一种加巴喷丁的药物组合物及其医药用图
【专利摘要】本发明公开了一种加巴喷丁的药物组合物及其医药用途，本发明提供的加巴喷丁的药物组合物中含有加巴喷丁和一种结构新颖的天然产物化合物(Ⅰ)，加巴喷丁和该天然产物单独作用时，对脱发具有治疗作用；二者联合作用时，对脱发的治疗效果进一步提高，可以开发成治疗脱发的药物。本发明与现有技术相比具有突出的实质性特点和显著的进步。
【专利说明】
一种加巴喷丁的药物组合物及其医药用途
技术领域
[0001 ]本发明属于生物医药领域，涉及加巴喷丁的新用途，具体涉及加巴喷丁的药物组 合物及其在脱发中的应用。
【背景技术】
[0002] 加巴喷丁在各种动物模型中均显示预防癫痫的作用，另外，在动物痉挛、镇痛和肌 萎缩性侧索硬化模型中也显示作用。加巴喷丁对脑组织的新颖结合点有高的亲和性，它能 通过氨基酸转移体通过体内一些屏障，同其它抗惊厥药相比，加巴喷丁具有较小的行为和 心血管副作用。加巴喷丁对脑组织的新颖结合点有高的亲和性，它能通过氨基酸转移体通 过体内一些屏障，同其他抗惊厥药相比，加巴喷丁具有较小的行为和心血管副作用。
[0003] 加巴喷丁常用于常规抗癫痫药不能满意控制或不能耐受的局限性发作的癫痫患 者，以及局限性发作并继而全身化的癫痫患者的附加治疗。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种加巴喷丁的药物组合物，该药物组合物中含有加巴喷 丁和一种结构新颖的天然产物，加巴喷丁和该天然产物可以协同治疗脱发。
[0005] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0006] 一种具有下述结构式的化合物（I)，
[0008] -种加巴喷丁的药物组合物，包括加巴喷丁、如权利要求1所述的化合物（I)和药 学上可以接受的载体，制备成需要的剂型。
[0009] 进一步地，药学上可以接受的载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、 崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体或润滑剂。
[0010] 进一步地，所述剂型包括片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、 膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。
[0011] 上述化合物（I)的制备方法，包含以下操作步骤：（a)将忍冬藤粉碎，用75~85%乙 醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃 取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中正丁醇取物用 大孔树脂除杂，先用25 %乙醇洗脱8个柱体积，再用70 %乙醇洗脱12个柱体积，收集70 %洗 脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中70%乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分 离，依次用体积比为85:1、45:1、25:1和15:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；（d)步 骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇 梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积 百分浓度为72%的甲醇水溶液等度洗脱，收集10~16个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得 到化合物(I)。
[0012] 进一步地，化合物（I)的制备方法中，步骤(a)用80%乙醇热回流提取，合并提取 液。
[0013] 进一步地，化合物（I)的制备方法中，所述大孔树脂为D101型大孔吸附树脂。
[0014]进一步地，化合物（I)的制备方法中，步骤(a)中用二氯甲烷代替乙酸乙酯进行萃 取，得到二氯甲烷萃取物。
[0015] 上述化合物(I)在制备治疗脱发的药物中的应用。
[0016] 上述加巴喷丁的药物组合物在制备治疗脱发的药物中的应用。
[0017]本发明的优点：
[0018] 本发明提供的加巴喷丁的药物组合物中含有加巴喷丁和一种结构新颖的天然产 物，加巴喷丁和该天然产物单独作用时，对脱发具有治疗作用；二者联合作用时，对脱发的 治疗效果进一步提高，可以开发成治疗脱发的药物。本发明与现有技术相比具有突出的实 质性特点和显著的进步。