一种阿德福韦酯的药物组合物及其医药用图
【专利摘要】本发明公开了一种阿德福韦酯的药物组合物及其医药用途，本发明提供的阿德福韦酯的药物组合物中含有阿德福韦酯和一种从龙胆的干燥根及根茎中分离得到的结构新颖的天然产物化合物（Ⅰ），阿德福韦酯和该天然产物化合物（Ⅰ）单独作用时，对慢性粒细胞白血病的治疗效果较弱；二者联合作用时，对慢性粒细胞白血病的治疗效果显著提高，可以开发成治疗慢性粒细胞白血病的药物，与现有技术相比具有突出的实质性特点和显著的进步。
【专利说明】
一种阿德福韦酯的药物组合物及其医药用途
技术领域
[0001 ]本发明属于生物医药领域，涉及慢性粒细胞白血病的治疗，具体涉及一种阿德福 韦酯的药物组合物及其对慢性粒细胞白血病的治疗作用。
【背景技术】
[0002] 目前临床应用的阿德福韦酯是阿德福韦的前体，在体内水解为阿德福韦发挥抗病 毒作用。阿德福韦酯是5单磷酸脱氧阿糖腺苷的无环类似物。
[0003] 随机双盲安慰剂对照的临床试验表明，在HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者，口服阿德 福韦酯可明显抑制HBV DNA复制，应用1、2、3年时的HBV DNA转阴率(〈1000拷贝/ml)分别 为28%、45%和56%，HBeAg血清学转换率分别为12%、29%和43%;其耐药发生率分别为0%、1.6% 和3.1%;治疗HBeAg阴性者1、2、3年的耐药发生率分别为0%、3.0%和5.9%~11%。本药对拉米 夫定耐药变异的代偿期和失代偿期肝硬化患者均有效。在较大剂量时有一定肾毒性，主要 表现为血清肌酐的升高和血磷的下降，但每日10 mg剂量对肾功能影响较小，每日10 mg， 治疗48~96周，约有2%~3%患者血清肌酐较基线值上升>0.5mg /dl (44.2 ymol/L)。因此， 对应用阿德福韦酯治疗者，应定期监测血清肌酐和血磷。
[0004] 阿德福韦酯已获中国SFDA批准用于治疗慢性乙型肝炎，其适应证为肝功能代偿 的成年慢性乙型肝炎患者。本药尤其适合于需长期用药或已发生拉米夫定耐药者。
[0005] 慢性粒细胞白血病是一种影响血液及骨髓的恶性肿瘤，它的特点是产生大量不成 熟的白细胞，这些白细胞在骨髓内聚集，抑制骨髓的正常造血;并且能够通过血液在全身扩 散，导致病人出现贫血、容易出血、感染及器官浸润等。慢性粒细胞白血病进展缓慢，根据骨 髓中白血病细胞的数量和症状的严重程度，分为三个期:慢性期、加速期和急变期。其中，大 约有90%病人诊断时为慢性期，每年约3%至4%慢性期进展为急变期。
[0006] 迄今为止，尚未见阿德福韦酯的药物组合物与慢性粒细胞白血病的相关性报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种阿德福韦酯的药物组合物，该药物组合物中含有阿德 福韦酯和一种从龙胆的干燥根及根茎中分离得到的结构新颖的天然产物，阿德福韦酯和该 天然产物可以协同治疗慢性粒细胞白血病。
[0008] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的： 一种具有下述结构式的化合物（I)，
[0009] -种阿德福韦酯的药物组合物，包括阿德福韦酯、如上所述的化合物（I)和药学上 可以接受的载体。
[0010]如上所述的化合物（I)的制备方法，包含以下操作步骤：（a)将龙胆的干燥根及根 茎粉碎，用70~80%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和 水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤 (a )中正丁醇取物用大孔树脂除杂，先用6%乙醇洗脱8个柱体积，再用70%乙醇洗脱8个柱体 积，收集70%洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中70%乙醇洗脱浓缩物用 正相硅胶分离，依次用体积比为50:1、25:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个 组分；（d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为10:1、5:1和2:1的二氯 甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分 离，用体积百分浓度为75%的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~14个柱体积洗脱液，洗脱液减压 浓缩得到化合物(I)。
[0011] 进一步地，步骤(a)中，用75%乙醇热回流提取，合并提取液。
[0012] 进一步地，所述大孔树脂为D101型大孔吸附树脂。
[0013] 如上所述的化合物(I)在制备治疗慢性粒细胞白血病的药物中的应用。
[0014] 如上所述的阿德福韦酯的药物组合物在制备治疗慢性粒细胞白血病的药物中的 应用。
[0015] 本发明的优点： 本发明提供的阿德福韦酯的药物组合物中含有阿德福韦酯和一种从龙胆的干燥根及 根茎中分离得到的结构新颖的天然产物，阿德福韦酯和该天然产物单独作用时，对慢性粒 细胞白血病的治疗效果较弱;二者联合作用时，对慢性粒细胞白血病的治疗效果显著提高， 可以开发成治疗慢性粒细胞白血病的药物。