Cathelicidin ll-37及其衍生物在伤口愈合中的用图
【专利说明】CATHELICIDINLL-37及其衍生物在伤口愈合中的用途
[0001] 本申请是申请日为2004年01月28日，发明名称为"CATHELICIDIN LL-37及其衍 生物在伤口愈合中的用途"的中国专利申请201010150582. 3的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及肽LL-37和N-末端片段，及其功能性衍生物，其中所述肽可用于细胞 增殖，上皮修复和伤口愈合。本发明也涉及包含一种或一种以上所述肽的药物组合物。
【背景技术】
[0003] 上皮构成了宿主和可能的有害环境之间的第一道屏障，因此该界面的保护是至关 重要的。伤口表明屏障破损并立即启动一系列紧密协调的事件，其目的是为了迅速恢复此 屏障的完整性。在较高等生物中紧急伤口闭合已经得到进化，这不同于在较低等物种见到 的组织完全再生的费时过程。伤口愈合受损是临床医学的一个主要难题，它的范围从随年 龄增长见到的"正常"愈合相对迟缓到病理性的非愈合性（non-healing)溃疡。
[0004] 慢性溃疡是临床的主要问题，尽管我们对生理损伤过程的理解在过去数十年逐渐 增加，但仅仅获得了微小的治疗上的进步。独特的病因学可能导致溃疡在不同临床状况发 展，但无论原因如何，非愈合性溃疡都以上皮细胞不能迀移，增殖并闭合屏障缺陷为特征。 慢性皮肤溃疡最常见的种类是由于静脉功能不全导致的腿溃疡。这些患者出现外周静脉水 肿随后是皮肤溃疡，但是动脉循环是完好的。由于动脉硬化缺陷导致的腿和脚溃疡较不常 见。
[0005] 另外，皮肤溃疡的发展与免疫疾病如坏疽性脓皮病（pyoderma gangrenosum)和脉 管炎（vasculitis)相关。现在的治疗包括长期的全身性免疫抑制法，它并不总是有效。在 口腔、生殖器和胃肠粘膜的上皮缺陷和溃疡是常见的，并会导致很多痛苦。根本的病理机制 不很清楚，例如口疮（aphtae)和侵蚀性苔藓（erosive lichen)，且治疗方法贫乏。
[0006] 传统伤口护理包括通过机械或酶去除坏死残渣来形成肉芽组织。细菌密集定居的 伤口可能需要抗菌治疗来避免侵入性感染（invasive infection)。使用多种局部抗微生物 试剂，如碘酒（iodine)，氯已定（chlorhexidine)，双氧水（hydrogen peroxide)，银和抗生 素，但必须考虑这些试剂对基质和新生表皮（neoepidermis)的有毒作用的风险。一旦从伤 口清除了坏死组织，应用敷料来促进肉芽组织形成。可以得到很多种这样的敷料，并且多项 动物研究和临床试验已经证明了它们对伤口愈合的有益效果。
[0007] 某些部分的伤口仍是治疗抵抗性的，所以需要附加的治疗。在过去的十年中 生长因子在加快伤口修复中的潜在用途引起了很多关注。生长因子是控制对组织修复 关键的细胞过程（cellular process)的分子，包括细胞迀移，增殖，血管生成和细胞 外基质从头（de novo)合成。已经在很多实验中显示出了这些生长因子的有益效果 (Scharffetter-Kochanek 等，Basic Res Cardiol 93:1-3,1999)。然而，至今在临床实 践中用生长因子治疗慢性溃疡都很令人失望。现在在美国和欧洲（瑞典除外）被许可的 becaplermin (Regmnex?)是唯一，优选在糖尿病的足溃疡中使用的生长因子。用生长因 子治疗慢性溃疡的临床失败的原因被认为涉及传递问题和迅速降解。
[0008] 与此同步，使用生物工程化的人皮肤类似物中的自体和同种异体材料的组织疗法 已经有了进展。培养的上皮角质形成细胞构成了用于覆盖（例如烧伤病人的）大面积损 伤的皮肤的功能疗法，但该治疗昂贵，费时并且需要实验室设备。为提供表皮基底（dermal substrate)已经使用了多种策略，如无细胞的人尸体和有细胞或无细胞的牛胶原蛋白。所 有可行的方法都具有相当多的不足，如可能传染疾病，费用高，以及几乎不适合基础伤口护 理。
[0009] 抗微生物肽是先天免疫系统的效应分子，其作用是保护宿主抵御可能的有害微生 物。进化中它们是保守的，并在自然界分布广泛。人类的抗微生物肽，目前只有少数进行了 鉴定；其中防卫素（defensin)和人cathelicidin抗微生物肽hCAP18已涉及在上皮防护中 起作用（Selsted 等，J Biol Chem258:14485-14489, 1983)。