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0020] 实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0021] 分离方法：（a)将忍冬藤(2kg)粉碎，用80%乙醇热回流提取（15LX3次），合并提取 液，浓缩至无醇味（3L)，依次用石油醚（3L X 3次）、乙酸乙酯（3L X 3次）和水饱和的正丁醇 (3LX3次）萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中 乙酸乙酯萃取物用D101型大孔树脂除杂，先用25%乙醇洗脱8个柱体积，再用70%乙醇洗脱 12个柱体积，收集70%洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中70%乙醇洗 脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1 (10个柱体积）、45:1 (8个柱体积）、25:1 (10 个柱体积)和15:1 (8个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得至1」4个组分；（d)步骤(c)中组分 4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1 (10个柱体积）、15:1 (8个柱体积)和1:1 (6个 柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合 的反相硅胶分离，用体积百分浓度为72 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集10~16个柱体积洗 脱液，洗脱液减压浓缩得到化合物（I) (HPLC归一化纯度大于98% )。
[0022] 结构确证:册431-]\^显示[]\?^]+为111/2 549.2308，结合核磁特征可得分子式为 C33H34〇6，不饱和度为 17。核磁共振氢谱数据δΗ(ρρπι，DMS〇-d6，500MHz): H-2 (6 · 47，s)，H-6 (6.42，s)，H-a(6.71，d，J=16.2)，H-0(6.85，d，J=16.2)，H-2'，6'（7.71，d，J = 8.5)，H-3'， 5'（7.12，d，J = 8.5)H-3"（6.49，d，J = 2.3)，H-5"（6.42，dd，J = 8.2,2.3)，H-6"（7.18，d，J = 8·2)，Η-α'（2·34，πι，2Η)，Η-β'（2·21，πι，2Η)，Η-γ，（4.39，t，J = 8.2)，H-2" '，6" '（7.15，d，J = 8.2)，H-3" '，5" '（6.57，d，J = 8.2)，3-0CH3(3.71，s)，4'-0CH3(3.82，s)，2"-0CH 3(3.73， s)，4"-OCH3(3 · 84，s);核磁共振碳谱数据δ。(ppm，DMS〇-d6，125MHz): 130 · 1 (C，1-C)，105 · 6 (CH，2-C)，157.4(C，3-C)，118.8(C，4-C)，157.6(C，5-C)，105.7(CH，6-C)，126.5(CH，a-C)， 127.9(CH，0-C)，137.1(C，1'-C)，128.2(CH，2'，6'-C)，116.1(CH，3'，5'-C)，157.6(C，4'-C)，123.5(C，1"-C)，159.3(C，2"-C)，99.2(CH，3"-C)，157.0(C，4"-C)，107.1(CH，5"-C)， 130.6(CH，6"-C)，29.4(CH 2，a'-C)，34.1(CH2，P'-C)，40.6(CH，γ，-C)，138.0(C，l" '-C)， 129.7(CH，2" '，6" '-C)，114.8(CH，3" '，5" '-C)，155.3(C，4" '-C)，55.7(CH3,3-0CH3)，55.6 (CH3，4 ' -OCH3)，56 · 2 (CH3，2" -OCH3)，55 · 7 (CH3，4" -OCH3)。h-NMR和1H-1!! COSY谱显示出两对 双质子双峰[SH7.71(2H，d，J = 8.5Hz)，7.12(2H，d，J = 8.5Hz)，7.15(2H，d，J = 8.2Hz)，6.57 (2H，d，J = 8.2Hz)]，表明该化合物含有两个1，4-二取代芳环。此外，观察到一组ABX的耦合 信号 SH6.49(lH，d，J = 2.3Hz)，6.42(lH，dd，J = 8.2,2.3Hz)和 7.18(1!1，(1，了 = 8.2!^)，表明 该化合物含有一个1，2，4-三取代芳环。另一对双质子单峰信号δΗ6.47(1H，s)和6.42(1H， s)，说明含有一个1，3,4,5_四取代芳香环。除了芳族质子，还有两个反式烯烃质子信号δ !16.71(1!1，(1，1=16.2泡）和6.85(1!1，(1，1=16.2泡），两个亚甲基脂肪族质子信号[6!12.34 (111，2!0,2.21(111，2!0]，一个次甲基信号[6!14.39(1!1，^ = 8.2抱）]，以及四个甲氧基信号[6 H3.71，3.73,3.82,3.84(3H，s)]。13C-NMR和HSQC谱显示了 33个碳信号，包括六个含氧季碳， 五个芳香族季碳，十三个芳香族次甲基碳，三个脂族次甲基碳，两个脂族亚甲基碳，四个甲 氧基碳。HMBC谱中，反式烯烃质子与对-甲氧基苯和四取代苯环的相关性表明该化合物为共 辄芪类化合物。HMBC谱中C-3、C-4和C-5与脂肪族次甲基质子信号的相关性表明chalcane单 元与C-4相连。HMBC谱中各甲氧基信号分别与C-3，C-4 '，C-2"和C-4"的相关性表明(：-3，(：-4 '，C-2"和C-4"各连有一个甲氧基基团。此外，通过HMBC和N0ESY实验确认了亚甲基碳C-α ' 与三取代苯环的C-Γ相连，C-γ '与对-羟基苯环连接。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和N0ESY谱， 以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如下所示，立体构型进一步通过ECD 试验确定，理论值与实验值基本一致。