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0017] 实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证 试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试 剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0018] 分离方法：（a)将龙胆的干燥根及根茎(5kg)粉碎，用75%乙醇热回流提取(20LX 3 次），合并提取液，浓缩至无醇味(4L)，依次用石油醚(4L X 3次）、乙酸乙酯(4L X 3次)和水饱 和的正丁醇(4LX3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b) 步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用D101型大孔树脂除杂，先用6%乙醇洗脱8个柱体积，再用70%乙 醇洗脱8个柱体积，收集70%洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中70%乙醇 洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为50:1(8个柱体积）、25:1(8个柱体积）、15:1(8 个柱体积)和5:1(10个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；（d)步骤(c)中组分 4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为10:1 (8个柱体积）、5:1( 10个柱体积)和2:1 (5个 柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合 的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75%的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~14个柱体积洗脱 液，洗脱液减压浓缩得到化合物（I) (308mg，HPLC归一化纯度大于98%)。
[0019] 结构确证：白色无定形粉末，册43頂3显示[1+似]+为111/2 271.1314，结合核磁特 征可得分子式为〇15112()〇3，不饱和度为6。核磁共振氢谱数据511(。。111，00(]13,50〇]\〇2):!1-1 (3.50,s),H-3(5.89,br,s),H-5(2.84,br,d,/=12.6Hz),H-6a(2.13,m),H-6b(1.38,m),H-7 (2.60，br，tJ=12.2Hz)，H-8(l .60，m)，H-8(1.78，m)，H-9(1.34，m)，H-9(2.12，m)，H-12 (9.84，s)，H-13a(6.62，br，s)，H-13b(6.41，br，s)，H-14(0.91，s)，H-15(1.95，s);核磁共振 碳谱数据 Sc(ppm，CDCl3，125MHz):78.6(CHd-C)，198.7(C，2-C)，124.3(CH，3-C)，165.8(C， 4-C)，42.2(CH，5-C)，28.8(CH2,6-C)，37.1(CH，7-C)，26.5(CH2,8-C)，33.3(CH2,9-C)，40.5 (C，10-C)154.8(C，n-C)，194.3(CH，12-C)，133.1(CH2，13-C)，16.2(CH 3，14-C)，22.7(CH3， 15-C)。红外波谱表明该化合物含有羰基（16720^ 1)和烯烃键（16300^1) ^C-NMKDEPT和 HSQC谱中显示有15个碳信号，包括两个甲基<?16.2,22.7;四个亚甲基(一个烯烃碳）般8.8， 26.5，33.3,133.1;五个次甲基（一个连羟基碳，一个烯烃碳，一个醛基碳）<?78.6,124.3， 42.2,37.1，194.3 ;以及四个季碳(一个羰基碳，一个烯烃碳）<?198.7，165.8,40.5，154.8; 以上功能结构再结合不饱和数表明该化合物为两环结构。核磁数据表明该化合物含有一个 〇，0-不饱和羰基结构[<85.89(1^，8，!1-3) ;(?198.7((：，(：-2)，124.3(01，(：-3)，165.8((：，(：-4)]，一个醛基[a.84(lH，s，H-l 2); ?94.3(CH，C-12)]，一个烯属亚甲基[?.62(br，s，H-13&)和6.41(1^，8，!1-1313) ;(?133.1(012，(：-13)]，两个甲基[(?).91(3!1，8，!1-14)与1.95(3!1， 8，!1-15) ;(?16.2(013，(：-14)，22.7(013，(：-15)]。据1!1-1!10)5￥谱中!12-6/!1-7/!12-8/!12-9相关 信号，结合HMBC谱中H-1 与C-2、C-3和C-10，H-3与C-l、C-2、C-4和C-5，H-7与C-11，H-12与C-11，H2-13与C-11，H 3-14与C-l、C-5和C-9，H3-15与C-4和C-5相关信号，可以构建该化合物的 连接方式。H-5与H 2-6的偶合常数Jh-5=12.6Hz以及H2-6与H-7的偶合常数Jh-7=12.2Hz说明H-5 与H-7在该化合物椅式构象中皆为直立键。此外，进一步通过分析N0ESY谱中H-5与H-14不存 在相关信号，可以确证H 3-14为β构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和N0ESY谱，以及文献关于相 关类型核磁数据，可基本确定该化合物如下所示，立体构型进一步通过ΕΟ)试验确定，理论 值与实验值基本一致。
[0020]
[0021] 实施例2:对慢性粒细胞白血病的治疗作用 一、材料和仪器 K562细胞由中科院上海生物细胞所提供。化合物（I)为自制，HPLC归一化纯度大于98%。 RPMI-1640干粉培养基购于Gibco公司。小牛血清购于杭州四季青生物工程材料研究所。青 霉素、链霉素购于华北制药厂。Glutamine、MTT、DMSO购于AMRESOLAnnexinv-FITC细胞凋亡 检测试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司。M0PS，Rnasin、琼脂糖、嗅乙锭、溴酚兰华 美生物工程公司华美生物工程公司。
