吸入。通过右股动脉分离并插入8French的鞘，介入动脉。通过左侧胸廓切开术分离左回旋动脉，在动脉的极近端部分植入包有金属的(metal encased)渐进性缩窄器。渐进性缩窄器植入4周后，所有的猪经历(1)选择性的左冠状血管造影术和右冠状血管造影术，用于验证渐进性闭塞(ameroid occlusion)和评价侧支血流；(2)经胸超声心动图研究；和(3)局部心肌血流分析。
骨髓抽吸和制备以及心肌内注射 完成基线评估之后即刻，所有的动物经历用标准技术从左股骨干的BM抽吸。应用无防腐剂的肝素化玻璃注射器(20单位肝素/1ml新鲜BM)，BM来自抽吸的2个位点(每个位点3ml)。用300μ和200μ的不锈钢过滤器，立即连续粗过滤(macro-filtered)吸出的骨髓。然后，用经心内膜注射导管在12个位点将骨髓注射入心肌(每个注射位点0.2ml，共2.4m1)，所述位点涉及缺血心肌区域及其边界区。
超声心动图研究 在基线和起搏期间，在基线和ABM植入后4周的追踪评价(follow-up evaluation)期间，记录动物在中乳头肌水平处的经胸超声心电图成像短轴和长轴视图。通过测定壁增厚百分数(收缩末期厚度减去舒张末期厚度/舒张末期厚度)×100得到短轴缩短率(fractionalshortening)的测定值。这些测定值是从缺血区(外侧区lateral area)和远部区域(隔前区anterior-septal area)得到的。随后，经右股静脉鞘插入临时起搏器电极，定位在右心房。使动物心率起搏为180次/分钟，持续2分钟，同时记录超声心动图成像。
局部心肌血流 用多重荧光显色微球体(multiple fluorescent coloredmicrospheres)(Interactive Medical Technologies，West Los Angeles，CA)，在静息时和冠脉舒张最大时进行局部心肌血流测定，并且通过参照样品技术(reference sample technique)(Heymann MA，et a1.，ProgCardiovasc Dis 1977；2055-79)定量。经6F Judkins left 3.5诊断导管，将荧光微球体(0.8ml，5×106微球体/ml，在带有0.01％吐温80的生理盐水悬浮液中的直径是15μm)注射入左心房。最大冠脉舒张是通过输注腺嘌呤核苷诱导的，输注为恒定速度140μg/kg/分钟(Fujisawa USA，Deerfield，IL)，在6分钟期间进入左股静脉。在输注的最后2分钟期间，以和静息研究的相同方式，进行微球体注射和血液参照抽取(bloodreference withdrawal)。
灌注评价完成之后，用过量的戊巴比妥钠和KCL处死动物。获取心脏，用Ringer Lactate冲洗，灌注固定10-15分钟，随后用10％缓冲的甲醛浸泡固定3天。固定完成之后，沿短轴将心脏切割为7mm厚的切片。将2个中央的切片中的每一个分为8个相似大小的楔形物，进一步将其切割为心内膜和心外膜亚段。用平均8个外侧部缺血区和8个间隔正常区(septal normal zone)亚段的测定值来评价心内膜区和心外膜区的心肌血流。相对的侧支血流也被计算为缺血区/非缺血区(IZ/NIZ)血流的比值。
组织病理学 为了评价通过应用注射导管来注射BM抽吸物是否和机械性细胞损伤相关，在用和体内研究相似的注射压力推入新鲜过滤的ABM抽吸物之前和之后，制备标准的BM涂片。由独立的有经验的技术人员进行形态学评价，所述技术人员不知道本研究方案。
对样品心脏组织进行组织病理学评价。在初步研究中，在UV光下检查7mm厚的短轴切片，以鉴定荧光标记的区域。将每一被鉴定的区域切割为3个完整厚度的相邻的块(中央，右侧和左侧)，将其浸泡固定在10％的缓冲甲醛中。随后，将每一这样的块切为3个水平，其中2个用苏木精和伊红(H&E)染色，一个用PAS染色。此外，从每一心脏的缺血区获得一个新鲜荧光标记的组织块，包埋入OCT化合物(Sakura Finetek USA Inc.，Torrance，CA)并在液氮中冷冻。将这些骤冷心肌组织的冷冻切片在空气中干燥，用丙酮固定。用自动Dako免疫染色仪(Dako，Carpenteria，CA)进行免疫过氧化物酶染色(Immunoperoxidasestain)。用3％过氧化氢酶和10％的卵清蛋白封闭内源性过氧化物酶和非特异性吸收。用抗CD-34单克隆小鼠抗体(Becton Dickinson，San Jose，CA)作为一抗。连接抗体是生物素化的山羊抗小鼠IgG抗体，三抗是和辣根过氧化物酶连接的链亲和素。用二氨基联苯胺(DAB)作为发色原，并用1％的甲基绿复染切片。脱水和透明之后，封片并用Nikon Labphot显微镜检查切片。