[0023]该化合物化学式及碳原子编号如下：
[0025] 实施例2:药理作用
[0026]脱发是一种最常见皮肤疾病。长期以来，人们一直致力于寻找和研发治疗脱发的 药物，如糖皮质激素、米诺地尔等。然而到目前为止，尚没有一种药物能完全治愈脱发，且存 在较大的不良反应。因此，开发疗效确切、无不良反应的防治脱发的药物具有重要的社会意 义和经济意义。本实施例采用环磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)建立小鼠脱毛模型，观察 药物对改善脱毛小鼠毛发生长的作用。
[0027] 1、材料与方法
[0028] 1.1动物
[0029] SPF级，雄性C57BL/6小鼠，体质量18~20g，上海斯莱克实验动物有限公司。饲养环 境:室温控制在24~26°C，光线每12h明暗交替，自由进食，隔日更换垫料。
[0030] 1.2试剂与样品
[0031] 加巴喷丁购自中国药品生物制品检定所。化合物（I)自制，制备方法见实施例1。环 磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司）<XBA检测试剂盒(美国，BD公司）、CD4检测试剂盒(上 海颖心实验室设备有限公司）、CD8检测试剂盒(上海颖心实验室设备有限公司）。
[0032] 1.3仪器
[0033] JEM-1010型电镜（日本，日本电子公司）、C6型流式细胞仪(美国，BD公司）、MK3型酶 标仪(美国，Thermo公司）。
[0034] 1.4小鼠分组及模型制备
[0035] C57BL/6小鼠用麻醉机麻醉。麻醉后，将松香和石蜡按1:1的比例混合加热融化，并 均匀涂抹于项背部，凝固变硬后揭去，诱导生长期毛发，每只小鼠脱毛面积约为2. OcmX 2.0cm。注意不要烫伤小鼠皮肤。脱毛后9天(小鼠背部皮肤诱导生长期毛囊产生），根据随机 数字表，将小鼠分为5组，每组20只，分别是空白对照组、模型对照组、加巴喷丁组（280mg· kg-0、化合物（I)组(280mg · kg-4、加巴喷丁与化合物（I)组合物组【140mg · kg-1加巴喷丁+ 140mg · kg<化合物（I)】。所有小鼠脱毛区皮下注射CTX150mg/kg后，模型组任其自然生长， 空白对照组给予生理盐水(l〇〇mg/kg)灌胃治疗，其他各组药物灌胃治疗，持续8周。
[0036] 1.5组织取材
[0037] 分别在给药后1、2、4、8周，每组随机选取小鼠各5只，行眼眶采血，每只1~2mL。用 于ELISA检测：每组取2个血样，加入EDTA抗凝，3000r/min离心30min取上清，于一 20 °C保存 备用。用于流式细胞术检测:每组取3个血样，分离血清，于-70°C保存备用。所有动物取血后 立即处死，取其脱毛区域皮肤组织。经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，石蜡切片，切片厚 4~5ym，-80°C下保存备用。
[0038] 1.6ELISA检测外周血CD4+、CD8+表达水平
[0039]样本室温下平衡20min。设置标准品孔、样本孔和空白孔。空白孔什么都不加，标准 品孔各加不同浓度的标准品50此。待测样本先加样本稀释液40yL，再加待测样本10yL，随后 标准品孔和样本孔(空白孔不加)加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体l〇〇yL，用封板膜封 住反应孔，37 °C恒温箱孵育60min。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加洗涤液，静置lmin，甩去 洗涤液，吸水纸上拍干，重复5次。所有孔加入底物A、B各50yL，37°C避光孵育15min。加终止 液50yL，15min内，在450nm波长处测定各孔0D值。统计CD4和CD8的0D值，将CD4/CD8均值作为 结果进行统计分析。
[0040] 1.7统计学方法
[0041] 结果以均数土标准差U±s)表示。采用SPSS17.0统计软件分析数据，组间比较应 用单因素方差分析。
[0042] 2、实验结果
[0043] 2.1体质量变化和毛发生长情况
[0044] 小鼠经CTX诱导脱毛至实验结束，各组小鼠体质量无明显差异(P>0.05)。脱毛小 鼠经加巴喷丁、化合物（I)、加巴喷丁与化合物（I)组合物给药后1~2周，各组小鼠脱毛区局 部皮肤由粉色逐渐转变成灰黑色，小鼠脱毛区皮肤灰黑色区域明显比模型组和生理盐水组 要大;给药至4~8周，各组小鼠脱毛区呈黑色，且有毛发逐渐长出、伸长。给药组毛发相对于 模型组和生理盐水组，毛发更为致密。
