28, LL-27, LL-26, LL-25, LL-24, LL-23, LL-22, LL-21 或LL-20,上述肽分别具有序列SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3, SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :5， SEQ ID NO：6, SEQ ID NO：7,SEQ ID NO：8, SEQ ID NO：9,SEQ ID NO：10, SEQ ID NO：11, SEQ ID NO：12, SEQ ID NO：13, SEQ ID NO：14, SEQ ID NO：15, SEQ ID NO：16, SEQ ID NO： 17或SEQ ID NO : 18。
[0035] 优选的肽选自LL-36, LL-35, LL-34, LL-33, LL-32, LL-31，LL-30, LL-29, LL-28， LL-27, LL-26或LL-25。
[0036] 本发明的肽的氨基酸序列见下表。
[0037]
[0038] 可用新的肽作为用于细胞增殖，上皮再生，正常或慢性伤口愈合的药物，并作为抗 微生物剂。
[0039] 相信新的肽具有在生理条件下形成a _螺旋结构的潜力。
[0040] 本发明其它方面涉及肽及它的可药用盐及其衍生物在制备用于上皮再生及上皮 和基质伤口的愈合的药物中的用途，所述肽具有选自以下序列之一的氨基酸序列：
[0041] a) SEQ ID NO ： 1 ；
[0042] b)包含SEQ ID NO :1的N-末端片段的至少20个氨基酸的序列；
[0043] 其中该肽通过非裂解机制来增强上皮细胞和/或基质细胞的增殖。
[0044] 本发明具体涉及具有氨基酸序列SEQ ID NO :1的肽LL-37的用途，所述肽呈盐的 形式，优选乙酸盐形式。
[0045] 本发明也涉及肽的用途，所述肽选自上述的LL-20到LL-36。
[0046] 由于初级结构中的阳离子氨基酸残基赖氨酸和精氨酸，LL-37以及LL-25到LL-36 在中性pH具有净正电荷（+5到+7)。具体是LL-34和LL-35具有7个净正电荷。其它的氨 基酸残基是非极性的/疏水的或极性和中性的，或者在较小的程度上是极性的并带负电荷 的，这使得整个肽分子为两亲性的。这种肽与疏水面插入双层的带负电荷的磷脂微生物细 胞壁发生静电相互作用。疏水性和/或电荷中任一个减少都降低所述肽的抗微生物效应。 通常用溶血活性来评估肽对宿主细胞表现出的细胞毒性效应，该效应显示与肽的抗微生物 效应相关（Chen等，FEBS Lett 236:462-466,1988)。多项研究已确认对于其它两亲性的， a _螺旋的抗微生物肽这也是正确的。
[0047] 对具有37个氨基酸长度的兔CAP18 (Capl81Q6 142) C-末端肽的研究显示广谱抗菌活 性在高度基础的20个残基的N-末端序列中保留，但如果N-末端被截短，就不会保留该活 性（Larrick 等，Antimicrob Agents Chemother 37:2534-2539,1993)。
[0048] LL-37以及新的LL-20到LL-36肽可用自动肽合成仪并用合成肽的标准方法来合 成。
[0049] 本发明具体涉及所述LL-37肽或肽LL-20到LL-36的任一在制备用于治疗慢 性溃疡的药物中的用途。所述慢性溃疡可由于静脉功能不全，如腿溃疡，代谢功能异常， 如糖尿病，或免疫疾病，如脉管炎和坏疽性脓皮病造成。本发明的肽也可用于治疗由于 外伤或烧伤导致的伤口。所述肽具体可被用于上皮组织再生，并增强微型皮肤磨削术 (microdermabrasion)后的上皮再生。
[0050] 除了对细胞有毒性，LL-37在伤口环境迅速降解。近来显示丝氨酸蛋白酶3负责 hCAP18 的细胞外切割（S0reriseii等，Blood 97:3951-3959, 2001)。
[0051] 为预防所述肽的沉积也为减少内部细胞毒性，所述肽可用极性脂质载体配制。所 述制剂应便于将所述肽给药到伤口并另外提供给药后所述肽的延迟释放。这会在体内和体 外提高所述肽的稳定性。
[0052] 本发明的另一目的是药物组合物，其包含呈可药用盐或其衍生物形式的抗微生物 cathelicidin肽，与由成双层性极性脂质和水溶液组成的载体。