[0010] WO 96/08508涉及人多肽FALL-39,以及包含所述肽并具有抗细菌的抗微生物活 性的药物组合物。所述肽由开始的四个氨基酸残基被命名为FALL-39,并由被三个分别的 小组同时鉴定的前体蛋白的39个氨基酸的C-末端部分组成（Cowland等，FEBS，1995 ; Agerberth 等，Proc Natl Acad Sci USA 1995 ;Larrick 等，FEBS Letters 1996)。所述肽 显示具有抗革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的有效抗微生物活性。进一步定性C-末端肽显 示去除了开始的两个（FA)得到LL-37,包含37个氨基酸的较短序列，它是现在可接受的名 称（Gudmundsson 等，Eur J Biochem 238:325-332, 1996)〇
[0011] 该前体蛋白命名为hCAP18,它是人阳离子抗微生物蛋白，还是包含cathelin的 cathelicidin蛋白家族的成员之一，其中cathelin在进化中保守并且C-末端部分在不 同物种可变。在人类中，hCAPIS是此蛋白家族的唯一成员，而在其它物种中，如小鼠和猪， 则有此蛋白家族的若干成员。所述C-末端肽LL-37被认为在细胞外起作用，并且没有证 据证明此前体蛋白在细胞内被切割。hCAP18/LL-37存在于白细胞以及屏障器官（barrier organ)如皮肤，粘膜，呼吸道上皮和生殖器官。hCAP18/LL-37定位于屏障上皮（barrier epithelia)似乎与该肽在预防局部感染和全身性微生物侵入中的保护性作用是一致的。 LL-37被描述为无半胱氨酸的肽，它能容纳（adopt)两亲性的（amphiphatic)，或换言之两 亲性的（amphiphilic)，a-螺旋构象。高阳离子性（cationicity)与稳定化的两亲性的 a_螺旋结构似乎是此肽抗革兰氏阳性细菌和真菌的抗微生物作用所需要的，这已经通过 实验予以证明（Gianga-spero等，Eur J Biochem268:5589-5600,2001)。两亲性的和 a-螺 旋的结构似乎对于杀死革兰氏阴性细菌不太重要。与炎症相关，hCAP18/LL-37在皮肤上 皮（Frohm等，J Biol Chem272:15258_15263, 1997)及粘膜（Frohm Nilsson 等，Infect Immun67:2561-2566, 1999)上调。
[0012] 现有技术
[0013] Dorschner 等，J Invest Dermatol 117:91-97, 2001，显不切割后 cathelicidin 的表达量在人和鼠皮肤中增加，并且缺乏鼠同系物cathelicidin基因不能保护这些小鼠 抵御A族（Group)链球菌侵入。
[0014] WO 96/09322，儿童医疗中心公司（Children' s Medical Center Corporation) 公开了抗菌肽PR-39具有多配体蛋白聚糖（Syndecan)-I和-4的诱导活性，因此能同时减 少感染，并且作为synducin，影响参与组织修复的生长因子，基质组分及其它细胞效应物 (effector)的作用。所述synducin可在药物载体如常用的脂质体中给药。
[0015] EP 0 935 965 Al, Toray Industries, Inc?，涉及抗幽门螺杆菌制剂（antipylori agent)，其包含作为活性剂的抗微生物肽，如猪的肽PR-39。其结论是PR-39的外源性 (exogeneous)给药有抗幽门螺杆菌（Helicobacter pylori)的抗微生物活性，并加快小鼠 胃溃疡的愈合。FALL39被提到是cathelin家族的成员之一。
[0016]US 6, 255, 282, Helix Biomedix, Inc?，公开了新合成的裂解肽（lytic peptide)， 所述的裂解肽共享已知的不同裂解肽的结构和功能特性。具体描述了具有a-螺旋构象的 18个到约40个氨基酸的肽。但没有提到裂解cathelicidin肽。
