一种刺激体内内源干细胞的组合物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种刺激体内内源干细胞的组合物及 其应用。
【背景技术】
[0002] 近年来兴起的干细胞移植治疗、抗衰等研究已显示出可喜的前景，特别是异体成 体间充质干细胞体外大量扩增培养再进行移植，已在多项领域取得了不错的效果，但靠异 体或自体（外源性）干细胞体外培养扩增目前还存在免疫、细胞数量和种类的选择等诸多 问题，需要进一步地关键技术突破。
[0003] 成体内源性干细胞在一定条件下从骨髓动员到外周血增殖、迀移、分化、新生替代 丢失的成体细胞发挥一定的功能，但是仅靠这些自身激活的内源性干细胞还不足以完全修 复细胞，在缺乏任何外源性干预的情况下，新生干细胞的数量和存活时间均很有限，同时， 由于血脑屏障的存在，使得大分子物质很难通过并到达其左右部位。而只依靠异体干细胞 移植，由于存活率及存活时间很低也很难监控，真正能在体内迀移、分化、修复的细胞是非 常的少。
[0004] 有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一目的在于提供一种刺激体内内源干细胞的组合物，所述的组合物能 够刺激与促进内源性干细胞修复，以填补内源性干细胞自我修复进行治疗的干细胞应用领 域的空白。
[0006] 本发明的第二目的在于提供一种所述的刺激体内内源干细胞的组合物在制备治 疗肿瘤、颈肩部疾病、腰腿痛、心脏类疾病、糖尿病以及神经系统疾病中的药物的应用。
[0007] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
[0008] 一种刺激体内内源干细胞的组合物，
[0009] 基底液中含有粒细胞集落刺激因子10-20 y g/ml，血小板源生长因子45-55ng/ ml，转化生长因子-|3 3-7ng/ml，人胰岛素样生长因子3-7ng/ml，重组人表皮生长因子 l_3ng/ml，血管内皮生长因子8_15ng/ml ;
[0010] 所述基底液为：以数量级IO5个/ml浓度的人脐带间充质干细胞悬液与质量浓度 为3% -5%的壳聚糖水溶液按体积比为1-2:3-4混合得到的混合液。
[0011] 粒细胞集落刺激因子（G-CSF)是一种糖蛋白，含有174个氨基酸，分子量约为 20000,作用于造血干细胞动员，促进其增值和分化，其重要作用是可以动员造血干细胞从 骨髓进入外周血，刺激粒、单核巨噬细胞成熟，促进成熟细胞向外周血释放，并能促进巨噬 细胞及多种原始细胞修复。可有效动员单个核细胞和CD34阳性细胞，作为内源骨髓干细胞 强有力的动员剂，可将大量的内源干细胞动员到外周血中有利于干细胞向损伤组织迀移修 复。G-CSF可采用惠尔血粒细胞集落刺激因子。
[0012] 人脐带间充质干细胞可通过市售购买，如可购买自Prochymal(美国Osiris 公司）、MPC(Mesoblast 公司）、Hearticellgram-AMI(FCB-Pharmicell 公司）、 Cartistem(Medi-post 公司）、Cuepistem(Anterogen 公司）、Prochymal (美国 Osiris 公 司）。也可以通过以下方法制备：
[0013] 1.脐带间充质干细胞分离
[0014] 取正常足月健康婴儿脐带（医院废弃物），浸泡于生理盐水（每毫升含25U肝素 钠）中，于超净台内取出脐带，PBS缓冲液充分洗涤残留的血液，将其剪碎ImmX ImmX Imm大 小组织块，置于25ml培养瓶中，加入含10% FBS的DMEM低糖培养基3-5ml，并将培养瓶置 于37°C、体积分数为5%二氧化碳培养箱内培养。倒置显微镜下观察细胞贴壁后，每隔5-6 天更换培养基，将细胞出现集落50 %汇合后，用T-EDTA消化液细胞消化，2-3分钟后，用含 FBS的DMEM培养基终止，收集。
[0015] 2?脐带间充质干细胞的培养
