一种格列吡嗪的药物组合物及其医药用图
【专利摘要】本发明公开了一种格列吡嗪的药物组合物及其医药用途，本发明提供的格列吡嗪的药物组合物中含有格列吡嗪和一种结构新颖的天然产物化合物(Ⅰ)，格列吡嗪、化合物(Ⅰ)单独作用时，对肾小球肾炎具有治疗作用；格列吡嗪和化合物(Ⅰ)联合作用时，治疗效果进一步提高，可开发成治疗肾小球肾炎的药物，与现有技术相比具有突出的实质性特点和显著的进步。
【专利说明】
一种格列吡嗪的药物组合物及其医药用途
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及格列吡嗪的新用途，具体涉及一种格列吡嗪的药 物组合物及其医药用途。
【背景技术】
[0002] 格列吡嗪主要用于单用饮食控制治疗未能达到良好效果的轻、中度非胰岛素依赖 型病人，药治疗有效率约87%。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种格列吡嗪的药物组合物，该药物组合物中含有格列吡 嗪和一种天然产物，格列吡嗪和该天然产物可以协同治疗肾小球肾炎。
[0004] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0005] 一种具有下述结构式的化合物a)，
[0006]
[0007] -种格列吡嗪的药物组合物，包括格列吡嗪、如权利要求1所述的化合物（I)和药 学上可以接受的载体，制备成需要的剂型。
[0008] 进一步地，药学上可以接受的载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、 崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体或润滑剂。
[0009] 进一步地，所述剂型包括片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、 膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。
[0010] 上述化合物（I)的制备方法，包含以下操作步骤：（a)将九里香粉碎，用75~85%乙 醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃 取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中正丁醇萃取物 用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再用70%乙醇洗脱10个柱体积，收集70% 洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中70%乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶 分离，依次用体积比为60:1、30:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；（d) 步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为8:1、4:1和2:1的二氯甲烷-甲醇 梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积 百分浓度为75%的甲醇水溶液等度洗脱，收集10~15个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得 到化合物(I)。
[0011] 进一步地，化合物（I)的制备方法中，步骤(a)用80%乙醇热回流提取，合并提取 液。
[0012] 进一步地，化合物（I)的制备方法中，所述大孔树脂为DlOl型大孔吸附树脂。
[0013]进一步地，化合物（I)的制备方法中，步骤(a)中用二氯甲烷代替乙酸乙酯进行萃 取，得到二氯甲烷萃取物。
[0014] 上述化合物(I)在制备治疗肾小球肾炎的药物中的应用。
[0015] 上述格列吡嗪的药物组合物在制备治疗肾小球肾炎的药物中的应用。
[0016] 本发明的优点：
[0017] 本发明提供的格列吡嗪的药物组合物中含有格列吡嗪和一种结构新颖的天然产 物，格列吡嗪、化合物（I)单独作用时，对肾小球肾炎具有治疗作用;格列吡嗪和化合物（I) 联合作用时，治疗效果进一步提高，可开发成治疗肾小球肾炎的药物。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0019] 实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0020] 试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化 学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0021]分离方法：（a)将九里香(2kg)粉碎，用80%乙醇热回流提取（15LX3次），合并提取 液，浓缩至无醇味（3L)，依次用石油醚（3L X 3次）、乙酸乙酯（3L X 3次）和水饱和的正丁醇 (3LX3次）萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中 正丁醇萃取物用DlOl型大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再用70%乙醇洗脱10 个柱体积，收集70%洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中70%乙醇洗脱 浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为60:1 (10个柱体积）、30:1 (8个柱体积）、15:1 (10个 柱体积)和5:1(8个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；（d)步骤(c)中组分4用 正相硅胶进一步分离，依次用体积比为8:1 (10个柱体积）、4:1 (8个柱体积)和2:1 (6个柱体 积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反 相硅胶分离，用体积百分浓度为75 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集10~15个柱体积洗脱液， 洗脱液减压浓缩得到化合物(I)(纯度大于98% )。