在功效研究中，将来自缺血区和非缺血区的完整厚度的1.5平方厘米的切片进行石蜡切片，用H&E、Masson氏三色染色(Masson′strichrome)和因子VIII相关抗原对每一样本染色。将免疫过氧化物酶染色的切片用于研究内皮细胞群的密度和血管化。后者通过存在管腔而区分于前者。用来自缺血和/非缺血心肌内侧半部的5个因子VIII染色切片的显微照片样品评价血管状态。用相同显微照片数字成像评价内皮细胞的密度。用阈强度法(intensity threshold method)，用Sigma-ScanPro形态学测定软件确定内皮细胞群的密度。每一样本(sample)和每一样品(specimen)的总内皮面积随同相对的内皮面积百分数(内皮面积/研究的心肌的面积)一同获得。总内皮面积也被计算为，研究的心肌的非梗塞(能存活的)面积的相对百分数。将三色染色的切片数字化，用Sigma-Scan Pro测定蓝染胶原蛋白占有的面积以及除心外膜占据面积之外的切片的总面积。然后，将梗塞面积计算为蓝染占有的面积。
操作数据(Procedural Data) 用ABM或安慰剂进行的心肌内注射和平均血压、心率的任何急性变化或心律失常的导入均不相关。在两组之间，所有的血液动力学参数是可以比较的(comparable)。配对比较显示了和追踪过程相比相似的血液动力学参数指标，除了对照组中追踪时的较高起始平均动脉压(p＝0.03)，其在起搏或腺嘌呤核苷输注期间没有随后变化。
心肌功能 局部心肌功能评价显示于下面的表I中。预干预相关的梗塞壁肥厚，表示为静息时和起搏期间缺血区与非缺血区(IZ/NIZ)的比值x100，在两组间是相似的(分别是P＝0.86和0.96)。心肌内注射ABM 4周后，在静息时和起搏期间发生局部壁增厚的改善，这是由于侧支依赖的缺血侧壁的壁增厚增加了约50％。尽管在追踪时的起搏期间在缺血区观察到了壁增厚改进的趋势，在对照动物中没有观察到显著的变化。
表I.缺血壁的局部收缩性
ABM是指自体骨髓(autologous bone marrow)心肌灌注数据 局部心肌灌注评价显示于下面的表II中。在静息时和腺嘌呤核苷输注期间，预干预相关的透壁心肌灌注、IZ/NIZ在处理组和对照组之间没有差异(分别是P＝0.42和0.96)。ABM注射4周后，静息和起搏期间的相对局部透壁心肌灌注显著改进。这是由于静息(增加75％，P＝0.08)和腺嘌呤核苷输注期间(37％，P＝0.09)缺血区心肌灌注的绝对改善，而在静息(增加35％，P＝0.18)或腺嘌呤核苷输注期间(增加25％，P＝0.26)在非缺血区没有观察到绝对血流的显著变化。在静息时，见于缺血区的局部心肌血流增加由心内膜(73％)和心外膜(62％)的改善构成，在腺嘌呤核苷输注期间有一些较小的改善(两个区均为40％)。在4周时，和预干预值相比，对照组在缺血区和非缺血区的透壁、心内膜或心外膜灌注上没有差异。
表II.局部心肌灌注
ABM是指自体骨髓组织病理学和血管状态评价 评价过滤的抽吸物通过注射导管之前和之后的BM涂片揭示了正常结构，没有大的聚集物和没有细胞碎片或扭曲细胞形状的证据。注射后1天的组织病理学揭示了急性损害，其特征是纤维蛋白和具有分散细胞浸润的炎症通路(inflammatory tract)。浸润物被表征为单核细胞，其在形态学上无法和BM浸润物区分开来。细胞构成(cellularity)在3天和7天达到最大，随后经时间而衰退。在3周时，和0.2ml相比，0.5ml注射位点处看到更多的纤维化。在显示出最大细胞浸润的切片中进行CD34免疫染色，该染色被设计为鉴定来源于BM的祖细胞。总之，估计4-6％的细胞浸润物对CD34显示阳性免疫活性。
占据全部＜10％的检测缺血心肌的小面积的斑状坏死在两组中均表征了缺血范围。非缺血区显示了正常心肌结构。比较两组的组织形态学特征的变化。任意血管占据的总面积以及直径＞50μm的血管数目没有差异。然而，在两组间，缺血区域对非缺血区域的因子VIII染色阳性的总面积(带有管腔和不带有管腔的内皮细胞)的比较显示了差异。在ABM组中，缺血的侧支依赖区的内皮细胞总面积比非缺血区观察到的总面积高100％(11.6±5.0对5.7±2.3％面积，P＝0.016)，而对照组中没有显著差异(12.3±5.5对8.2±3.1％面积，P＝0.11)。然而，在两组的缺血和非缺血区，血管状态的其它参数，包括任意血管占据的面积百分数和＞50μm的血管数目是相似的。