[0053] 所述cathelicidin肽除了人的LL-37外，还可衍生自不同动物物种，例如绵羊的 SC5，母牛的Bac5，猪的PR-39，小鼠的CRAMP，及兔的pl5,见图2。
[0054] 双层一般指极性脂质在水中的片层排列。酰基链形成了内部的疏水部分并 且极性头部-基团形成双层的亲水部分。极性的成双层性的脂质的例子，无论来源 是天然的还是合成的，可以提到的有磷脂酰胆碱，磷脂酰甘油，双半乳糖基甘油二酯 (digalactosyldiacylglycerol)，鞘磷脂等。依赖于所述极性脂质在极性溶剂如水中的浓 度，可形成脂质体或片层液晶类的粘性凝胶。
[0055] 所述药物组合物具体包含具有选自如下序列之一的氨基酸序列：
[0056] a) SEQ ID NO：1；
[0057] b)包含SEQ ID NO :1的N-末端片段的至少20个氨基酸的序列；
[0058] 呈可药用盐或其衍生物的形式的肽，以及由成双层性极性脂质和水溶液组成的载 体。
[0059] 优选的与所述肽混合或配制的成双层性极性脂质是那些电荷中性的。特别有用的 是双半乳糖基甘油二酯，及其它糖脂，如糖基神经酰胺（glycosyl ceramide)，无论是天然 的还是合成的，其中非离子性的糖部分（moiety)构成极性头部-基团。较不优选但仍有用 的是那些在生理环境是两性离子的和中性的极性脂质，如磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺和鞘 磷脂。最不优选的是那些带负电荷的极性脂质，因此与带正电荷的肽形成强的复合物。
[0060] 根据本发明所述的成双层性极性脂质载体优选选自磷脂，半乳糖脂或鞘脂。
[0061] 特别优选的成双层性极性脂质是双半乳糖基甘油二酯或富含双半乳糖基甘油二 酯的极性脂质混合物，这是由于这类极性脂质的极好的皮肤耐受性。双半乳糖基甘油二酯 是一类属于糖脂家族的脂质，是植物细胞膜的公知成分。丰度最大的类之一包含两个半乳 糖单位，并且它的常用命名和缩写是双半乳糖基甘油二酯，DGDG，有时称为半乳糖脂。半乳 糖脂，首先是DGDG和富含DGDG的物质，已经调查并发现它是工业应用如食品、化妆品和药 剂中有用的表面活性物质。WO 95/20944描述了富含D⑶G的物质"半乳糖脂物质"的用途， 它作为成双层性的物质在极性溶剂中用于制药、营养和化妆品用途。这些应用没公开半乳 糖脂以及通常的肽和蛋白的用途，具体没公开本发明的肽的用途。
[0062] 本发明优选方面涉及药物组合物，其中成双层性极性脂质载体是富含双半乳糖基 甘油二酯的极性脂质混合物。
[0063] 本发明另一优选方面是药物组合物，其中所述肽为乙酸盐形式。优选的肽为乙酸 盐形式的LL-37。特别优选的是药物组合物包含LL-37的乙酸盐与作为成双层性的脂质载 体的CPL-半乳糖脂。CPL-半乳糖脂是包含重量百分比为50-70%的双半乳糖基甘油二酯 和30-50%或其它极性脂质的半乳糖脂组分的商标。
[0064] 所述药物组合物中盐形式的所述肽和糖脂载体的比例应优选为重量比1:5到 1:50,特别优选是1:10 - 1:25。
[0065] 除了所述成双层性的脂质，所述载体也包含水溶液。水溶液指具有关于pH，离子强 度，等渗性等的生理学或可药用特性的溶液。作为例子可提及的水和其它生物相容性溶剂 的等渗溶液有水溶液，如生理盐水和葡萄糖溶液，以及形成水凝胶的物质。所述水溶液可以 是缓冲的，如磷酸盐缓冲盐水PBS。
[0066] 此药物组合物可还包含可药用赋形剂，如防腐剂来预防微生物在组合物中生长， 抗氧化剂，等渗剂，着色剂等。在水的悬浮液中所述组合物可以与悬浮剂和稳定剂组合。[0067] 组合物的胶体性质使其能通过使用最终的过滤除菌步骤来制备无菌的组合物。
[0068] 为形成凝胶，所述肽优选用形成水凝胶的物质配制。形成水凝胶的物质的例子是 合成的聚合物，如聚乙稀醇，聚乙稀吡略烧酮，聚丙稀酸，聚乙二醇，泊洛沙姆（poloxamer) 嵌段共聚物等；半合成聚合物，如纤维素酯，包括羧甲基纤维素，羟乙基纤维素，羟丙基纤 维素，甲基纤维素，甲基羟丙基纤维素和乙基羟乙基纤维素等；天然的胶，如阿拉伯树胶 (acacia)，角叉藻聚糖（carragenan)，壳聚糖（chitosan)，果胶，淀粉，黄原胶等。
[0069] 使用粘膜附着性（muco-adhesive)的水凝胶是有利的。该方面特别有用的是使用 透明质酸及其衍生物，卡波姆（carbomer)和聚卡波菲（polycarbophil)类的交联的聚丙稀 酸，已知会强有力地附着到粘膜的从凝胶容易得到的聚合物。