[0045] 2.2对脱毛小鼠外周血⑶47⑶8+比值表达水平的影响
[0046] 加巴喷丁组、化合物（I)组、加巴喷丁组与化合物（I)组合物组外周血⑶4+/CD8+比 值随着时间的延长，呈下降趋势。1、2、3、4周，与模型对照组比，加巴喷丁组与化合物（I)组 合物组外周血⑶47⑶8+比值显著下降(P<0.01);与模型对照组比，加巴喷丁组、化合物（I) 组外周血CD4+/CD8+比值下降(P<0.05)。
[0047] 试验结果见表1。
[0048] 表1对脱毛小鼠外周血⑶47⑶8+比值表达水平的影响
[0050] 脱毛模型最常用实验动物为C57BL/6小鼠，由于其为有色种属，皮肤颜色随毛囊的 发育而表现不同的颜色，是研究毛囊发育和再生一种很好的实验动物。
[0051] 目前关于脱发的病理生理机制尚未明确，可能的原因主要与局部感染、神经毒物、 精神抑郁、内分泌因素等因素相关。近年来随着遗传、基因、分子水平的不断发展，国内外诸 多学者认为脱发主要是一种由T细胞免疫介导的自身免疫性炎症疾病，由于毛囊异常暴露 于潜在免疫活性的免疫系统，再通过毛囊的抗原物质激活强大的免疫系统，诱发释放大量 炎症，继而引起脱发。CD4+和CD8+T细胞在脱发患者毛囊内及周围的浸润是引起毛发脱落的 关键，CD8+T细胞一直被认为对毛囊发挥直接的细胞毒作用，而CD4+T细胞起辅助细胞作用， 在脱发的发病过程中两者是共同发挥作用的。
[0052]加巴喷丁、化合物（I )、加巴喷丁组与化合物（I)组合物维持治疗对脱毛小鼠具有 明显疗效，显著改善了小鼠脱毛区的毛发生长情况，通过下调外周血⑶4+/CD8+比值来发挥 作用，为临床脱发的药物治疗提供了新的治疗方案。其中，加巴喷丁和化合物（I)联合作用 时，对毛发生长的改善作用效果显著，优于加巴喷丁或化合物（I)单独的作用效果，可以开 发成防治脱发的药物。
[0053]上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 一种具有下述结构式的化合物α)，2. -种加巴喷丁的药物组合物，其特征在于:包括加巴喷丁、如权利要求1所述的化合 物(I)和药学上可以接受的载体，制备成需要的剂型。3. 根据权利要求2所述的加巴喷丁的药物组合物，其特征在于:药学上可以接受的载体 包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体 或润滑剂。4. 根据权利要求2所述的加巴喷丁的药物组合物，其特征在于:所述剂型包括片剂、胶 囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、 栓剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。5. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于，包含以下操作步骤：（a)将忍 冬藤粉碎，用75~85%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙 酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b) 步骤(a)中正丁醇取物用大孔树脂除杂，先用25%乙醇洗脱8个柱体积，再用70%乙醇洗脱 12个柱体积，收集70%洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中70%乙醇洗 脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1、45:1、25:1和15:1的二氯甲烷-甲醇梯度 洗脱得到4个组分；（d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、15:1 和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的 反相硅胶分离，用体积百分浓度为72 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集10~16个柱体积洗脱 液，洗脱液减压浓缩得到化合物(I)。6. 根据权利要求5所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:步骤(a)用80%乙醇热回 流提取，合并提取液。7. 根据权利要求5所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:所述大孔树脂为D101型 大孔吸附树脂。8. 根据权利要求5所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:步骤(a)中用二氯甲烷代 替乙酸乙酯进行萃取，得到二氯甲烷萃取物。9. 权利要求1所述的化合物（I)在制备治疗脱发的药物中的应用。10. 权利要求2~4任一所述的加巴喷丁的药物组合物在制备治疗脱发的药物中的应 用。
【文档编号】A61K31/195GK105949042SQ201610402169
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】王昌荣
【申请人】王昌荣