[0017] Frohm Nilsson, Thesis, Karolinska Institutet，Stockholm 2001，同时阐述了 人cathelicidin抗微生物蛋白hCAP18在人皮肤伤口被高水平诱导，并在生理性愈合而不 是慢性非愈合性溃疡中释放活性的C-末端肽LL-37。hCAP18在伤口床（bed)和正常伤口 愈合过程中的上皮中可被检测到，但它在慢性腿溃疡的上皮中不存在，它只在伤口床和基 质中被检测到。据推测慢性溃疡上皮中hCAPIS的低水平及其缺乏造成了愈合受损。
[0018] Zasloff，Nature 415:389-395, 2002在抗微生物肽的综述中讨论了多项应用，其 中已经阐述所述肽为抗感染剂，并且描述了抗微生物肽用于药物开发。
[0019] EP 1 358 888 Al, Bals等，其公开日2003年11月5日，涉及所述肽LL-37在预防 或治疗由血流减少和动脉硬化造成的疾病和治疗由动脉血供给减少造成的伤口中的用途。 显示了 LL-37诱导新血管形成和刺激内皮细胞增殖的能力。本发明完全涉及血管生成效 应，并没提到上皮。
[0020] 虽然抗微生物肽，具体是LL-37,已经显示出治疗用途，但至今仍未实现。肽LL-37 在高浓度时表现出细胞毒性效应。然而，血清存在时LL-37表现出的潜在的细胞毒性效应 被抑制，但药物制剂应避免包含血清，因为它有传播疾病的风险、得到的途径有限且成本 尚。
[0021] 发明概沐
[0022] 作为对损伤的正常反应，人的抗微生物肽hCAP18在皮肤上皮中被正向调节。但在 慢性非愈合性腿溃疡中发现了低水平的hCAP18。明显地，在慢性腿溃疡中hCAP18和LL-37 在上皮完全不存在但在伤口床的炎性渗出物（infiltrate)和基质中存在。我们现已发现 hCAP18在器官培养的皮肤伤口的上皮再形成中被诱导，并且此上皮再形成被抗LL-37的抗 体以浓度依赖方式抑制。这些发现提示LL-37像生长因子一样发挥功能，在伤口闭合中起 决定性作用。本发明涉及LL-37或衍生自LL-37的新合成的肽或其功能性衍生物的用途， 以补偿体内产生的天然LL-37的缺乏。
[0023] 也显示hCAP18的上调和/或加入LL-37肽会刺激正常上皮和基质细胞的增殖，显 示正常伤口的愈合和上皮再生也可得到增强。
[0024] 也发现LL-37的细胞毒性可在包含某些脂质的组合物中降低。
[0025] 附图简沐
[0026]图1是18kDa的hCAP18蛋白的示意图，该蛋白包含信号肽S.P.，保守的cathelin 部分，及抗微生物肽LL-37 (它在体内被酶截断）。
[0027] 图2是cathelicidin蛋白家族的示意图，其中说明了不同物种中C-末端肽的多 样性。
[0028] 图3A，3B和3C显示了 pIRES2-EGFP载体的cDNA序列，该载体包括hCAP18的编码 序列，该序列用于转基因表达hCAP18。
【发明内容】
[0029] 本发明涉及肽和它的可药用盐及其衍生物，所述肽具有LL-37的N-末端片段的至 少20个氨基酸的序列，前提是所述肽不包括LL-37。LL-37具有氨基酸序列SEQ ID NO :1:
[0030] H-Leu-Leu-Gly-Asp-Phe-Phe-Arg-Lys-Ser-Lys-Glu-Lys-Ile-Gly-Lys-Glu-P he-Lys-Arg-IIe-Val-Gln-Arg-IIe-Lys-Asp-Phe-Leu-Arg-Asn-Leu-Val-Pro-Arg-Thr-Glu-Ser-OH。
[0031] LL-37的N-末端序列指从氨基酸残基编号1的亮氨酸（Leu)开始的序列。
[0032] 可药用盐包含，例如抗衡离子的乙酸盐，碳酸盐，磷酸盐，硫酸盐，三氟乙酸盐和氯 化物。优选的盐是乙酸盐。酯和酰胺是可药用衍生物的例子。
[0033] 本发明的肽应具有不超过40个氨基酸的氨基酸链。本发明涉及具有在LL-37的 C-末端已添加了1-3个氨基酸的序列的肽。可添加选自Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val的任何氨基酸及其衍生物。具 有38个氨基酸的肽的例子LL-38, SEQ ID NO :19,具有在LL-37的C-末端已经添加了丝氨 酸的序列。
[0034] 本发明具体涉及具有至少20个氨基酸的序列的肽，其选自LL-36，LL-35，LL-34， LL-33, LL-32, LL-31，LL-30, LL-29, LL-