[0022] 结构确证:HR-ESI-MS显示[Μ+Na]+为m/z 271.1316,结合核磁特征可得分子式为 〇1出2()03，不饱和度为6。核磁共振氢谱数据611(卯 111，0130-(16,6001〇^):!1-1(2.02，(1(1，了 = 13·4,9·9)，H-l(1.68，br，d，J=13.4)，H-3(2.17，d，J=13.6)，H-3(1.72，dd，J=13.6， 1.4)，H-5(2.83，br，d，J = 9.5)，H-6(5.34，br，s)，H-8(2.98，br，d，J = 9.9)，H-9(2.16，m)， H-10(0.93，d，J = 6.8)，H-ll(6.21，m)，H-12(6.08，m)，H-13(4.17，br，d，J=14.1)，H-13 (4.08，&，(1，了=14.1)，!1-14(1.26,8) ;核磁共振碳谱数据6。(卯111，0130-(16，1501〇^):39.1 (CH 2，1-C)，49.5(C，2-C)，49.2(CH2,3-C)，62.8(C，4-C)，60.6(CH，5-C)，128.4(CH，6-C)， 147.1(C，7-C)，49.3(CH，8-C)，43.4(CH，9-C)，13.3(CH 3，10-C)，133.6(CH，11-C)，133.8 (CH，12-C)，61.1(CH2，13-C)，23.5(CH3，14-C)，182.1(C，15-C)<JR 光谱表明该化合物含有羰 基（1693(3!^1)功能团。13C-NMR谱显示15个碳信号，包括两个甲基，三个亚甲基（一个含氧亚 甲基），六个次甲基(三个烯属次甲基），以及四个季碳(一个烯烃季碳，一个羰基碳） 谱显示两个甲基信号[6!10.93(3!1，(1，1 = 6.8抱，]\^-10)和1.26(3!1，8，]\^-14)]，一个含氧亚 甲基质子信号[SH4.17(lH，br，d，J=14.1Hz，H-13WP4.08(lH，br，d，J=14.1Hz，H-13)]，& 及三个烯属次甲基信号WH5.34(lH，br，s，H-6)，6.21(lH，m，H-llMP6.08(lH，m，H-12)]。 HMBC谱中羟甲基质子信号与C-6和C-7的相关性表明羟甲基质子与C-7位相连。HMBC相关性 表明，甲基基团[δΗ1.26(Μ θ-14)]和羧酸基团0C182.1，C-15)与季碳C-2(SC49.5)相连，相 邻的为两个亚甲基官能团（C-1和(XB) 13HMBC谱中Η-3Α(δΗ2.17)与C-5和C-9,以及Η-3Β(δ HI. 72)与C-8的相关性表明季碳C-4为三个五元环的中心。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和ROESY 谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如下所示，立体构型进一步通过 ECD试验确定，理论值与实验值基本一致。
[0023] 该化合物化学式及碳原子编号如下：
[0024]
[0025] 实施例2:药理作用
[0026]本实施例使用阳离子化小牛血清白蛋白（C-BSA)致膜性肾小球肾炎大鼠模型，观 察药物对膜性肾小球肾炎大鼠肾脏功能的改善作用。
[0027] 1、材料与方法
[0028] 1.1动物
[0029] SD大鼠由广州中医药大学动物中心提供。NIH小鼠由广东卫生厅实验动物中心提 供。
[0030] 1.2试剂与样品
[0031 ]格列吡嗪购自中国药品生物制品检定所。化合物（I)自制，制备方法见实施例1。雷 公藤多苷片:上海医科大学红旗制药厂产品；小牛血清白蛋白（BSA)来自北京天象人生物工 程有限责任公司。无水乙二胺(EDA)、碳化二亚胺(EDC)均为分析纯试剂。其他生化测试试剂 来自南京建成生物工程研究所。
[0032] 1.3阳离子化小牛血清蛋白（C-BSA)的制备
[0033] 用671111^04加5001^双蒸水，然后缓慢加入6111〇1/1盐酸3501^，调?!1至4.75，保持溶 液在25 °C ;将5gBSA溶解于25mL双蒸水，再将此溶液缓慢加入EDA溶液，不断搅拌，使液温恒 定25 °C，加入1.8gEDC; 2h后用pH为4.75的醋酸缓冲液30mL终止反应，即得等电点提高的C-BSA溶液。用4 °C双蒸水透析72h (每3至5h换水)C-BSA溶液，冷冻干燥，得等电点(PI)为8.4以 上的C-BSA粉剂，保存于-20 °C备用。
[0034] 1.4大鼠分组及模型制备
[0035] 选取雄性SD大鼠60只，体重150~200g，随机分为6组，分别为:正常对照组、模型对 照组、阳性对照组（雷公藤多苷16.5mg · kg<)、格列吡嗪组（80mg · kg<)、化合物（I)组 (80mg · kg-1K格列吡嗪与化合物（I)组合物组【40mg · kg-1格列吡嗪+40mg · kg-1化合物 (I)】。除正常对照组10只，不作任何处理，正常饲养外，其余各组大鼠均分别取C-BSA I.Omg 与弗氏不完全佐剂〇. ImL混均，大鼠皮下多点注射预免疫。每只大鼠预免疫1周后，每只注射 C-BSA，先腹腔注射1周，第1天至第7天的剂量依次为1.0mg、l .0mg、l .0mg、l .5mg、l .5mg、 2mg、2mg。第2周起，每次在灭菌条件下尾静脉注射2.5mg C-BSA，同时各组灌胃给予上述剂 量的药物，正常对照组与模型对照组给予等容量的生理盐水。