实施例5在心肌缺血动物模型中，通过预给予GM-CSF体内刺激的骨髓细胞的效应 通过在冠状动脉左回旋支周围植入渐进性缩窄器，在16头猪中造成慢性心肌缺血。渐进性缩窄器植入4周减3天后，8个动物经历皮下注射GM-CSF连续3天(剂量是每日10μg)，随后(在第4天和渐进性缩窄器植入后恰好4周)用经心内膜注射导管将新鲜抽吸的ABM经心内膜注射入缺血区(每个动物2.4ml，在12个位点注射)，不用GM-CSF刺激的8个对照动物用肝素化的盐水注射。在基线和4周之后，动物经历静息和起搏超声心动图评价局部收缩性(心肌增厚的百分数)，微球体研究评价静息时和腺嘌呤核苷输注期间的侧支依赖性灌注。注射ABM 4周之后，在ABM处理的猪中侧支血流(表示为缺血区/正常区的比值×100)改善，但是在对照组中不改善(ABM静息时85±11对72±16，P＝0.026；腺嘌呤核苷输注期间83±18对64±19，P＝0.06；对照组静息时93±10对89±9，P＝0.31；腺嘌呤核苷输注期间73±17对75±8，P＝0.74)。相似地，ABM处理的猪中收缩性增加，但是在对照组中不增加(ABM静息时93±33对63±27，P＝0.009；起搏期间84±36对51±20，P＝0.014；对照静息时72±45对66±43，P＝0.65；起搏期间70±36对43±55，P＝0.18)。
结果提示，基于导管经心内膜注射ABM，所述ABM通过系统给予GM-CSF 3天在体内被预刺激，可以增加缺血心肌的侧支灌注和心肌功能，所见提示，本方法可以构成新的治疗策略，用于获得最佳的治疗性血管生成。
实施例6人类患者的治疗 在心脏手术起始之前大约60分钟时，用无防腐剂的肝素化玻璃注射器(20单位肝素/1ml新鲜BM)，从髂嵴抽吸骨髓(约5ml)。立即用300μ和200μ的不锈钢网孔过滤器连续粗过滤抽吸的骨髓。有经验的血液病学家将在无菌条件下实施该过程。评价骨髓涂片以证实骨髓制备物的正常组织形态学。
可以应用向心肌输送制剂的几种过程中的任意。这些包括直接经心外膜输送，如可以用手术方法实施(例如但不限于，经胸壁切开或经胸壁插入针或其它输送设备，或通过胸腔镜)，或通过几种经皮操作中的任意。下面是经皮输送的一个例子。应该强调的是，下面的例子不意味着，将输送的选择限制为例子中描述的具体的基于导管的平台系统一可以应用任何基于导管的平台系统。
应用标准的经皮冠状动脉成形术操作，将至少SF的导入鞘(introducer sheath)插入右股动脉或左股动脉。插入动脉鞘之后，贯穿手术的LV描记和ABM移植部分，给予肝素并随需要而补充，维持ACT200-250秒。在手术期间不长于30分钟的间隔处，以及在手术结束时，检查ACT，以检验本要求的一致性。
在标准的RAO和/或LAO视图中，进行左心室造影术以协助引导NOGA-STARTM和注射导管，用NOGA-STARTM导管得到LV电-机械图。8F INJECTION-STAR导管以倒退(retrograde)方式经股动脉鞘放置于主动脉瓣。完全末端偏转(full tip deflection)之后，将圆形的远侧末端轻轻地穿过主动脉瓣下垂，一旦位于LV腔内，将其适当地伸直。
使导管(并入了电磁末端传感器)的方向为定位在处理区之一(例如，前部、侧部、下后部或其它部位)。利用NOGATM的安全性质，仅当稳定信号证实LS值＜3时，使针插入并注射。单独注射0.2cc新鲜抽吸的ABM，将通过经心内膜途径输送至多达两个处理区的范围，在两个注射位点之间不近于5mm。注射位点的密度将取决于个体对象的LV心肌内解剖情况和在心内膜表面获得稳定定位，而没有导管移动或室性期前收缩(PVCs)的能力。
移植入缺血心肌的新鲜抽吸的ABM和侧支血流改善相关而没有副作用，这由于几个原因而在临床上有重要意义。上面描述的方法学利用了骨髓以有效和明显安全的方式诱导局部血管生成反应的天然能力。这种血管生成策略可能比目前处于试验中的许多其它策略的花费低。它也避免了潜在的毒性相关问题，所述问题是应用病毒载体用各种基于基因方法带来的轻微的问题，但是有明确的可能性。