[0070] 用泊洛沙姆类的嵌段共聚物也是有利的，即为包含聚乙二醇和聚丙二醇嵌段的聚 合物。分散在水中的某些泊洛沙姆是热致可逆的（thermoreversible):在室温它们是低粘 性的，但随温度升高显示出明显的粘性增加，导致在体温形成凝胶。因此将药物制剂向相对 温暖的伤口给药的接触时间可能会延长，因此可提高所掺入的肽的有效性。
[0071] 本发明药物组合物可被配制用来局部或肠道，也就是口腔，颊，舌下，粘膜，鼻腔， 支气管，直肠，和阴道给药。
[0072] 局部给药的药物组合物的非限制性例子是溶液，喷雾，悬浮液，乳状液，凝胶和膜。 如需要，可用添加了药物组合物的绷带或急救绷带（band aid)或膏剂（plaster)。片剂，胶 囊，溶液或悬浮液可用于肠道给药。
[0073] 本发明另一方面涉及肽通过非裂解机制在体外使上皮细胞和/或基质细胞增殖 的用途，所述肽呈可药用盐或其衍生物的形式，具有选自如下序列之一的氨基酸序列：
[0074] a)SEQ ID NO：1 ；
[0075] b)包含SEQ ID NO :1的N-末端片段的至少20个氨基酸的序列；
[0076] 所述的增殖能具体用于人的自体上皮细胞和基质细胞的体外增殖。
[0077] 本发明也涉及培养真核细胞，如上皮细胞和/或基质细胞的生长培养基，其包 含LL-37或所述肽与基础培养基的组合。可加入细胞毒性降低试剂如血清。已经发现 载脂蛋白A-I (ap〇A-I)是人血浆中主要的结合LL-37的蛋白并作为LL-37的清除剂 (scavenger) (Wang等，J Biol Chem273:33115_33118, 1998 ;S0l*ensen et al，J Biol Chem 274:22445-22451，1999)，这提示了调控cathelicidin肽所涉及的机制。细胞毒性降低试 剂也可以是成双层性极性脂质，如选自上述磷脂，半乳糖脂或鞘脂的脂质。
[0078] 本发明生长培养基的基础培养基基于双蒸馏水（double-distilled water)，及若干如下成分：无机盐，酸红，葡萄糖，胸苷（thymidine)，次黄噪呤核苷酸 (hypoxanthinine)，HEPES，丙酮酸钠，氨基噪呤，氨基酸和维生素。为了在体外培养上皮细 胞，如例如角质形成细胞，生长培养基可包含基础培养基和促进生长的试剂盒，该试剂盒包 括a)盐溶液中的LL-37肽，b)青霉素+链霉素，c)胰岛素，d)转铁蛋白，e)三碘甲腺原氨 酸（triiodotyronine)，f)氢化可的松，g)霍乱毒素，可选的细胞毒性降低试剂，如血清或 极性脂质。为了在体外培养基质细胞，例如成纤维细胞，生长培养基可包含基础培养基和促 进生长的试剂盒，该试剂盒包括a)盐溶液中的LL-37肽，b)青霉素+链霉素，及可选的细 胞毒性降低试剂，如血清或极性脂质。
[0079] 本发明其它目的是增强人的自体上皮细胞和基质细胞的体外扩展（expansion) 用于体内细胞移植的方法，其中所述细胞分离自健康皮肤的切片（excised piece)，所分离 的细胞在本发明的生长培养基中体外培养，之后收获所培养的细胞并用于伤口治疗，如烧 伤和溃疡。
[0080] 本发明也涉及促进生长的试剂盒，其包含肽LL-37或所述肽，和细胞毒性降低的 成双层性极性脂质，并可选包含在单独容器中的抗生素，基础培养基，及其它常用添加物。
[0081] 本发明又一方面涉及将全长hCAP18cDNA构建体转染到自体的人角质形成细胞用 于溃疡和烧伤的细胞移植。所述cDNA构建体被设计为能够通过开关机制调节hCAP18基因 的表达（Resnitzky等，Mol Cell Biol 14:1669-1679,1994)。自体的人角质形成细胞得自 患者的健康皮肤切片。所述角质形成细胞如所述在细胞培养物中分离并扩展。所述cDNA构 建体转染到角质形成细胞。然后将所转染的角质形成细胞进一步在体外扩展并送回患者。
[0082] 本发明具体涉及包含具有序列SEQ ID NO :20的hCAP18完整cDNA序列的基因构 建体的用途，所述用途是为了转染上皮和/或基质细胞来增强所述细胞的增殖。
[0083] 1.肽和它的可药用盐及其衍生物，所述肽具有LL-37的SEQ ID NO :1的N-末端 片段的至少20个氨基酸