[0036] 1.5大鼠尿蛋白定量实验
[0037]分别在给药第14天和第32天收集各大鼠24h尿液，进行尿蛋白定量实验。
[0038] 1.6大鼠血清生化指标测定实验
[0039] 给药后32d，从眼眶静脉取血，检测血清总蛋白、血清尿素氮含量。
[0040] 1.7统计学方法
[0041] 所有结果进行t检验。
[0042] 2、实验结果
[0043] 2.1对C-BSA致膜性肾炎模型大鼠尿蛋白的影响
[0044]与正常对照组比，模型对照组大鼠尿蛋白总量显著升高(P〈0.01)，说明造模成功； 与模型对照组比，阳性对照组大鼠尿蛋白总量显著下降(P〈〇.01);与模型对照组比，格列吡 嗪与化合物（I)组合物组大鼠尿蛋白总量显著下降（p〈0.01);与模型对照组比，格列吡嗪 组、化合物（I)组大鼠尿蛋白总量都下降(P〈〇.05)。
[0045] 试验结果见表1。
[0046] 2.2对C-BSA致膜性肾炎模型大鼠血清生化指标的影响
[0047]与正常对照组比，模型对照组大鼠血清总蛋白量显著降低(P〈0.01)、血清尿素氮 含量显著升高(P〈〇.01)，说明造模成功;与模型对照组比，阳性对照组大鼠血清总蛋白量显 著升高(P〈0.01)、血清尿素氮含量显著降低(P〈0.01);与模型对照组比，格列吡嗪与化合物 (I)组合物组大鼠血清总蛋白量显著升高(P〈〇.01)、血清尿素氮含量显著降低(P〈〇.01);与 模型对照组比，格列吡嗪组、化合物（I)组大鼠血清总蛋白量升高(P〈〇.05)、血清尿素氮含 量降低(p〈0.05)。
[0048] 试验结果见表1。
[0049] 表1对C-BSA肾炎模型大鼠尿蛋白、血清蛋白、血清尿素氮含量的影响（f 土S:)
[0051 ]用阳离子化小牛血清白蛋白复制的膜性肾小球肾炎动物模型，其免疫发病机理和 人类肾小球肾炎非常近似，是一种较理想的慢性肾小球肾炎病理模型。本研究以大鼠为实 验动物，用C-BSA复制慢性血清病模型，并产生膜性肾炎病变。
[0052] 上述结果表明，格列吡嗪、化合物（I)单独作用时，对肾小球肾炎具有治疗作用;格 列吡嗪和化合物(I)联合作用时，治疗效果进一步提高，可开发成治疗肾小球肾炎的药物。
[0053] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 一种具有下述结构式的化合物（I)，2. -种格列吡嗪的药物组合物，其特征在于:包括格列吡嗪、如权利要求1所述的化合 物(I)和药学上可以接受的载体，制备成需要的剂型。3. 根据权利要求2所述的格列吡嗪的药物组合物，其特征在于:药学上可以接受的载体 包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体 或润滑剂。4. 根据权利要求2所述的格列吡嗪的药物组合物，其特征在于:所述剂型包括片剂、胶 囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、 栓剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。5. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于，包含以下操作步骤：（a)将九 里香粉碎，用75~85%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙 酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b) 步骤(a)中正丁醇萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再用70%乙醇洗 脱10个柱体积，收集70%洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中70%乙醇 洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为60:1、30:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度 洗脱得到4个组分；（d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为8:1、4:1和 2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反 相硅胶分离，用体积百分浓度为75 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集10~15个柱体积洗脱液， 洗脱液减压浓缩得到化合物(I)。6. 根据权利要求5所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:步骤(a)用80%乙醇热回 流提取，合并提取液。7. 根据权利要求5所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:所述大孔树脂为DlOl型 大孔吸附树脂。8. 根据权利要求5所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:步骤(a)中用二氯甲烷代 替乙酸乙酯进行萃取，得到二氯甲烷萃取物。9. 权利要求1所述的化合物（I)在制备治疗肾小球肾炎的药物中的应用。10. 权利要求2~4任一所述的格列吡嗪的药物组合物在制备治疗肾小球肾炎的药物中 的应用。
【文档编号】C07C62/32GK106008203SQ201610334014
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月19日
【发明人】蒋灵锟
【申请人】蒋灵锟