本发明基于这样的概念ABM是细胞的最佳来源(一个例子是内皮祖细胞，但是本发明不限于这种细胞，原因是骨髓中的许多其它细胞可以非常有助于血管生成效应)和分泌，例如，血管生成生长因子，它是在转移至另一组织如缺血心脏或外周肢体时需要，以促进新血管生长和重建功能的因子。患者的自体骨髓可以被用作关键的治疗来源，用以在缺血组织诱导治疗性血管生成和/或肌生成，所述缺血组织例如心肌和/或缺血肢体处，其由于动脉闭塞血液灌注受损。抽吸患者的自体骨髓，即ABM捐赠物，如此处所描述地处理，并直接注射入缺血和/或相邻的非缺血组织，例如，心肌和/或缺血肢体，以促进血管生长。
通过应用或是基于导管的经心内膜注射方法，或是外科(开胸或通过胸腔镜检查)经心外膜胸廓造口术方法，将ABM注射入心脏肌肉，例如心肌。可以用这两种输送策略获得相同的治疗目的，这是通过促进血管生成骨髓因子(elements)在靶器官组织例如心肌和/或缺血肢体并入和整合。
根据本发明，给予有效量的ABM、骨髓细胞或用血管生成促进因子转染的骨髓细胞，用于治疗。有经验的实施者将理解的是，给予的量将取决于许多因素，包括但不限于，意图的疗法、被治疗的病理状态的严重程度、欲被治疗的面积的大小和范围等等。关于根据本发明的治疗，代表性的方案将是，在从大约12至大约15次注射中的每一次中，给予从大约0.2至大约0.5ml的ABM量，给予的ABM总计是从大约2.4至大约6ml。给予的每一剂量将优选地包括从大约1至大约2体积百分比的肝素或其它血液抗凝剂如华法林钠。当ABM被培养或刺激和/或和其它药物或类似物联合给予时，每次剂量中存在的ABM量将大约相同，和/或给予的总ABM将和上述量大约相同。认为每次治疗中给予的ABM细胞总数将类似于从大约107至5×108。
在本发明的另一种实施方案中，血管生成因子基因表达的最大化可以通过共同给予血管各种血管生成刺激物和ABM被增强。因此，根据本发明，ABM移植是以或是“单独”治疗剂或是和任何药理学药物、蛋白质或基因或任何其它化合物或干预手段联合注射的，所述任何药理学药物、蛋白质或基因或任何其它化合物或干预手段可以增强骨髓产生血管生成生长因子和/或促进内皮细胞增殖、迁移和血管管道形成。“组合”因子可以被直接给予患者或靶组织，或在将骨髓注射入患者之前，在体外和骨髓温育。这些“组合”因子的例子(尽管不限于这些制剂)是巨核细胞-单核细胞集落刺激因子、单核细胞趋化蛋白1(MCP 1)、EPAS1或缺氧诱导因子-1(HIF-1)。对骨髓的刺激可以通过直接将骨髓暴露于蛋白形式的因子，或者可以用带有相关基因的载体转染骨髓细胞。例如，可以用带有HIF-1或EPAS1转基因的质粒载体或腺病毒载体转染骨髓。可以增强骨髓产生血管生成因子的干预的一个例子是，将骨髓细胞体外暴露于缺氧。此干预可以对骨髓单独应用，或者和上面列出的任何因子联合。这些最佳化策略被设计为，在直接注射骨髓进入心脏或任何外周缺血组织之前，增加血管内皮生长因子(VEGF)表达量和/或具有血管生成活性的其它细胞以因子的量。广义上，本发明包括心肌内注射ABM和任何因子，所述因子将是可以利用，以引起骨髓刺激和/或通过骨髓或其基质微环境，体外或体内刺激任何血管生成生长因子产生。
取决于临床情况，输送上述治疗形式至患者将变化。例如，患有难治性冠状动脉疾病或缺血性外周血管病的患者将是候选者，进行骨髓抽吸术，随后进行ABM心肌或肢体移植，移植进入缺血组织或其边界区和/或正常组织，所述正常组织可以作为患病组织的侧支或细胞供应来源，用于治疗性血管生成和/或肌生成的目的。例如，患有难治性冠状动脉疾病或缺血性外周血管病的患者将是候选者，进行骨髓抽吸术，随后进行ABM心肌或肢体移植移植进入缺血组织或其边界区和/或正常组织，所述正常组织可以作为患病组织的侧支或细胞供应来源，用于治疗性血管生成和/或肌生成的目的。本方法将涉及应用骨髓抽吸术、骨髓采集和处理、随后应用ABM或其要素(生长因子和/或从患者自体骨髓分离的细胞要素)，带有或不带有对其输送形式的任何体外刺激，注射入缺血或非缺血心肌和/或外周缺血组织(如肢体缺血)。骨髓将在标准的抗凝/抗聚集溶液(含有柠檬酸钠和EDTA)中保存，保存在4℃，在无菌环境中，直至其使用时。
一旦应用，骨髓将被过滤，以避免注射残存的血凝块或大集合体(macroaggregates)进入靶组织。
骨髓将被注射入心肌，即在治疗性心肌血管生成或治疗性肌生成中，所述骨髓带有或不带有任何输送形式的刺激因子，或用带有转基因的载体转染或未用带有转基因的载体转染，所述转基因被设计为增强骨髓的血管生成效应，这是应用或是任何基于导管的经心内膜注射设备或通过外科(开胸)经心外膜胸廓造口术，或允许经心外膜输送的任何其它方法实施的。在治疗肢体缺血的情形下，将通过直接注射骨髓或其要素将骨髓转移进入腿部肌肉。所述骨髓或其要素带有或不带有对其任何输送形式的体外或体内刺激。
