药物组合物及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001]本发明涉及再生医学、生物材料学及干细胞生物学领域，具体地涉及药物组合物及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002]皮肤作为人体最大的组织，是与外界环境接触的屏障，当由于外界损伤或疾病等因素造成皮肤缺损时，常常造成创面水分、电解质及蛋白质的丢失，开放的创面还增加了感染的概率。早期、有效地封闭创面可以减少上述并发症的发生，临床上常用的是凡士林纱布和断层/全厚皮片，其中自体断层皮片移植是公认的标准疗法。但是在大面积皮肤缺损患者，仍存在着供区不足及造成机体新的损伤等缺陷。
[0003]自组装多肽水凝胶材料是近十年刚刚兴起的研究领域，初步应用结果已显露出了其在组织工程和组织再生修复方面的巨大潜力。合成的具有仿生功能的自组装多肽RADA16-1 (Ac-RADARADARADARADA-C0NH2)是该类多肽的代表，该短肽由16个疏水和亲水氨基酸交替排列组成，形成稳定的β折叠，在适当PH的水溶液内自组装形成排列有序的纳米纤维。其水溶液吸水量高达99.5%以上，纳米纤维交叉形成具网状骨架的类似于细胞外基质的立体水凝胶结构，对细胞起支持作用。该材料具有良好的细胞和组织相容性，无毒，植入体内后可逐步被吸收，是理想的组织工程材料。
[0004]目前，将自组装多肽水凝胶用于皮肤的伤口愈合和毛囊再生尚未有报导。
【发明内容】
[0005]本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效用于皮肤愈合和毛囊再生的手段。
[0006]在本发明的一个方面，本发明提供一种用于皮肤愈合和毛囊再生的药物组合物。根据本发明的实施例，该药物组合物包括:自组装多肽水凝胶，所述自组装多肽水凝胶是由RADA16-1和PRG(Ac-(RADA)4GPRGDSGYRGDS-C0NH2)的至少一种形成的；以及皮肤细胞，所述皮肤细胞设置于所述自组装多肽水凝胶内部。发明人发现，利用本发明的该药物组合物，能够有效促进皮肤愈合和毛囊再生。另外，本发明的药物组合物中的自组装多肽水凝胶全人工合成，不传播动物源性疾病，可根据不同组织的特点和用途灵活添加不同分子的功能片段，使之更具有组织特异性，有利于组织特异性干细胞分化微环境的构建，且材料来源更加稳定，质量标准易于控制。
[0007]根据本发明实施例的药物组合物，还可以具有下列附加技术特征:
[0008]根据本发明的实施例，当所述水凝胶由RADA16-1和PRG共同形成时，在所述自组装多肽水凝胶中，所述RADA16-1和所述PRG的质量比为1:1。
[0009]根据本发明的实施例，在所述自组装多肽水凝胶中，所述皮肤细胞的含量为14-1O8 个 /mL。
[0010]根据本发明的实施例，所述皮肤细胞为选自真皮细胞和表皮细胞的至少一种。
[0011]根据本发明的实施例，所述真皮细胞为新分离的真皮细胞或培养0-30代的真皮干细胞。
[0012]根据本发明的实施例，所述表皮细胞为新分离的表皮细胞或培养0-30代的表皮干细胞。
[0013]根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括:有利于细胞存活、生长的细胞活性因子和/或细胞外基质分子。根据本发明的实施例，所述细胞活性因子为选自bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、EGF (表皮细胞生长因子)的至少一种，所述细胞外基质分子为选自透明质酸、纤维粘连蛋白的至少一种。由此，能够有效促进皮肤细胞的存活和生长，进而促进皮肤愈合和毛囊再生的效果较好。
