专利名称：维持干细胞自我更新的6个猪源关键基因的体外转录质粒的构建的制作方法
技术领域：
本发明利用基因工程技术，构建了体外转录载体及能够诱导猪胚胎成纤维细胞转 变成猪多能干细胞的6个关键基因的体外转录质粒，用于诱导猪的成纤维细胞成猪多能干 细胞，为建立人类疾病模型提供了基本条件，该发明属于基因工程领域。
背景技术：
猪是最适合人类器官移植和建立人类疾病模型的动物，但猪的疾病模型大多数用 基因敲除技术得到基因敲除的体细胞然后利用核移植的技术产生可继续发育的卵母细胞， 从而得到基因敲除猪。但在这个过程中存在基因敲除效率低，孕期流产率高，初生仔猪有缺 陷等问题；此外，猪的干细胞分离至今没有成功，所以根据Yamanaka研究小组的实验方法， 在成纤维细胞中转入几个干细胞的关键基因就能将成纤维细胞转变成多能干细胞。目前， 利用脂质体等转染试剂对成纤维细胞的多基因转染效率非常低，导致转入的基因量不同， 但用逆转录病毒携带基因用其感染成纤维细胞的方法得到的基因敲除猪又存在生物安全 性的问题。因此，我们试图在体外大量转录维持干细胞自我更新的猪的6个关键基因，然后 将其mRNA转入猪胚胎成纤维细胞后使其变成猪的多能干细胞。
发明内容
本发明的目的之一是构建基因体外转录载体，该载体可以对某个基因进行大量的 体外转录，得到可高效翻译的mRNA。本发明的另一个目的是构建了携带维持干细胞自我更新的猪的6个关键基因和 对照基因EGFP的体外转录质粒，这6个基因体外转录出的mRNA转染进猪胚胎成纤维细胞 后能够使其转变成猪的多能干细胞；并用细胞水平通过细胞转染鉴定了体外转录mRNA的 功能。本发明的技术方案是这样实现的维持干细胞自我更新的6个猪源关键基因的体 外转录质粒的构建，其特征在于具体制备方法如下首先设计基因体外转录空载体Vitr0-TranSPMD-18T，然后获得EGFP和维持 干细胞自我更新的猪源的6个关键基因的cDNA，再按相应的酶切位点进行酶切连接， 并用体外转录试剂盒对7个体外转录质粒进行体外转录，得到相应的mRNA，然后将 Vitro-Trans-EGFP转染进猪胚胎成纤维细胞，检测其功能；1、基因体外转录载体的构建用重叠延伸PCR的方法得到104bp的序列，包括T7启动子，增强翻译效率的 minusCT，包含ATG起始密码子的5’ UTR和一段包含酶切位点的无关序列。然后连接进入 PMD-18T simple载体，用于以后表达基因的插入。根据目的序列设计2对引物，PI, P2 ；P3, P4。用引物Pl和P2进行PCR扩增得 到60bp的序列，电泳，切胶回收，然后以60bp的产物为模板用引物P3和P4进行PCR，得到104bp的反转录模板序列。表1引物序列
权利要求
维持干细胞自我更新的6个猪源关键基因的体外转录质粒的构建，其特征在于具体制备方法如下首先设计基因体外转录空载体Vitro TransPMD 18T，然后获得EGFP和维持干细胞自我更新的猪源的6个关键基因的cDNA，并按相应的酶切位点进行酶切连接，最后用体外转录试剂盒对7个体外转录质粒进行体外转录，得到相应的mRNA，然后将Vitro Trans EGFP转染进猪胚胎成纤维细胞(1)、基因体外转录载体的构建用重叠延伸PCR的方法得到104bp的序列，包括T7启动子，增强翻译效率的minusCT，包含ATG起始密码子的5’UTR和一段包含酶切位点的无关序列；然后连接进入PMD 18T simple载体，用于以后表达基因的插入；根据目的序列设计2对引物，P15′ tatagggagaagagggagagtagagccgccaccat 3′，P25′ attctccgcggacatatgtgggcccatggtggcgg3′；P35′ Ctcgaggactaatacgactcactataggga 3′，P45′ aagcttgctagctctcgagagaattctccg 3′；用引物P1和P2进行PCR扩增得到60bp的序列，电泳，切胶回收，然后以60bp的产物为模板用引物P3和P4进行PCR，得到104bp的反转录模板序列；Ctcgaggactaatacgactcactatagggagaagagggagagtagagccgccaccatgggcccacatatgtccgcggagaattctctcgagagctagcaagctt；(2)、维持干细胞自我更新的猪源关键基因的cDNA的获得利用NCBI中公布的EGFP的序列和杜洛克猪的相应基因mRNA序列，设计引物，包括Oct4(NM_001113060.1)，Sox2(NM_001123197.1)，c Myc(NM_001005154.1)，Klf4(NM_001031782.1)，Nanog(NM_001129971.1)和Lin28(NM_001123133.1)；引物两端带有连接体外转录载体的内切酶位点(NcoI，EcoRI和NheI)，采用RT PCR的方法得到这6个基因的cDNA序列；(3)、基因体外转录质粒的获得将上述的体外转录空载体与Oct4，Sox2，c Myc，Klf4，Nanog和Lin28的7个基因的cDNA连接，得到基因的体外转录质粒(VitroTrans EGFP/Oct4/Sox2/c Myc/Klf4/Nanog/Lin28)；(4)、基因的体外转录利用Applied Biosystems公司的mMESSGE mMACHINE T7Ultra Kit对线性化的基因体外转录质粒进行体外转录；(5)、基因体外转录出的mRNA功能的验证用作为对照的体外转录出的EGFP的mRNA对猪成纤维细胞进行转染，12小时后观察到绿色荧光蛋白表达。
2.根据权利要求1所述的维持干细胞自我更新的6个猪源关键基因的体外转录质粒的 构建，其特征在于所述的基因体外转录载体的序列及含相同元件相同功能的载体。
全文摘要
本发明涉及一种维持干细胞自我更新的6个猪源关键基因的体外转录质粒构建，其特征在于具体制备方法如下首先设计基因体外转录空载体Vitro-TransPMD-18T，然后获得EGFP和维持干细胞自我更新的猪源的6个关键基因的cDNA，并按相应的酶切位点进行酶切连接，最后用体外转录试剂盒对7个体外转录质粒进行体外转录，得到相应的mRNA，然后将Vitro-Trans-EGFP转染进猪胚胎成纤维细胞其6个基因体外转录出的mRNA转染进猪胚胎成纤维细胞后能够使其转变成猪的多能干细胞；6个基因体外转录出的mRNA能够高效翻译。
文档编号C12N5/10GK101984062SQ20101018240
公开日2011年3月9日 申请日期2010年5月26日 优先权日2010年5月26日
发明者周杨, 唐小春, 张明军, 朱建国, 欧阳红生, 段新平, 赖良学, 逄大欣, 陈月 申请人:吉林大学