每个治疗位点的注射量可能是在每个注射位点0.1-5.0cc范围之间，这取决于具体的骨髓产物和缺血状态的严重程度和注射的位点。注射的总数将可能是每疗程1-50个注射位点范围之间。
实施例7猪骨髓培养 在无菌状态下从猪采集骨髓细胞(BMCs)，置于无防腐剂的肝素中(20单位/ml BM细胞)并用300μ和200μ的不锈钢网孔过滤器连续过滤。然后，用Ficoll-Hypaque梯度离心分离BMCs，种植在T-75烧瓶中，在长期培养基(LTCM)(Stem Cell Tech，Vancouver，BritishColumbia，Canada)中培养过夜，温度是33℃，T-75培养瓶中的CO2是5％。然后，改变培养基和洗掉非附着细胞。附着的细胞(即，“早期附着细胞”)大多数是单核细胞、内皮前体细胞或其它造血系细胞。早期附着细胞中的单核细胞中的是骨髓源基质干细胞。通过lac-Z染色试验，通过表达标记物蛋白，这些细胞显示出对腺病毒是允许的(permissive)。
BMCs在每一培养皿中的种植密度是7×106/ml。当细胞在大约7天开始会合时，通过0.25％胰蛋白酶将它们分离为1∶3。对此研究，传代3-8次。
腺病毒转染 首先在6-cm的皮氏培养皿(Petri dishes)中培养BMCs 3至14天，允许产生粘附于皮氏培养皿的早期附着细胞层。在开始种植后的那天，冲去非-黏附细胞。然后，用编码一种或多种细胞因子、生长因子或其它哺乳动物血管生成促进因子的载体接种早期附着细胞，所述其它哺乳动物血管生成促进因子如同但不限于转录因子HIP-1或HIF-2。此接种可以发生于种植后的从3至28天，例如，从3至12天或3至8天。接种后大约2小时至3天，从转染的细胞洗去病毒。随后，转染的细胞可以被注射入患者的靶组织，如心脏的肌肉或腿部的肌肉。
实施例8MSCs具有体外分泌生物活性的侧支-增强因子(collateral-enhancingfactors)的能力 作为HIF-1转导MSCs增加细胞的血管生成潜能的假设的可行性的第一个试验，培养小鼠MSCs，连续地分析条件培养基，分析细胞因子的产量(图5)。从小鼠的股骨和胫骨采集单核的骨髓细胞，用Ficoll密度梯度分离单核细胞成分。培养细胞10天，用双磁珠技术(double magnetic bead technique)，从异源培养细胞分离CD34阴性/CD45阴性细胞。此分离方法涉及，负性地(negatively)选择不表达细胞标记物CD34和CD45的细胞，通过用经商业途径得到的用这些标志物的抗体标记的磁珠，将MSCs从异源培养的细胞中纯化出来。CD34阴性/CD45阴性-成分被分离出来，这是通过用FITC-标记的抗-CD34抗体(Pharmingen，San Diego，CA)标记，随后通过和抗-FITC及抗-CD45磁珠同时温育(Miltenyi Biotech，Sunnyvale，CA)实施的。将细胞通过磁柱，收集双阴性成分。随后，分别培养磁珠-阴性(bead-negative)和磁珠-阳性群。磁珠-阴性群显示了典型的MSCs形态，而磁珠-阳性细胞群似乎主要由小的球形细胞构成，与淋巴系造血细胞(lymphohematopoietic cells)一致(图5A和5B)。进行FACS分析，证实细胞不表达淋巴系造血细胞特有的表面标记物CD31、CD34、CD45、和CD117，但是确实表达骨髓源基质细胞特有的高水平的CD44(95±0.6％)和CD90(99.1±0.1％)和CD105(89±2.1％)。
(这些CD34阴性/CD45阴性细胞在此也称为“骨髓源基质细胞(marrow-derived stromal cells)”或“MSCs”)。重新铺板分离的MSCs，随后收集条件培养基24小时。
通过ELISA分析如上制备的条件培养基中血管生成细胞因子的存在情况。用总细胞培养蛋白校正细胞因子水平。数据反映了至少3个不同的细胞群，每一细胞群含有从2个小鼠集中的细胞。结果显示(图5)，MSCs表达这样的已知的侧支增强因子如VEGF、MCP-1和bFGF(也是血管生成素-1和P1DGF(未显示))。与之对照，CD34+细胞(祖内皮细胞)不表达这些因子。