[0014]在本发明的另一方面，本发明提供了一种制备前面所述的药物组合物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括:(I)提供RADA16-1溶液和PRG溶液，其中，所述RADA16-1溶液的浓度为0.l-lg/100ml，所述PRG溶液的浓度为0.l-lg/100ml ； (2)将所述RADA16-1溶液和所述PRG溶液等体积混合，以便获得混合水凝胶溶液；(3)在所述RADA16-1溶液、所述PRG溶液或所述混合水凝胶溶液中接种皮肤细胞，并在适于所述皮肤细胞生长的条件下进行孵育，以便获得所述药物组合物。发明人发现，利用本发明的该方法能够快速有效地制备前面所述的药物组合物，且操作简单、方便快捷、容易控制、易于实现规模化生产。
[0015]根据本发明的实施例，在步骤(2)之前，预先将所述RADA16-1溶液和所述PRG溶液进行0.22 μ m过滤除菌处理。
[0016]根据本发明的实施例，所述接种细胞进一步包括:用10%无菌蔗糖溶液将所述皮肤细胞配成浓度为14-1O8个/mL的细胞悬液，将所述混合水凝胶溶液和所述细胞悬液按照体积比为5:1的比例混合。
[0017]根据本发明的实施例，所述孵育进一步包括:每隔30分钟，移除孔板中的培养基，补加等体积新鲜培养基到孔板中，重复3-5次。根据本发明的实施例，所述培养基中包含有利于细胞存活、生长的细胞活性因子和/或细胞外基质分子，根据本发明的实施例，所述细胞活性因子为选自bFGF、EGF的至少一种，所述细胞外基质分子为选自透明质酸、纤维粘连蛋白的至少一种。由此，能够有效促进皮肤细胞的存活和生长，进而促进皮肤愈合和毛囊再生的效果较好。
[0018]根据本发明的实施例，所述RADA16-1溶液的浓度为lg/100mL。
[0019]根据本发明的实施例，所述PRG溶液的浓度为lg/100mL。
[0020]根据本发明的实施例，所述皮肤细胞为选自表皮细胞和真皮细胞的至少一种。
[0021]根据本发明的实施例，所述真皮细胞为新分离的真皮细胞或培养0-30代的真皮干细胞。
[0022]根据本发明的实施例，所述表皮细胞为新分离的表皮细胞或培养0-30代的表皮干细胞。
[0023]在本发明的又一方面，本发明提供了前面所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于皮肤愈合和毛囊再生。
[0024]在本发明的再一方面，本发明提供了一种用于皮肤愈合和毛囊再生的药物。根据本发明的实施例，该药物包含前面所述的药物组合物。发明人发现，本发明的药物能够有效用于皮肤愈合和毛囊再生。
【附图说明】
[0025]图1显示了根据本发明的实施例，本发明的药物组合物的外观形态图；
[0026]图2显示了根据本发明的实施例，培养I天时，药物组合物中真皮干细胞的共聚焦显微镜照片；
[0027]图3显示了根据本发明的实施例，培养3天时，药物组合物中真皮干细胞的共聚焦显微镜照片；
[0028]图4显示了根据本发明的实施例，药物组合物中真皮干细胞的Α0/ΡΙ双染色图；
[0029]图5显示了根据本发明的实施例，药物组合物中真皮干细胞的碱性磷酸酯酶(AP)染色图；
[0030]图6显示了根据本发明的实施例，移植药物组合物3周后，裸鼠皮肤愈合和毛囊再生情况结果图；
[0031]图7显示了根据本发明的实施例，培养I天后，MSC在由不同浓度的混合水凝胶溶液形成的水凝胶中的倒置显微镜照片，其中，
[0032]图7A为MSC在由多肽浓度为0.1g/1OOmL的混合水凝胶溶液形成的水凝胶中的倒置显微镜照片，
[0033]图7B为MSC在由多肽浓度为0.5g/100mL的混合水凝胶溶液形成的水凝胶中的倒置显微镜照片，
[0034]图7C为MSC在由多肽浓度为lg/100mL的混合水凝胶溶液形成的水凝胶中的倒置显微镜照片；
[0035]图8显示了根据本发明的实施例，培养3天后，真皮干细胞在RADA16-1自组装多肽水凝胶中的生长情况。
【具体实施方式】
[0036]下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以