[0022] C02孵箱（美国Thermo公司），超净工作台（苏州净化设备厂），磁力搅拌器(上海南 汇电讯器材厂），倒置显微镜（日本OLYMPUS公司），水平式离心机(上海安亭科学仪器厂），电 子分析天平(德国Sartorius公司），自动酶标仪(德国Humareader公司），U_3010型紫外分光 光度计（日本HITACHI公司），流式细胞仪（美国BECKMAN公司），Eppendorf Centrifuge 5417R离心机(德国Eppendorf公司）。
[0023] 二、试验方法 1、Κ562细胞的培养 将新购买的细胞株的培养瓶表面用75%酒精擦拭3遍。将细胞悬液吸入离心管，lOOOrpm 离心10min。弃去上清，滴加含10%NBS的RPMI-1640完全培养基，轻轻吹打制备成细胞悬液。 接种于培养瓶中，置于37°C，5%C0 2培养箱中培养，每天换液传代。
[0024] 2、实验分组 正常对照组：10%NBS的RPMI-1640; 阿德福韦酯组：10%NBS的RPMI-1640+终浓度200mg/L的阿德福韦酯； 化合物（I)组：10%NBS的即RPMI-1640+终浓度200mg/L化合物（I); 阿德福韦酯与化合物（I)组合物组：10%NBS的RPMI-1640+终浓度100mg/L的阿德福韦酯 +终浓度1 〇〇mg/L化合物（I)。
[0025] 3、MTT法检测对K562细胞增殖的影响 取生长状态良好的细胞，用含10%NBS的RPMI-1640培养液将细胞配制成细胞悬液，以5 X103细胞/孔接种于无菌96孔培养板中。（2)依实验分组，每组加入不同浓度的药物50yL， 设无细胞孔为空白对照组，每组设8个复孔，将96孔培养板放入C0 2培养箱中培养;（3)24、48 和72h后取出96孔培养板，每孔加入20yL MTT( 5mg/mL)，放入C02培养箱中孵育4h，即有紫蓝 色结晶物生成，在一定细胞数范围内，结晶物的生成量与细胞数成正比。（4)每孔加入酸化 的SDS 100yL放入C〇2培养箱中过夜。（5 )用酶标仪测定0D，比色时以空白孔调零。
[0026] 4、统计学处理 实验组和对照组均重复三次操作，结果用（x±s表示，P〈0.05示有显著性差异。组间比 较采用单因素方差分析。所有数据用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析。
[0027]三、结果及结论 MTT法检测对K562细胞的增殖抑制作用 化合物（I)作用K562细胞24h、48h、72h后，用酶标仪检测0D49Q显示：与正常对照组比，作 用24h后阿德福韦酯组和化合物（I)组对细胞K562细胞抑制作用不明显(P>0.05，P>0.05)， 阿德福韦酯与化合物（I)组合物组对K562细胞有抑制作用(P〈0.05);与正常对照组比，作用 48h和72h后，阿德福韦酯组和化合物（I)组对细胞K562细胞有抑制作用(P〈0.05，P〈0.05)， 阿德福韦酯与化合物（I)组合物组可显著抑制K562细胞(P〈0.01)。
[0028] 表1各组作用K562细胞后的MTT值(X 土 s，n=8)
结论:阿德福韦酯与化合物（I)组合物可显著抑制K562细胞的增殖，抑制作用强于阿德 福韦酯或化合物（I)单独作用于K562细胞。阿德福韦酯与化合物（I)之间存在协同作用。 [0029]上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 一种具有下述结构式的化合物（I)，2. -种阿德福韦醋的药物组合物，其特征在于:包括阿德福韦醋、如权利要求1所述的 化合物(I)和药学上可W接受的载体。3. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于，包含W下操作步骤：（a)将龙 胆的干燥根及根茎粉碎，用70~80%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石 油酸、乙酸乙醋和水饱和的正下醇萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇 萃取物；（b)步骤(a)中正下醇取物用大孔树脂除杂，先用6%乙醇洗脱8个柱体积，再用70%乙 醇洗脱8个柱体积，收集70%洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物；（C)步骤(b)中70%乙醇 洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为50:1、25:1、15:1和5:1的二氯甲烧-甲醇梯度 洗脱得到4个组分；（d)步骤(C)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为10:1、5:1 和2:1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的 反相硅胶分离，用体积百分浓度为75%的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~14个柱体积洗脱液， 洗脱液减压浓缩得到化合物(I)。4. 根据权利要求3所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:步骤(a)中，用75%乙醇热 回流提取，合并提取液。5. 根据权利要求3所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:所述大孔树脂为DlOl型 大孔吸附树脂。6. 权利要求1所述的化合物（I)在制备治疗慢性粒细胞白血病的药物中的应用。7. 权利要求2所述的阿德福韦醋的药物组合物在制备治疗慢性粒细胞白血病的药物中 的应用。
【文档编号】A61P35/02GK105906498SQ201610321230
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月16日
【发明人】徐珍
【申请人】苏州毕诺佳医药技术有限公司