也检测了分泌入培养MSCs的培养基中的细胞因子的功能，这是通过检测他们引起内皮细胞增殖的能力。收集如上制备的MSC-条件培养基，发现其确实增加了培养的人脐静脉内皮细胞的增殖。将MAECs或SMC’s(1×104/孔)铺板在24孔板中24小时，在带有0.1％胎牛血清的MEM中。然后，用各种浓度的MSCCM或仅带有DM-10的对照孔替代培养基。持续培养72小时，其后，回收细胞，用Coulter计数器计数。数据报告为相比于对照组的增殖变化的均数百分数。
MSCs增加了小鼠缺血后肢的侧支血流 用本领域的已知方法，使24周龄的Balb/C雄性小鼠经历右股动脉末端结扎(right distal femoral artery ligation)。24小时后，小鼠被随机分为3组-1组接受如上制备的来自同系小鼠(syngeneic mice)的1×106MSCs，1组接受分离自同系小鼠的1×106成熟内皮细胞。1组接受非条件培养基，注射入缺血后肢的内收肌。在随后的28天期间缺血后肢血流恢复后，应用激光多普勒灌注成像(LDPI)(图6)。
显示于图6的这些试验的结果证实了，注射MSCs入缺血后肢的内收肌显著增加了测支血流，这种效应在注射成熟内皮细胞时未发现。
证实MSCs转导后的细胞存活和基因产物表达 作为确定MSCs是否提供了遗传改变(genetic alteration)的合适的靶的起始步骤，检测了用腺病毒载体体外转导后MSCs的原位存活。为此目的，进行了两个分别的试验，一个应用含有编码绿色荧光蛋白(GFP)基因的腺病毒，一个含有编码β-半乳糖苷酶的基因。如上制备的MSCs被体外转导。初步研究确定，超过90％的MSCs被成功地用含有报告转基因的腺病毒转导，MOI是150(数据未显示)。为追踪蛋白表达，用Ad.GFP或Ad.β-半乳糖苷酶温育细胞，MOI是150，温育2小时，洗涤3次，回收并立即注射入内收肌(术后24小时)。为了追踪注射的GFP+/MSCs的命运，用Nikon倒置荧光显微镜检测多个内收肌和小腿肌切片。为了追踪β-gal+/MSCs的命运，用商业上可利用的X-gal试剂盒(Invitrogen)显影切片并立即注射入小鼠的内收肌，所述内收肌在之前经历了股动脉结扎24小时。在第3天、第7天和第14天，处死小鼠。随后检测内收肌切片，或是在荧光显微镜下，或是用X-gal染色，这取决于本领域中已知的合适方案。
在第3天，几乎没有细胞被发现表达所需基因。然而，在第7天和维持至第14天，发现表达所需基因的许多细胞贯穿内收肌组织分布。
因此，试验不仅在转录/翻译机制上证实了细胞存活和保存，也证明了MSCs可以被用作载体，将所需基因导入特定组织如肌肉组织。
体外MSCs的HIF-1α/VP16转染导致侧支增强相关因子增加，此增加大于缺氧诱导的增加 如上所述分离和铺板小鼠MSCs。比较3组MSCs。组1-MSCs，培养在常氧条件下；组2-MSCs，培养在1％O2中，组3-MSCs，用如上制备的编码HIF-1α/VP16的腺病毒转染。将MSCs和病毒温育2小时，感染复数(multiplicity of infection)是200，随后培养48小时，以允许时间用于基因表达。
随后，从所有3组细胞收集培养物-条件培养基24小时。用商业上可得到的ELISA试剂盒，分析培养基中血管生成细胞因子VEGF和β-FGF的存在情况。用总细胞培养蛋白校正细胞因子水平。图7中显示的结果说明，HIF-1α/VP16转染增加了VEGF和βFGF由MSCs表达和分泌，达到基本上大于缺氧时得到的水平。
浸泡这些培养细胞的培养基(MSC条件培养基或MSCCM)被加入内皮细胞(EC)和平滑肌细胞(SMC)培养物，以评价MSCCM在细胞增殖中的作用。小鼠主动脉内皮细胞(MAECs)分离如下。在无菌条件下，解剖小鼠胸主动脉(n＝10)，移除外膜，然后切成1-2mm的环状物。然后，在37℃下用0.25％胰蛋白酶温育环状物20分钟，，随后冲洗和收集悬浮细胞。这些细胞培养在补充有10％FBS的极限基本培养基(Minimal Essential Media)中。细胞均一地对因子VIII呈阳性。用修饰的前述方案分离平滑肌细胞(SMC’s)。简言之，如上收集MAECs后，加入溶于Hanks平衡盐溶液(1mg/ml)中的胶原酶，37℃温育达3小时，每15-30分钟轻柔搅拌。再次收集悬浮细胞，冲洗和重悬浮在补充有10％FBS的培养基199(Medium 199)中。细胞均一地对平滑肌肌动蛋白染色。两种细胞均传代3-8次，用于本研究目的。
当比较于来自常氧和缺氧条件下MSCs的MSCCM时，来自HIF-1α/VP16-转导的MSCs的MSCCM增加EC增殖(290％对31％对79％，比较于对照培养基中的增殖，p＜0.001)和SMC增殖(220％对26％对58％，p＜0.001)。