[0016] 收集pi代的细胞，按1:2的比例传代，倒置显微镜下观察细胞贴壁后，每隔3-4天 更换培养基，将细胞出现集落80 %汇合后，用T-EDTA消化液细胞消化，2-3分钟后，用含FBS 的DMEM培养基终止，收集。
[0017] 3.培养至P3代间充质细胞，PBS清洗，离心，收集10的5次方细胞量，于4°C保存 1天内备用，也可制备冻存液于_196°C长期保存备用。
[0018] 壳聚糖是一种生物可降解的高分子聚合物，由于其良好的生物可降解性、对生物 黏膜较强的黏附性、无毒性及组织相容性，是一种理想药物载体，利用壳聚糖制成生物药 膜，达到缓慢释放目的，并且达到药物缓慢释放的作用。
[0019] 血小板源生长因子（PDGF)最初从血小板中发现，在损伤早期从血小板Ct颗粒释 放出来，启动并加速组织创伤修复。可促进多种细胞增殖生长，诱导成纤维细胞趋化和有丝 分裂，调节胶原酶分泌和胶原合成。TOGF生物学活性主要有几方面：
[0020] 1、趋化活性。诱导巨噬细胞与成纤维细胞的游走，对中性粒细胞、平滑肌细胞、成 纤维细胞有趋化性。
[0021] 2、具有缩血管活性。TOGF能引起血管收缩，是比血管紧张素II更强的血管活性物 质。
[0022] 3、促分裂效应。TOGF能刺激血管平滑肌细胞、成纤维细胞、胶质细胞的分裂增生。
[0023] 4、参与磷酸酯酶激活与前列腺素代谢。
[0024] I3DGF可购买自上海瑞齐生物科技有限公司。
[0025] 转化生长因子(TGF-P)作用：诱导内皮细胞趋化和血管生成，调节其他生长 因子的促有丝分裂效应，抑制巨噬细胞和淋巴细胞增殖。
[0026] 重组人表皮生长因子（EGF)与人胰岛素样生长因子（IGF):加强胶原蛋白的合成， 促进成纤维细胞分化。
[0027] EGF能促进组织修复过程中DNA、RNA和羟脯氨酸的合成，诱导分化成熟的细胞逆 转化为干细胞，加速细胞的增殖，诱导内皮细胞趋化和血管生成，调节胶原合成，刺激内皮 细胞、间充质细胞增殖。
[0028] EGF可购买自杭州天目北斗生物制品有限公司、上海长江（集团）股份有限公司以 及河北省馆陶生物制药厂、珠海东大生物制药有限公司（贝复洛）等。
[0029] 血管内皮生长因子（VEGF):刺激血管内皮细胞的有丝分裂和血管的发生，提高单 层内皮的通透性。
[0030]重组人表皮生长因子（EGF)、人胰岛素样生长因子、血小板源生长因子、转化生长 因子（TGFI)、血管内皮细胞生长因子（VEGF)等多种生长因子协同配合增强，有助于促进 内源性干细胞活化，有助于神经系统、血液系统的修复及功能的再生。
[0031] 本发明提供的刺激体内内源干细胞的组合物，内源性干细胞可针对环境的变化调 整增殖与分化的速度，而且这种潜力不局限于正在进行器官组织生成的区域，通过综合利 用干细胞动员因子、微量干细胞悬液、多种细胞营养生长因子、可吸收载体组合物等组分对 内源干细胞进行调整和改善，各组分协同增强作用，促进干细胞的激活与增殖，并迀移至靶 区进一步分化与整合，营养全身，作用持久，效果显著。利用内源性干细胞比其他外源性细 胞替代疗法具有多种独特的优势：可避免免疫反应、减少肿瘤发生、绕过许多伦理问题、降 低移植费用等。因此，围绕促进内源性干细胞研究方向迄今相对外源性干细胞应用还是空 白，因此其应用前景乐观，将成为干细胞应用领域座新的里程碑。
[0032] 其中，人脐带间充质干细胞悬液中干细胞的细胞浓度的数量级达到IO 5个/ml即 可，如为I X 105-9 X IO5个/ml。为了达到更好的效果且节约成本，优选地，人脐带间充质干 细胞悬液中的细胞浓度为2 X 105-7 X IO5个/ml，更优选为3 X 10 5-5 X IO5个/ml。
[0033] 优选地，所述壳聚糖水溶液的质量浓度为4%。
[0034] 为了进一步增强各组成之间的协同增强效果，优选地，所述基底液中含有粒细胞 集落刺激因子13-17 y g/ml、TOGF 48-53ng/ml，转化生长因子-4-6ng/ml，人胰岛素样生 长因子4