MSCs的HIF-1α/VP16转染导致侧支血流增加。
随后研究了在小鼠后肢缺血模型中，HIF-1α/VP16转导的MSCs对侧支血流的影响。1组动物(如上)接受1×105非转导的MSCs，1组接受HIF-1α/VP16-转导的细胞，第3组接受培养基。如上述监测缺血肢体的血流。21天间收集的结果显示(图8)，和用非转导的MSC处理的小鼠中观察到的情况相比，用转导的MSCs处理的小鼠证实了侧支血流恢复的一致的较大增加。
总之，本实验显示了，用腺病毒载体中的HIF-1α/VP16转染显著和惊人地增加了MSCs的体外血管生成效应。更重要的是，体内研究提示，和单独注射MSCs相比，本策略导致侧支改善效应增加。这些研究提示，用HIF-1α转导MSCs(和最可能地，也用编码其它血管生成相关细胞因子如FGF家族蛋白和NOS)将最佳化基于细胞策略的侧支增强效应，用于增加缺血组织的侧支血流。
可以用其它具体形式实施本发明，而不背离其精神或主要特性。因此，对本发明的前述仅仅公开了其代表性实施方案，其它变化被预期在本发明的范围内。因此，本发明不限于此处详述的具体实施方案。而是，可以参照所附的权利要求作为本发明范围和精神的提示。
前面的具体实施方案例证了本发明实践。然而，应该理解，可以应用本领域技术人员已知的或此处公开的其它方法，而不背离本发明的精神或所附权利要求的范围。
权利要求
1.增强受损骨髓细胞在需要的患者中促进侧支血管发育能力的方法，所述方法包括使受损的骨髓细胞在合适的培养基中，在合适的培养条件下生长一段时期，所述时期足以促进早期附着细胞从骨髓细胞产生；用载体转染至少一部分早期附着细胞，所述载体包括编码一种或多种因子的多核苷酸，所述因子选自血管生成细胞因子、生长因子和哺乳动物血管生成促进因子，和培养转染的早期附着细胞，以致于使一种或多种因子产生，从而增强受损骨髓细胞和/或当这些细胞培养生长时、来自这些细胞的培养基促进患者侧支血管发育的能力，细胞和/或培养基被输送至所述患者，所述增强作用是和非转染的细胞或从培养生长的非转染细胞得到的培养基的作用相比而言的。
2.权利要求1所述的方法，其中所述骨髓细胞由于供体衰老而受损。
3.权利要求1所述的方法，其中所述骨髓细胞由于供体患有疾病而受损，所述疾病损害了见于正常青年健康个体中的天然发生的血管生成过程。
4.权利要求1所述的方法，其中所述疾病是高胆固醇血症。
5.权利要求1所述的方法，其中所述供体是患者。
6.权利要求1所述的方法，其中所述细胞培养生长大约12小时至大约12天。
7.权利要求1所述的方法，其中所述时期是从大约12小时至大约3天。
8.权利要求1所述的方法，进一步包括从供体获得骨髓和过滤骨髓，以得到骨髓细胞。
9.权利要求8所述的方法，其中所述过滤去除了大于从大约300μ至大约200μ的颗粒。
10.权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种因子选自缺氧诱导因子-1(HIF-1)、内皮PAS域蛋白1(EPAS1)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、巨核细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、PR39、成纤维细胞生长因子(FGF)和一氧化氮合酶(NOS)。
11.权利要求1所述的方法，其中所述载体选自质粒载体和腺病毒载体。
12.权利要求10所述的方法，其中所述载体是腺病毒载体。
13.权利要求12所述的方法，其中所述因子选自PR39、FGF和NOS。
14.权利要求1所述的方法，进一步包括刺激转染的早期附着细胞。
15.权利要求1所述的方法，其中所述细胞是骨髓源基质细胞。
16.权利要求15所述的方法，其中所述培养基是通过培养骨髓源基质细胞得到的。
17.在所需患者中增强其侧支血管形成的方法，所述方法包括从该患者获得自体骨髓；使自体骨髓在容器中在合适的培养条件下生长一段时期，所述时期足以促进早期附着细胞由自体骨髓产生；用载体转染至少一部分早期附着细胞，所述载体包括编码一种或多种因子的多核苷酸，所述因子选自成纤维细胞生长因子(FGF)、NOS和PR39，以致于引起一种或多种因子表达；和直接向患者中的所需部位给予有效量的转染的早期附着细胞和/或来自培养生长中的转染细胞的培养基，从而增强患者中该部位的侧支血管形成。
18.在所需患者中增强侧支血管形成的方法，所述方法包括使骨髓在合适的培养条件下生长一段时期，所述时期足以促进早期附着细胞由骨髓产生；用载体转染至少一部分早期附着细胞，所述载体包括编码一种或多种因子的多核苷酸，所述因子选自血管生成细胞因子、生长因子和哺乳动物血管生成促进因子，由早期附着细胞表达；和在培养基中培养转染的早期附着细胞和培养一段时期，所述时期适于使一种或多种因子由细胞表达，从而产生条件培养基；和直接向患者中的所需部位给予有效量的转染的早期附着细胞和/或条件培养基，从而增强患者中该部位的侧支血管形成。
19.权利要求18所述的方法，其中所述早期附着细胞是骨髓源基质细胞，并且细胞被直接给予至患者的缺血部位。
20.权利要求18所述的方法，其中所述早期附着细胞是骨髓源基质细胞，并且条件培养基被直接给予至患者的缺血部位。
21.权利要求18所述的方法，其中所述细胞和/或条件培养基被注射入血流，用于给予所述部位。
22.权利要求20所述的方法，其中所述细胞和/或条件培养基被注射入供应所述部位的动脉。
23.权利要求18所述的方法，其中所述时期是从大约3小时至大约12天。
24.权利要求23所述的方法，其中所述时期是从大约3小时至大约3天。
25.权利要求18所述的方法，进一步包括在培养骨髓获得早期附着细胞之前过滤骨髓。
26.权利要求25所述的方法，其中所述骨髓是自体骨髓。
27.权利要求18所述的方法，其中所述因子是促进哺乳动物血管生成的转录因子。
28.权利要求18所述的方法，其中所述载体是腺病毒载体。
29.权利要求28所述的方法，其中所述因子选自成纤维细胞生长因子(FGF)、NOS和PR39。
30.权利要求29所述的方法，其中所述因子选自FGF-1、FGF-2、FGF-4和FGF-5。
31.权利要求29所述的方法，其中所述因子选自诱导型NOS和内皮型NOS。
32.权利要求29所述的方法，其中所述因子是PR39。
33.权利要求18所述的方法，其中所述转染的细胞被直接注射入心脏或腿部肌肉，以促进该处的血管生成。
34.权利要求18所述的方法，其中所述方法增强心脏或腿部肌肉的侧支血管形成。
35.权利要求18所述的方法，其中所述方法促进新植入的心肌细胞的发育。
36.权利要求18所述的方法，其中所述方法增强患有心电通路(cardiac electrical pathway)损害的患者心脏的电传导性。
37.权利要求18所述的方法，其中所述方法增强有受损心肌功能的患者的心肌功能。
38.权利要求18所述的方法，其中所述方法治疗左心室病理状态或右心室病理状态，所述状态引起患者心脏的心功能受损。
39.治疗组合物，其包括来源于骨髓的早期附着细胞，该细胞已经用载体被转染，所述载体包括编码一种或多种因子的多核苷酸，所述因子选自血管生成细胞因子生长因子和血管生成促进因子。
40.权利要求39所述的治疗组合物，进一步包括条件培养基，其中细胞已经培养生长一段时期，所述时期足以表达所述因子中的一种或多种。
41.权利要求39所述的组合物，其中所述多核苷酸进一步包括转录调节区，所述转录调节区可操纵地和多核苷酸相关联。
42.权利要求39所述的组合物，其中所述转染的细胞通过暴露于缺氧而被刺激过。
43.权利要求39所述的组合物，进一步包括肝素或另一抗凝剂。
44.权利要求39所述的组合物，其中所述载体是腺病毒载体。
45.权利要求39所述的组合物，其中所述早期附着细胞是骨髓源基质细胞。
46.权利要求39所述的组合物，其中所述组合物意图于被注射入具有缺血组织的患者，并且早期附着细胞来源于从该患者获得的骨髓。
全文摘要
本发明提供了方法，用于增强受损骨髓细胞导入患者的缺血部位时促进血管生成的能力，通过用促进血管生成的转基因转染来自培养中的骨髓的早期附着细胞实施。也提供了方法，利用来自自体骨髓的这样的早期附着细胞，或当细胞培养生长时(不必来自自体细胞)、来自这些细胞的培养基，以向患者输送促进血管生成的转基因或蛋白质。转染的早期附着细胞，或当这些细胞培养生长时、来自这些细胞的培养基，被导入缺血组织如心脏，以增强侧支血管形成。细胞或培养基也可以被注射入血流(供应缺血组织的动脉或任何其它血管或静脉)。
文档编号A61K38/43GK1838962SQ200480024156
公开日2006年9月27日 申请日期2004年7月1日 优先权日2003年7月10日
发明者S·爱泼斯坦, S·富赫斯, R·科尔诺维斯基, M·B·列昂, K·W·卡彭特 申请人:心肌治疗有限公司